This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.
Nyligen iPSCs har uppmärksammats som en ny källa till celler för regenerativa terapier. Även om den initiala metoden för att generera iPSCs förlitat sig på hudfibroblaster erhållits genom invasiv biopsi och retroviral genomisk insättning av transgener, har det funnits många ansträngningar för att undvika dessa nackdelar. Humana perifera T-celler är en unik cellkälla för alstring iPSCs. iPSCs härledda från T-celler innehåller omlagringar av T-cellreceptorn (TCR) -gener och är en källa av antigenspecifika T-celler. Dessutom, T-cellsreceptor ombildning i genomet har potential att märka enskilda cellinjer och skilja mellan transplanterade och givarceller. För säker klinisk tillämpning av iPSCs, är det viktigt att minimera risken för exponering av nyligen genererade iPSCs för skadliga ämnen. Även fetalt bovint serum och matarceller har varit väsentligt för pluripotenta stamcellkultur, är det föredraget att avlägsna dem från odlingssystemet för att minska riskenoförutsägbara patogenicitet. För att lösa detta har vi etablerat ett protokoll för att generera iPSCs från humana perifera T-celler med hjälp av Sendai-virus för att minska risken att utsätta iPSCs till odefinierade patogener. Även hantering Sendai-virus kräver utrustning med lämplig skyddsnivå, Sendai virus infekterar aktiverade T-celler utan genomet inser, men med hög effektivitet. I detta protokoll visar vi alstringen av iPSCs från humana perifera T-celler i matarfria betingelser med användning av en kombination av aktiverade T-cellkultur och Sendai-virus.
iPSCs har rönt stor uppmärksamhet som en banbrytande källa av celler för regenerativ medicin 1-3. Hittills har olika metoder för att generera iPSCs rapporterats 4,5. Bland dessa, har iPSCs alstras från humana T-celler varit av särskilt intresse på grund av den mindre invasiv metod för cellprovtagnings 6-8. Dessutom iPSCs härlett från T-celler innehåller omlagringar av T-cellreceptorn (TCR) -genen och är sålunda en källa för antigenspecifika T-celler 9,10. Därför genererar T-cells härrör iPSCs är säkert användbar för att utvecklas regenerativ medicin.
Denna metod är baserad på konceptet att minska risken för oförutsägbara patogenicitet. För säker klinisk tillämpning av iPSCs är det viktigt att minska risken för exponering för patogener 11. Tidigare i många odlingssystem av pluripotenta stamceller, har fetalt bovint serum och matarceller använts som väsentliga reagenss 12. Dock är avlägsnandet av båda dessa reagenser från odlingssystemet föredra för iPSC generationen för att minska risken för oförutsägbara patogenicitet.
Dessutom har denna metod fördelen att undvika invasiv cell provtagning från patienter och mödosam framställning av matarceller. Eftersom T-cell härledda iPSCs har redan använts med framgång i sjukdomsforskning 13,14, är metoden också tillämplig och användbar för att generera sjukdomsspecifika iPSCs från patienter.
Bland T-cell omprogrammering metoder, med hjälp av Sendai-virus (SeV) vektorn som en gen fordon är en metod som kan generera iPSCs med hög effektivitet 7,16. Dessutom, eftersom SeV är ett enkelsträngat RNA-virus och inte behöver en DNA fas för replikation, dess användning i iPSC generationen undviker bryta värdgenomet 17-19. Därför har vi etablerat protokoll för alstring iPSCs från humana perifera T-celler i serum FREE och matarfria förhållanden med hjälp av en kombination av matrigel, mTeSR medium och SEV vektorer.
We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors16. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.
SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine16.
Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus6. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.
The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.
There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi och Rei Ohno från Keio University School of Medicine för tekniskt stöd. Detta arbete har delvis finansierats av en R & D Systems stödprogram för att påskynda den praktiska användningen av hälsoforskningsresultaten, och Highway Program för förverkligandet av regenerativ medicin.
Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
KBM502 medium | KOHJIN BIO | 16025020 | Warm in 37 ℃ water bath before use |
Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | Thaw completely at 4℃ overnight and dilute it 50 times with Dulbecco's Modified Eagle's Medium before coating culture dishes |
mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
15ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
50ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |