Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

doi: 10.3791/53245 Published: July 4, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

β-barile OMP si possono trovare solo nelle membrane esterne di mitocondri, cloroplasti, e batteri Gram-negativi 1-3. Mentre servono ruoli simili come proteine ​​alfa-elica, hanno una piega molto diversa costituito da un dominio β-barrel membrana incorporato centrale vanno da 8-26 anti-paralleli beta trefoli con ciascun trefolo essendo intimamente collegato ai due fili adiacenti (figure 1 e 2). Il primo e l'ultimo fili di dominio β-barile poi interagiscono tra loro, quasi esclusivamente in modo antiparallelo (eccetto VDAC mitocondriale), per chiudere e sigillare il dominio β-barile dalla membrana circostante. Tutti OMP β-barile hanno loop extracellulari di diversa sequenza e lunghezza che svolgono un ruolo importante nelle interazioni ligando e / o contatti proteina-proteina, con questi loop talvolta essere grande come 75 residui, come trovato in Neisserial transferrina vincolante proTEIN A (TBPA) 4. β-barile OMP possono avere anche le estensioni periplasmatiche N-terminale o C-terminale che servono domini come ulteriori per scopo funzionale della proteina (ad esempio, Bama 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Mentre esistono molti tipi di OMP β-botte 11, due dei tipi più comuni sono descritti di seguito come esempi per quelli meno familiarità con il campo, (1) trasportatori TonB-dipendente e (2) automezzi.

Trasportatori TonB-dipendenti (ad esempio, FEPA, TBPA, BTub, Cir, etc.) sono essenziali per l'importazione di nutrienti e contengono un dominio spina N-terminale costituito da ~ 150 residui che si trova nascosto all'interno di un C-terminale di 22-bloccati β- dominio barilotto incorporato nella membrana esterna 12 (figura 3). Anche se questo dominio spina impedisce supporto a partire da liberamente passando per il dominio barile, legame del substrato induce un cambiamento conformazionale all'interno del dominio spina °in porta a poro formazione (sia per spina riarrangiamento o parziale / totale espulsione del tappo), che possono poi facilitare il trasporto del substrato attraverso la membrana esterna in periplasma. Trasportatori TonB-dipendenti sono particolarmente importanti per la sopravvivenza di alcuni ceppi patogeni di batteri Gram-negativi, come Neisseria meningitidis che si sono evoluti trasportatori specializzati che si impadroniscono nutrienti come il ferro direttamente da proteine ​​ospite umani 4,13,14.

Automezzi appartengono al tipo di sistema di secrezione V di batteri Gram-negativi e sono OMP beta-barile che consistono di un dominio β-barile (tipicamente 12-fili, come con ESTA e ESPP) e un dominio del passeggero che è o secreti o presentati al superficie della cellula 15,16 (figura 3). Questi OMP β-barile servono spesso ruoli importanti nella sopravvivenza cellulare e virulenza con il dominio passeggero che serve sia come proteasi, adhesin, e / o altri effector che media patogenesi.

metodi strutturali come la cristallografia a raggi X, la spettroscopia NMR, e la microscopia elettronica (EM) ci permettono di determinare modelli per le OMP a risoluzione atomica, che può a sua volta essere utilizzati per decifrare esattamente come funzionano all'interno della membrana esterna. Queste informazioni preziose può quindi essere utilizzato per lo sviluppo di farmaci e vaccini, se applicabile. Per esempio, il legame transferrina proteina A (TBPA) si trova sulla superficie del Neisseria ed è necessario per la patogenesi perché si lega direttamente transferrina umana e poi estrae ed importa il ferro per la propria sopravvivenza. Senza TBPA, Neisseria non può pulire il ferro da ospite umano e sono resi non patogeni. Dopo che la struttura cristallina della transferrina umana legato al TBPA 4 è stato risolto, è diventato molto più chiaro come le due proteine ​​associate, quali regioni della TBPA mediata interazione, ciò residui erano importanti per l'estrazione ferro TBPA, ecome si potrebbe sviluppare terapie contro Neisseria di targeting TBPA. Pertanto, data l'importanza di OMP β-barile nei batteri Gram-negativi per la sopravvivenza e la patogenesi, nonché nei mitocondri e funzione cloroplasti, e la necessità di informazioni strutturali aggiuntive su questa classe unica di proteine ​​di membrana e sistemi in cui funzionano , protocolli generali vengono presentati con l'obiettivo generale di esprimere e purificare OMP bersaglio ad alti livelli per la caratterizzazione con metodi strutturali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Clonazione ed espressione

Nota: Per abilitare studi strutturali, quantità sufficienti di proteina altamente purificata devono essere preparati, e questo in genere inizia con la clonazione e la sovraespressione della proteina della membrana esterna di destinazione β-barile (OMP) in E. coli (Figura 4). Fino ad oggi, tutte le strutture OMP β-botte, tra cui quelle strutture per VDAC mitocondriale, sono stati derivati ​​da batteri espresso proteina 11. Qui, i protocolli generali sono presentati per clonaggio e l'espressione OMP β-barile per (1) espressione nativo direttamente nelle membrane batteriche e (2) l'espressione in corpi inclusioni in vitro ripiegamento 17.

  1. La progettazione di una costruzione Expression
    1. Ottenere o acquistare il gene bersaglio OMP codone ottimizzato.
    2. Acquisto o ottenere un vettore di espressione T7 (i) contenente una sequenza segnale di localizzazione periplasmic, un tag 6x-istidina N-terminale,e un sito proteasi TEV 4,18,19 per l'espressione in vivo alla membrana o (ii) senza una sequenza segnale di localizzazione periplasmic per l'espressione di corpi di inclusione per ripiegamento in vitro.
      Nota: Un proteasi N-terminale cleavable tag 6x o 10x-istidina fornirebbe un metodo facile per la purificazione. Come con proteine ​​solubili, variare la scelta dei tag di affinità (istidina, Strep, GST, ecc), la posizione del tag di affinità, e l'inclusione di un sito proteasi (TEV, enterokinase, trombina, etc.) per la successiva rimozione tag .
    3. PCR amplificare la sequenza bersaglio con primer e subclone appropriata nel vettore di espressione. Utilizzare legatura clonazione indipendente (LIC) 20,21 o convenzionali tecniche di clonazione (enzimi di restrizione / legatura) per subcloning. Tuttavia, LIC può facilitare throughput elevato, consentendo un vasto numero di vari costrutti (troncamenti, varietà di etichette, varietà di promotori) da clonare in parallelo piùfacilmente.
  2. In Expression Vivo a membrana mirati
    1. Utilizzare l'analisi di sequenziamento per verificare la destinazione β-barile OMP viene clonato a valle e nel telaio con una sequenza di segnali (cioè, pelB, OmpA) nel costrutto di espressione.
      Nota: La sequenza di segnali dirige la catena nascente al translocon Sec per la secrezione nel periplasma e successivo montaggio nella membrana esterna.
    2. Trasformare il costrutto in un ceppo di batteri espressione di espressione pipettando 1,0 ml di plasmide in 50 ml di BL21 (DE3) cellule chimicamente competenti e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare in ghiaccio per 30 min.
    3. impulso di calore a 42 ° C per 30 sec con un bagno di acqua e poi rimetterlo in ghiaccio per 1 min.
    4. Aggiungere 1 ml di supporti pre-riscaldato SOC e agitare a 37 ° C per 1 ora a 1.000 giri al minuto con un incubatore da banco shaker.
    5. Piatto 100 ml di cellule su piastre di agar LB contenente un adeguato antibiotic e incubare una notte a 37 ° C invertita.
    6. Eseguire test di espressione su piccola scala inoculando un + cultura antibiotico 5 ml LB con una singola colonia. Ripetere per 5-10 colonie.
      Nota: A causa della potenziale tossicità di un OMP β-botte e la dipendenza da livelli di espressione basali, la variabilità colonia-to-colonia è talvolta osservato. Pertanto, lo screening più colonie è raccomandato per ciascun costrutto in prova. Per i test su piccola scala di espressione, piuttosto che convenzionali 5 ml culture, in crescita di 25 ml culture in 125 ml sconcertato beute è suggerito. Queste condizioni spesso meglio riflettono ciò che accadrà in una crescita su grande scala. Inoltre, è una buona idea per schermare anche vari tipi di mezzi di coltura (TB, LB, 2xYT, M9, ecc), poiché vari livelli di successo sono stati riportati seconda proteina bersaglio.
      1. Crescere a 37 ° C con agitazione ad una OD 600 di ~ 0.6.
      2. Indurre l'espressione della OMP bersaglio dall'inserzionistading 5 ml di 1 M isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a ciascuna provetta cultura e permettono di far crescere un ulteriore 1-2 ore.
      3. Confronto livelli di espressione per tutte le colonie per centrifugazione 1 ml di ciascuna coltura (OD 600 di ~ 0,6) per 1 min a 15.000 xg usando una microcentrifuga.
      4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di tampone di caricamento 1x SDS-PAGE. Termico a 100 ° C per 5 minuti, quindi si centrifuga di nuovo a 15.000 xg per 5 min.
      5. Analizzare i campioni utilizzando SDS-PAGE pipettando 20 microlitri in ciascun pozzetto di un gel 10%. Eseguire il gel per 35 min a 200 V. costante
        Nota: Sarebbe utile a questo punto essere in grado di determinare se la proteina target venga correttamente ripiegata o meno. Questo spesso può essere realizzato facendo purificazioni su piccola scala o analizzando per modificabilità del calore.
    7. Selezionare la colonia che mostra la migliore espressione ed eseguire espressione su larga scala utilizzando 12-24 L del mezzo.
      Nota: I metodi convenzionali di solito si sviluppano le culture a 37 ° C con agitazione ad una OD 600 di ~ 0.6 e quindi inducono con un induttore appropriata (ad esempio, 0,1-1 mm per IPTG o ~ 0,2% per arabinosio) per un ulteriore 2-4 ore . Se lo si desidera, prima della induzione, ridurre la temperatura a partire da 20 ° C e prolungare il tempo di induzione.
      1. Per il metodo di espressione che perde, crescono a 25 ml inoculare cultura a 37 ° C in terreno LB contenente l'antibiotico appropriato (s) fino OD 600 raggiunge ~ 0,6. Quindi, aggiungere 1 ml di inoculare a dodici 1 L fiaschi di media TB più antibiotici (s) e crescere a 20 ° C a saturazione (~ 3 giorni).
    8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min.
    9. Procedere alla fase di purificazione Sezione 2.1 o congelare il pellet cellulare in azoto liquido per la conservazione a lungo termine a -80 ° C.
  3. Espressione di corpi di inclusione in vitro Refolding
    1. Utilizzare analisi di sequenziamento per verificare il costrutto di espressione non contiene una sequenza segnale. L'assenza di una sequenza segnale dirigere la proteina bersaglio ad accumularsi nel citosol come corpi di inclusione.
    2. Trasformare il costrutto di espressione in un ceppo di batteri espressione di espressione. Per espressione corpi inclusi, è meglio controllare l'espressione per induzione (vale a dire, IPTG, arabinosio, etc.) per ridurre al minimo i possibili effetti di tossicità.
    3. Piastra 100 ml di cellule trasformate su piastre di agar LB contenenti un antibiotico appropriato e incubare una notte a 37 ° C invertita.
    4. Eseguire test di espressione su piccola scala inoculando un + cultura antibiotico 5 ml LB con una singola colonia.
    5. 1.3.4 passo Ripetere per 2-4 colonie supplementari.
    6. Crescere a 37 ° C con agitazione ad una OD 600 di ~ 0.6.
    7. Indurre con un induttore appropriato per 1-2 ore.
    8. Confronta i livelli di espressione per ogni tegli colonie attraverso l'analisi utilizzando SDS-PAGE (vedere il punto 1.2.6). Selezionare la colonia che mostra la migliore espressione ed eseguire espressione su larga scala utilizzando 12-24 L di mezzo.
      1. Crescere le cellule a 37 ° C ad una OD 600 di 0,6-0,8 e indurre a 37 ° C per 3-5 ore. Mentre l'espressione di corpi di inclusione è più robusto rispetto ad altri tipi di espressione, come per tutti gli esperimenti di espressione proteica, espressione può essere migliorata variando mezzo di crescita, il tempo di induzione, la temperatura di induzione, e la concentrazione dell'agente indurre.
    9. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min.
    10. Procedere alla fase di purificazione sezione 2.2 o congelare il pellet cellulare in azoto liquido per la conservazione a lungo termine a -80 ° C.

2. Purificazione

  1. Isolamento da membrana Frazioni
    Nota: A differenza di proteine ​​solubili, proteine ​​di membrana integrali sono incorporati nel doppio strato lipidico e quindirichiedono detergenti per estrarre loro per ulteriore purificazione ed analisi (Figura 5). Dopo l'espressione, il primo passo nella purificazione di un OMP β-barilotto è estrazione della frazione di membrana.
    1. Risospendere le cellule in Lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNasi I) in un rapporto di pasta cellulare 5 ml / g.
    2. Lyse le cellule utilizzando una pressa francese o omogeneizzatore cellulare. Spin le cellule lisate a 15.000 xg per 30 min a 4 ° C per rimuovere le cellule non lisate e detriti cellulari.
    3. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e centrifugare di nuovo ad alta velocità (200.000 xg) per 1 ora a 4 ° C. Il pellet risultante è la frazione di membrana che contiene la proteina di interesse.
    4. Utilizzando un omogeneizzatore Dounce, risospendere la frazione di membrana, prima di trasferire le membrane e poi l'aggiunta di buffer di solubilizzazione (50 mm KH 2 PO 4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazolo, PH 8,0) (50 ml per 20 celle g) a concentrazione 2x, senza detergente.
    5. Versare le membrane risospese in un piccolo becher e aggiungere il detersivo (cioè, n-dodecil-β-D-maltoside (DDM), lauryldimethylamine-N-ossido (LDAO), n-ottil-β-D-glucopiranoside (OG), Triton X-100, etc.) lentamente ad una concentrazione finale di ~ 10x concentrazione micellare critica (CMC).
    6. Riempire con acqua fino a una concentrazione finale di 1x tampone di solubilizzazione. Mescolare per 0,5-16 ore a 4 ° C, a seconda di quanto facilmente la proteina bersaglio viene estratta dalle membrane.
      Nota: detersivo viene utilizzato per solubilizzare lentamente le membrane per estrarre la proteina bersaglio. Ci sono 3 tipi di detergenti che possono essere utilizzati qui: ionico (SDS, acido deoxycholic), non ionici (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), e zwitterionici (LDAO, CHAPS). Un complesso proteina-detergente che è stabile e monodisperse durante la fase di purificazione sarà di grande aiuto per il successo di crystallizat proteina di membranaionico. Ulteriori informazioni su detergenti, le loro proprietà, informazioni CMC, e il loro uso nella purificazione di proteine ​​di membrana e altre applicazioni possono essere trovate sui siti fornitori commerciali.
    7. Centrifugare il campione solubilizzato a 300.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Il surnatante ora contiene la destinazione β-barile OMP detergente-solubilizzato.
    8. Procedere con Sezione 2.3 come indicato di seguito.
  2. Ripiegamento da corpi di inclusione
    Nota: Per ripiegamento in vitro, l'obiettivo β-barile OMP è espressa direttamente in corpi di inclusione. Un vantaggio è che queste proteine ​​possono essere prodotti a livelli elevati. Tuttavia lo svantaggio è che refolding è spesso inefficiente e varia da un esperimento ripiegatura a quella successiva. Eppure, ci sono molti esempi di proteine ​​che sono state ripiegate con successo per studi strutturali. A seguito di espressione in corpi di inclusione, si deve ora isolare i corpi di inclusione per ripiegamento esperimentoS.
    1. Risospendere le cellule in Lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 50 ug / AEBSF ml, 5 mg / ml DNasi I, 4 mM 2-mercaptoetanolo (BME)) (5 ml per pasta di cellule g). Lyse utilizzando una pressa, sonicazione, o omogeneizzatore cellule francese.
    2. Pellet corpi di inclusione di una rotazione a bassa velocità a 6.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    3. Lavare i corpi di inclusione dalla risospensione in 25 ml di 1,0 M di urea usando un omogeneizzatore Dounce. Pellet di nuovo da una centrifuga a bassa velocità a 6.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    4. Ripetere il punto 2.2.3, se necessario.
    5. Risospendere le corpi di inclusione lavati ad una concentrazione finale di 10 mg / ml utilizzando tampone contenente 8,0 M di urea (o 6,0 M guanidina cloridrato (GdCl)) più detergente (cioè, DDM o LDAO) a 2x CMC o superiore.
      Nota: Se lo si desidera, per target di proteine ​​di membrana che contengono un tag istidina, immobilizzato in metallo-cromatografia di affinità (IMAC) di purificazione può essere eseguita utilizzando denaturazione colli operativi (in 8.0 M urea o 6.0 M GdCl) come un primo passo simile a quello descritto di seguito nella sezione 2.3.
    6. Eseguire la reazione refolding lentamente (durante la notte) rimuovendo il denaturante per dialisi in tampone privo del denaturante.
      Nota: Si può richiedere diverse modifiche del buffer di dialisi per raggiungere questo obiettivo. In alternativa, se i corpi di inclusione vengono prima tenuti ad una colonna IMAC, si può fare la reazione refolding mentre ancora legato alla colonna scambiando lentamente buffer per rimuovere il denaturante. In entrambi i casi, ricordate che questa è una proteina di membrana, di conseguenza, detersivo deve essere presente per stabilizzare il bersaglio. Inoltre, se il detersivo utilizzato sia dializzabile, deve essere aggiunto al tampone di dialisi (s) pure.
    7. Spin i campioni ripiegate a 200.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Il surnatante contiene il ripiegata bersaglio β-barile OMP detergente-solubilizzato.
    8. Procedere con Sezione 2.3 come indicato di seguito.
  3. Purificazione ImpiegoMAC, a scambio ionico, e gel filtrazione
    Nota: Supponendo che la proteina è stato progettato con un tag istidina, sia nativo esprime o ripiegata usando metodi in vitro, poi immobilizzato cromatografia metallo affinità (IMAC) viene eseguita per la purificazione molto simile per Istidina etichettato proteine ​​solubili, tranne detersivo deve essere tenuto in tutti i tamponi successivi per mantenere la porta OMP β-barile solubilizzati e stabile.
    1. Preparare una colonna 1-5 ml IMAC o utilizzare una colonna preconfezionato. Eseguire successive fasi di cromatografia a 4 ° C. Sciacquare con acqua per rimuovere eventuali tracce di conservanti. Se si utilizza un sistema di depurazione automatizzato, installare la colonna secondo le istruzioni del produttore.
    2. Preparare 500 ml di IMAC tampone A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) e 250 ml di IMAC tampone B (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM, e 1,0 M imidazolo).
      Nota: Altri detergenti che possono essere utilizzati iNCLUDE Cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%), e LDAO (0,05%).
    3. Equilibrare la colonna IMAC con 10 volumi di colonna di IMAC tampone A.
    4. Aggiungere imidazolo al campione ad una concentrazione finale di 25 mM e mescolare. Caricare il campione attraverso la colonna IMAC equilibrata a 2 ml / min. Raccogliere il flusso attraverso.
    5. Lavare la colonna IMAC con 5 volumi di colonna ciascuno di concentrazioni crescenti di imidazolo con tampone B (cioè, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Raccogliere i lavaggi in 2 ml frazioni.
    6. Eluire il campione con una concentrazione finale di 250 mM per 5 volumi di colonna. Raccogliere il campione eluito in 2 ml frazioni.
    7. Analizzare il flusso attraverso le frazioni di lavaggio e le frazioni di eluizione utilizzando l'analisi SDS-PAGE (vedi punto 1.2.6) in base alla loro assorbanza a 280 nm. In comune le frazioni contenenti il ​​OMP bersaglio β-barile come verificato mediante analisi SDS-PAGE.
    8. Rimuovere il tag 6x-istidina con l'aggiunta di TEV proteasi al campione pooled (secondoil protocollo del produttore) e incubando overnight a 4 ° C con dolce dondolio.
    9. Caricare la soluzione campione / proteasi su una colonna IMAC di nuovo per separare il target OMP β-barile (passare attraverso) dai tag clivati ​​e qualsiasi campione uncleaved. Il flusso attraverso conterrà il campione spaccati manca il tag.
      Nota: Questo sarebbe anche eliminare ogni proteasi come TEV-His, che ha anche un tag 6x-istidina non scindibile in sé. Altrimenti, saranno necessari altri metodi per rimuovere la proteasi dopo la digestione.
    10. Facoltativamente, effettuare cromatografia a scambio ionico per purificare ulteriormente il campione. Seguire le istruzioni del produttore per la colonna da utilizzare, essendo sicuri di includere il detersivo in tutti i buffer.
    11. Per preparare la cristallizzazione, caricare il campione su una colonna di gel filtrazione in un tampone contenente il detersivo da utilizzare per la cristallizzazione, ad esempio 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1% OG.
    12. Raccogliere 1 ml frazioni e analizzare USIAnalisi ng SDS-PAGE (vedi Passaggio 1.2.6) basato sul loro assorbanza a 280 nm. frazioni piscina con assorbanza a 280 nm in quanto contengono la proteina bersaglio. Concentrato a ~ 10 mg / ml.
      Nota: Se lo si desidera, una corretta piegatura può essere valutata mediante un saggio di modificabilità di calore come indicato di seguito.
  4. Calore Modificabilità Assay
    Nota: Un metodo per monitorare il corretto ripiegamento del purificato β-barile OMP è quello di eseguire test di modificabilità di calore con un semi-nativo SDS-PAGE 22. Qui, i campioni non riscaldati venga piegato correttamente in genere migrare in modo diverso da quelli che sono denaturato calore. Questa proprietà è unica per beta-barile OMP e ampiamente utilizzati per studiare questa famiglia di proteine ​​di membrana.
    1. Prima di preparazione dei campioni, montare l'apparato gel. Per iniziare, posizionare il serbatoio di accumulo in un secchio di ghiaccio e circondare completamente di ghiaccio. Inserire un cast in-house o gel commerciale gradiente nativo nel supporto e inserire nel serbatoio. riempire tegli serbatoio completamente con 1x freddo MES tampone di corsa (50 mm 2- [N-morfolino] acido etansolfonico, 50 mm di base Tris, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
    2. Pipettare 0,25 ml di campione (10 mg / ml) in due provette da 1,5 ml microcentrifuga. Etichettare uno come 'bolliti' e l'altro come 'RT'.
    3. Aggiungere 9,75 ml di tampone campione per ogni e mescolare pipettando. Per entrambi i campioni, aggiungere 10 ml di tampone 2x SDS di carico (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% bromofenolo blu, e il 20% glicerolo) e mescolare delicatamente pipettando.
    4. Far bollire il campione 'bollito' a 95 ° C per 5 minuti, lasciando il campione 'RT' a temperatura ambiente. Gira la 'bollito' brevemente campione.
    5. Carico 20 ml di entrambi i campioni sul gel nativo preassemblato. Eseguire per 60 min a 150 V. costante Rimuovere il gel e ammollo nella soluzione colorante per visualizzare i risultati.

3. Cristallizzazione

Nota: per la cristallizzazione di entrambibersagli proteici solubili e di membrana, è protocollo standard per massimizzare la purezza del campione e stabilità (cioè, migliore detergenti, ligandi, cofattori, ecc). Metodologia corrente per cristallizzare obiettivi proteina di membrana, in generale, comprende tre approcci principali che soddisfano i requisiti anfifilici di proteine ​​doppio strato-embedded: (1) detersivi, (2) bicelle, e (3) fase cubica lipidica (LCP) (Figura 6) 23. L'uso di un robot nanolitro cristallizzazione viene fortemente raccomandato quando possibile, al fine di aumentare il numero di condizioni che possono essere esaminati per un dato volume di campione, così come, utilizzando recenti progressi strumenti volti a facilitare la determinazione della struttura (Figura 7).

  1. Cristallizzazione utilizzando detergenti
    1. Ottenere un campione di proteine ​​solubilizzato detergente è a ~ 10 mg di concentrazione / ml. Facoltativamente, aggiungere l'additivo 1,2,3-heptanetriol direttamente al campione ad una concentrazione finale del 3% per ridurre detergdimensioni micelle ent.
    2. Filtrare il campione utilizzando un filtro centrifugo 0,22 micron per rimuovere le particelle e le precipitazioni.
    3. Utilizzando un robot cristallizzazione, eseguire un'ampia cristallizzazione matrice screening utilizzando disponibili in commercio 96 schermi e da una impiccagione o seduti metodo di vaporizzazione goccia con gocce composte da ~ 200 del campione della proteina nl e ~ 200 buffer di cristallizzazione nl.
    4. Incubare le piastre di cristallizzazione a ~ 21 ° C. Ispezionare le piastre settimanali per la crescita dei cristalli utilizzando uno stereomicroscopio.
    5. Ottimizzare lead cristallizzazione variando componenti della condizione di cristallizzazione in modo sistematico (crescente / decrescente sale o concentrazioni precipitanti, a pH, temperatura di incubazione, e la concentrazione / o proteine).
  2. Cristallizzazione Utilizzando bicelle
    Nota: Una dimostrazione più dettagliata delle tecniche bicelle è già stato descritto da Ujwal e Abramson 24.
    1. Preparare o acquistare un 3Miscela bicelle 5% composto di DMPC: CHAPSO con un rapporto di 2,8: 1 secondo protocolli pubblicati 25. Altre concentrazioni possono essere dosati, nonché, altri lipidi e detergenti, come necessario.
    2. Ottenere un campione di proteine ​​solubilizzato detergente è a ~ 10 mg di concentrazione / ml.
    3. Aggiungere la miscela bicelle, su ghiaccio, con un rapporto di partenza di 4: 1 v / v (proteina: bicelle) (ad esempio, aggiungere 10 ul di miscela bicelle a 40 microlitri di proteine ​​e miscelare rapidamente pipettando).
    4. Incubare in ghiaccio 30-60 min.
      Nota: La proteina: soluzione bicelle dovrebbe rimanere per lo più chiaro, ma spesso può girare leggermente opaco. Tuttavia, se la proteina: bicelle soluzione diventa bianco latte, indicando precipitazione, poi altre variabili devono essere analizzati (cioè, detersivo, tampone, ecc). Per i nuovi campioni, facendo test su piccola scala (proteina 8 ml e 2 bicelle microlitri) si consiglia di verificare la stabilità prima di scalare fino a impedire la perdita del campione inutili.
    5. Utilizzando un robot cristallizzazione, eseguire un'ampia cristallizzazione matrice screening utilizzando disponibili in commercio 96 schermi e da una impiccagione o seduti metodo di vaporizzazione goccia con gocce composte da ~ 200 del campione della proteina nl e ~ 200 buffer di cristallizzazione nl.
    6. Incubare le piastre di cristallizzazione a ~ 21 ° C. Ispezionare le piastre settimanali per la crescita dei cristalli utilizzando uno stereomicroscopio.
    7. Ottimizzare lead cristallizzazione variando componenti della condizione di cristallizzazione in modo sistematico (crescente / decrescente sale o concentrazioni precipitanti, a pH, temperatura di incubazione, e la concentrazione / o proteine).
  3. Cristallizzazione Utilizzando fase cubica lipidica (LCP)
    Nota: Una dimostrazione più dettagliata delle tecniche di LCP è già stato descritto da Liu e Cherezov 26,27.
    1. Ottenere un campione di proteine ​​solubilizzato detergente è a ~ 20 mg di concentrazione / ml.
    2. Pre-caldo il monoolein a ~ 40 ° C. Caricare60 ml monoolein in una siringa 100 microlitri a tenuta di gas e 40 ml campione di proteine ​​in un altro.
    3. Utilizzando un accoppiatore miscelazione, collegare le siringhe, facendo attenzione a non introdurre l'aria.
    4. Mescolare delicatamente applicando pressione alternata sui pistoni siringa spingendo la miscela da una siringa all'altra completamente fino a quando il campione diventa trasparente ed omogenea.
    5. Utilizzando un robot progettato per cristallizzazione metodi LCP, eseguire un'ampia cristallizzazione matrice screening utilizzando disponibili in commercio 96 schermi e con piastre di cristallizzazione panino-stile (0,1 mm di spessore bene) con gocce composto da 100 campioni proteina nl e 750 buffer di cristallizzazione nl.
      Nota: i rapporti di goccia possono essere regolati in caso di necessità. Inoltre, coperchi solidi (cioè, vetro o plastica di spessore) sono raccomandate che supportano le gocce ben anziché film sottili, che tendono a consentire le gocce di muoversi pozzo quando le piastre vengono gestiti.
    6. Incubare la cristallizzazione ptardive a ~ 21 ° C. Ispezionare le piastre settimanali per la crescita dei cristalli utilizzando uno stereomicroscopio.
    7. Ottimizzare lead cristallizzazione variando componenti della condizione di cristallizzazione in modo sistematico (crescente / decrescente sale o concentrazioni precipitanti, a pH, temperatura di incubazione, e la concentrazione / o proteine).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yiur è un TonB trasportatore di ferro dipendente che è un bersaglio del vaccino putativo contro Yersinia pestis. E 'stato originariamente identificato utilizzando un test di microarray. Qui, i passi che sono state prese per determinare la struttura di yiur mediante cristallografia a raggi X sono delineati (Figura 9). Per la clonazione, la sequenza di DNA di yiur (meno il segnale sequenza N-terminale) è stato amplificato mediante PCR dal DNA genomico e subclonato in un vettore contenente una sequenza segnale N-terminale pelB e tag di affinità 10x-istidina seguito da un sito proteasi TEV. Per l'espressione, il plasmide contenente yiur stato trasformato in BL21 (DE3) cellule competenti e una singola colonia usato per coltivare una cultura 5 ml di avviamento per OD 600 ~ 0,5. Dodici flaconi contenenti 750 ml di terreno TB sono stati poi inoculati con 1 ml di coltura starter e ha permesso di crescere per 3 d a 20 ° C (agitazione a 220 giri al minuto). Le cellule sono state poi raccolte, la produzione di circa 150-200g di pasta totale delle cellule, che era in flash raffreddato in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso.

Per purificazione yiur, 20 g di cellule sono state risospese in 120 ml di PBS 1x (10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4) mediante agitazione a temperatura ambiente con DNasi I e AEBSF viene aggiunto. Lisi è stata eseguita da due passaggi attraverso un omogeneizzatore. Il lisato è stato quindi centrifugato a 12.000 xg per 10 min (si arresti cellule intatte e corpi di inclusione). Il supernatante è stato nuovamente centrifugata a 235.000 xg per 60 minuti, con il pellet contenente la frazione di membrana (yiur). Le membrane sono state quindi risospese in 100 ml di PBS 1x usando un omogeneizzatore Dounce. Yiur era solubilizzato / estratta dalle membrane utilizzando Elugent a concentrazione finale del 5%, mescolando durante la notte (fino a 16 ore) a 4 ° C. Le membrane solubilizzate sono stati poi centrifugati di nuovo a 371.000 xg per 60 minuti, con il supernatant contenente la frazione solubilizzato compreso yiur. Per isolare yiur, IMAC è stata effettuata utilizzando tampone A (1x PBS, 0,1% DDM) e il Tampone B (1x PBS, 1 M imidazolo, 0,1% DDM), lavato con concentrazioni imidazolici da 30-50 mM ed eluita con 250-500 mM . Per rimuovere la N-terminale tag 10x-istidina, incubazione con TEV HIS proteasi è stata eseguita una notte a 4 ° C durante la dialisi in tampone PBS 1x. Il campione è stato quindi fatto passare su una colonna IMAC nuovo, il flusso attraverso concentrato, dializzato e quindi ulteriormente separato mediante un M NaCl gradiente 0-1,0 su una colonna di scambio ionico in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5. Le frazioni contenenti yiur state poi riunite, concentrate e corse su una colonna di gel filtrazione utilizzando 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, e 0,05% LDAO. Le frazioni contenenti yiur state poi riunite e concentrate a 10 mg / ml per la cristallizzazione.

lo screening matrice Broad è stato poi eseguito e le condizioni determinateche ha prodotto alcuni cristalli di diffrazione iniziali. Ulteriore ottimizzazione ha portato a grandi cristalli che sono stati utilizzati per raccogliere i dati nativi di diffrazione a raggi X. Cristalli mostrato in Figura 8 sono rappresentative dei cristalli si può raggiungere con i metodi qui presentati. Cristalli dello screening detersivo e bicelle può essere grande come cristalli ottenuti tipicamente per le proteine ​​solubili; Tuttavia, quelle da LCP sono quasi sempre molto più piccola. I dati sono stati abbastanza buoni da utilizzare per la sostituzione molecolare che ha portato a strutturare determinazione a 2,65 risoluzione A.

Figura 1
Figura 1. I due tipi di proteine ​​di membrana completamente integrati sono α-elica e β-barile. visualizzati sono esempi di ciascuno con il recettore β2-adrenergici (codice PDB 2RH1, α-elicoidale) e il TonB-dipendente trasportatore BTub (codice PDB 1NQE,b-barile). La riga superiore mostra la vista extracellulare, mentre la fila inferiore mostra la vista della membrana. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. OMP β-barile servire molte funzioni diverse e possono avere strutture diverse. Mentre proteine ​​di membrana alfa-elica possono contenere uno o più domini transmembrana, OMP β-barile vanno da 8-26 trefoli e ogni filo interagisce intimamente con i fili adiacenti. residui esterni, che interagiscono con la membrana, sono tipicamente idrofobico mentre i residui interni, che interagiscono con il solvente, sono tipicamente polari e idrofilo. Riga superiore mostra la vista extracellulare, la fila centrale mostra la vista della membrana, e la riga in basso mostra i periplasmic vista. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Esempi di due tipi di comuni OMP β-barile. Sinistra, la struttura del trasportatore TonB-dipendente FEPA (codice PDB 1FEP), raffigurante la extracellulare (in alto), la membrana (al centro) e viste periplasmatiche (in basso). Il dominio β-barile è indicato in verde mentre il dominio spina è in magenta. A destra, la struttura del Autotransporter ESTA (codice PDB 3KVN), raffigurante la extracellulare (in alto), la membrana (al centro) e vista (in basso) periplasmatiche. Il dominio β-barile è indicato in oro mentre il dominio del passeggero è di colore blu. Clicca qui per visualizzare un Versi più grandisu questa figura.

Figura 4
Figura 4. Schema di clonazione ed espressione cantiere per la produzione di OMP β-barile. Schema del gasdotto utilizzato per clonare ed esprimere un OMP bersaglio da una espressione di membrana nativa (a sinistra) o con l'espressione in corpi di inclusione per ripiegamento (a destra). Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Schema di purificazione conduttura per l'isolamento di OMP β-barile. Schema della conduttura utilizzata per l'estrazione di OMP che sono stati espressi direttamente nel OM. Qui, il bersaglio OMP deve essere estrattoEd dalla membrana da solubilizzazione con detergente appropriato e quindi purificato da IMAC, cromatografia a scambio ionico e gel filtrazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Schema del gasdotto di cristallizzazione per la crescita di cristalli di OMP β-barile. Tre metodi può essere utilizzato per la cristallizzazione di OMP β-botte tra cui lo screening detergente, bicelle, e la fase cubica lipidica (LCP). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7 Figura 7. Nuovi strumenti in cristallografia che hanno significativamente contribuito a strutturare la determinazione di OMP β-barile. Gli esempi includono i robot cristallizzazione / robot LCP (A), microscopi UV (B), Secondo Ordine non lineare Imaging di cristalli chirali (SONICC) visualizzazione (C), pucks robot / robot (D), i metodi rastering / vettore / elicoidale di raccolta dei dati (E ), e travi microfocus (F). Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. immagine rappresentativa dei cristalli risultanti dal protocollo. Cristalli dello screening detersivo e bicelle può essere grande come cristalliottenuto in genere per le proteine ​​solubili; Tuttavia, quelle da LCP sono quasi sempre molto più piccola. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9. Da costrutti a cristalli di strutturare la determinazione per il putativo bersaglio del vaccino yiur da Yersinia pestis. Il gasdotto generale utilizzato per la determinazione della struttura di yiur, illustrando le misure adottate per clonare, esprimere, purificare, cristallizzare, e risolvere la struttura. Si prega di fare clic su qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

β-barile OMP servono ruoli essenziali nel batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti e sono obiettivi importanti per l'analisi strutturale che offrono una ricchezza di informazioni sui meccanismi molecolari essenziali a membrane esterne di queste rispettive organelli. Tuttavia, producendo abbastanza campione per l'analisi strutturale non è sempre agevole e, pertanto, una condotta generale è presentato per la produzione di quantità sufficienti di bersaglio OMP β-barile per la determinazione della struttura, che spiega in dettaglio il processo da costrutti ai cristalli. Mentre questi protocolli sono stati testati e trovati a lavorare per la maggior parte OMP da batteri Gram-negativi, ci sono delle limitazioni, in quanto ci sono alcuni obiettivi, in particolare per i mitocondri e cloroplasti, che possono richiedere altri metodi per l'espressione e la purificazione. Come tali, i metodi qui dovrebbe essere applicabile per la maggior parte dei progetti che coinvolgono OMP da batteri Gram-negativi, ma il livello di espressiones e la quantità di campione purificato varieranno a seconda della OMP destinazione.

Ci sono due approcci generali per l'espressione di OMP β-barile per studi strutturali, (1) nell'espressione vivo direttamente nella membrana esterna e (2) espressione di corpi di inclusione per ripiegamento in vitro. Per il vivo approccio espressione, OMP β-barile sono mirati alla membrana esterna di E. coli dove sono nativamente piegati e isolati direttamente dalle membrane. Espressione alla membrana è l'approccio preferito dal target sono più probabilità di essere accuratamente piegati. Mentre questo approccio derivano tipicamente bassi livelli di proteina nel complesso, evita le complicazioni talvolta associata a ripiegamento in vitro. Molti OMP β-botte sono stati espressi con successo in questo modo per la determinazione della struttura 4,5,11. Il successo è spesso raggiunto utilizzando un sistema che si basa su espressione costitutiva di basso livello da un T7 promuovonoR, ma altri sistemi che si basano su di induzione (vale a dire, IPTG, arabinosio) per l'espressione sono abitualmente utilizzati con successo.

Espressione direttamente nella membrana esterna richiede la proteina bersaglio per avere una sequenza segnale N-terminale che dirige la complessa catena ribosoma nascente al translocon Sec, per la secrezione del nascente OMP β-canna nella periplasma. La sequenza segnale viene scisso sul lato periplasmico della membrana interna, quindi è importante che la sequenza segnale di precedere qualsiasi tag N-terminali aggiunti al bersaglio. Il nascente OMP β-canna viene poi accompagnato da chaperon attraverso periplasma al complesso BAM per l'inserimento nella membrana esterna 2,3.

Per gli obiettivi che non possono essere overexpressed nella membrana, un approccio alternativo è espressione in corpi di inclusione per in vitro refolding 28-30. Questo approccio si traduce di solito in alto livello e robusta espressione of la proteina bersaglio. Tuttavia, può essere difficile da individuare le condizioni ripiegamento, come ripiegamento può essere inefficiente. Inoltre, può essere difficile per saggiare quando il bersaglio β-barile OMP è correttamente ripiegata. Eppure, ci sono molti esempi di proteine ​​che sono state ripiegate con successo per studi strutturali, tra cui OmpA 31, Ail 19, OmpF 32, e VDAC 33. Per i cloni che non esprimono affatto (nativamente o in corpi di inclusione) o Express, ma non sono assemblate correttamente nella membrana (nativo), si potrebbe provare a mutare il β-barile per assomigliare più da vicino quella di E. coli 34,35. La sequenza aminoacidica del β-segnale del dominio canna è importante per il riconoscimento e l'assemblaggio del complesso BAM e variazioni nella sequenza β-segnale può influenzare significativamente sia i livelli biogenesi e di espressione stabilite dalla OMP 11,34 bersaglio β-barrel , 35. La corretta integrazione dei destinatari β-BarrEL OMP può essere monitorato da screening per frazionamento membrana e detersivo estraibilità seguita da saggi di modificabilità del calore.

Cristallizzazione di proteine ​​di membrana in presenza di micelle detergenti è la tecnica più antica e permette un facile adattamento delle attrezzature di proteine ​​solubili cristallizzazione tradizionale e strategie. Mascherando la membrana regioni embedded con molecole detergenti, concentrato proteico può essere trattato in modo simile alle proteine ​​solubili (per esempio, misti con acque madri di cristallizzazione e racchiusi in un apparecchio di diffusione del vapore che provoca la lenta disidratazione della goccia proteine). Mentre semplice concezione, caratteristiche e proprietà detergenti aggiungono uno strato significativo di complessità in cima alle normali sfide cristallizzazione. In particolare, il carattere molecolare di un detersivo deve essere empiricamente misura per una data proteina bersaglio, compreso il formato micelle, polarità gruppo testa (anionici, cationici, non ionici, ozwitterionico), e la lunghezza della catena idrocarburica, in quanto ciascuno di essi influenzano la stabilità della proteina di membrana di destinazione in soluzione. Inconvenienti di questo approccio comprendono l'ambiente chimico non-native, il potenziale oscuramento delle regioni di superficie che potrebbero costituire i contatti di cristallo, e problemi di concentrazione di detersivo.

Bicelle sono una miscela di lipidi e amphiphiles (ad esempio, detergenti o brevi lipidi catena) che assemblano in particelle individuali che simulano una struttura a doppio strato simile alle membrane trovano nelle cellule 36,37. Le maschere amphiphile il core idrofobico di questo doppio strato in cui è esposto sui bordi in modo simile alle micelle di detersivo cristallizzazione. Ciò fornisce un ambiente più nativo-like per contribuire a stabilizzare proteine ​​bersaglio.

Obiettivi proteina di membrana possono essere cristallizzati con fase cubica lipidico metodi 38 (LCP). LCP è una mesofase formata dalla miscelazione di lipidi e acqua,che un doppio strato continuo è permeato da due reti non si intersecano di canali del solvente. Questa struttura tridimensionale permette la diffusione di lipidi incorporato proteine ​​di membrana in un ambiente sostanzialmente di tipo nativo e consente contatti cristallo per formare tra le superfici idrofobe e idrofile delle proteine ​​e diminuisce il contenuto di solvente complessiva di cristalli migliorando loro ordinamento. Dalla sua introduzione nel 1990, le tecniche LCP sono stati critici nel determinare le strutture di molti obiettivi proteine ​​di membrana sfuggenti, come ad esempio Rhodopsins 39,40 e GPCR 41-43. L'uso del LCP a schermi ad alto rendimento richiede disposizioni speciali (ad esempio, robot specifici per LCP, siringhe a tenuta di gas, LCP strumento di erogazione, piatti panino cristallizzazione, ecc) come il monoolein spessore comunemente usato per LCP, non può essere gestito da tradizionale gestione nanolitro liquido robot.

cromatografia su gel filtrazione è un passo estremamente importanteper la cristallizzazione di proteine ​​di membrana in generale perché produce informazioni su come stabilizzare il detergente scelto è per il target proteina di membrana, che può essere visualizzato dal cromatogramma. Confrontando la quantità di campione nel volume vuoto, tempi di ritenzione, e le forme dei picchi, la stabilità complessiva e monodispersity del campione è possibile accedere. Un campione ideale dovrebbe avere molto poco o nessun campione perso nel volume vuoto e avrebbe un singolo picco di eluizione simmetrica con una distribuzione gaussiana. Il detergenti C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%), e LDAO (0,05%) sono solitamente usata per la cristallizzazione di OMP β-botte con successo e sono buoni per iniziare. Idealmente, gli esperimenti su piccola scala sono eseguite confrontando vari detergenti o miscele di detergenti per determinare quali sono più appropriate per la cristallizzazione. Quelli che si trovano ad essere più la stabilizzazione vengono poi utilizzati per le preparazioni su larga scala del target β-barrel OMP e per prove di cristallizzazione.

Una volta che i cristalli sono formati della OMP destinazione β-barile, ottimizzazione piombo (cioè, lo screening additivo crio-screening di screening additivi detergenti, etc.) e altre tecniche simili a bersagli proteici solubili può essere seguito con alcune differenze. Tuttavia, ci sono alcuni recenti progressi che sono estremamente utili quando si lavora con proteine ​​di membrana. In particolare, cristalli di proteine ​​di membrana possono essere spesso difficili da individuare nel loro liquido madre per una serie di motivi. Le proteine ​​di membrana formano spesso relativamente piccoli cristalli e falsi positivi possono sviare l'ottimizzazione di cristallo. tecniche LCP particolarmente presente sfide aggiuntive, data la alta viscosità ambienti, spesso opachi dove vengono coltivati ​​i cristalli. Le strategie per affrontare questi problemi comprendono l'uso di microscopi ultravioletti (UV) in collaborazione con microscopi ottici, permettendo cristalli proteici naturalmente fluorescenti a distinguere From non fluorescenti sale e cristalli detergenti (Figura 7). Le sfide rimangono, tuttavia, identificazione di cristalli di proteine ​​che si formano all'interno dei campi di precipitante. I cristalli possono essere rilevati anche dallo sfruttamento degli effetti di raddoppiare la frequenza della maggior parte dei cristalli chirali quando ripreso da impulsi laser a femtosecondi di scansione, come attuato dalla tecnologia SONICC 44. Questa alta risoluzione, la tecnica alto contrasto può essere utilizzato per distinguere cristalli submicrometriche dalle condizioni oscurando.

proteine ​​di membrana La raccolta avviene con tecniche di cristallografia normali, in particolare per il detersivo e bicelle cristallizzazione. Looping viene eseguita a mano, utilizzando un microscopio ingrandimento di basso e un anello di cristallo di montaggio (ad esempio, fibra di nylon, filo, o polimero). Wicking di un eccesso di solvente e di protezione crio prima di immergersi congelamento in liquido criogenico sono anche le procedure standard quando la raccolta di cristalli OMP β-barile. Tuttavia, il raccoltozione di cristalli cresciuti LCP presenta particolari problemi, soprattutto se mietendo direttamente dalle piastre a sandwich, come cristalli possono essere di difficile accesso e non possono essere facilmente osservata al microscopio. Inoltre, i cristalli coltivati ​​in LCP devono talvolta essere raccolti alla rinfusa poiché la miscela LCP non può essere facilmente separato all'interno del ciclo.

La raccolta dei dati per OMP β-barile può essere eseguita come con cristalli di proteine ​​solubili con solo alcune considerazioni aggiuntive. Mentre le dimensioni dei cristalli cresciuti con metodi detergenti e bicelle sono spesso paragonabili a quelli cresciuti con proteine ​​solubili, cristalli cresciuti dal metodo LCP sono quasi sempre notevolmente inferiore. Inoltre, perché i campioni raccolti dalla matrice LCP spesso contenere più cristalli che sono difficili da osservare, si deve utilizzare sorgenti di sincrotrone dotate di mini-beam e loop capacità rastering che può scansione sistematicamente l'intero ciclo per individuare le posizioni dei cristalli basato su diffraction (Figura 7). Le piccole dimensioni dei cristalli LCP li rende anche particolarmente soggetti a danni da radiazioni. Pertanto i dati di molteplici cristalli sono spesso fuse per raccogliere un set di dati completo.

Una volta ben cristalli di diffrazione sono ottenuti e un set di dati completo sono raccolti, la determinazione della struttura per OMP β-barile può essere realizzato utilizzando le stesse procedure per le proteine ​​solubili, tenendo presente che i cristalli di proteine ​​di membrana in genere presentano un contenuto di solvente più elevato. Come con tutti gli obiettivi cristallografia, se proteina solubile o proteine ​​di membrana, ciascuno offre le proprie sfide e per questo motivo nessuna singola conduttura può direttamente applicarsi a tutti gli obiettivi. Pertanto, è il lavoro del ricercatore primaria (s) di adattare questi protocolli generali di conseguenza per garantire il successo della sua / suo progetto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystallization Robot TTP Labtech, Art Robbins - Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler Eppendorf, BioRad -
Media Shaker New Brunswick, Infors HT -
UV-vis spectrometer Eppendorf -
SDS-PAGE apparatus BioRad 1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels BioRad, Life Technologies 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime GE Healthcare -
AkTA Purifier GE Healthcare -
Microcentrifuge Eppendorf -
Centrifuge (low-medium speed) Beckman-Coulter -
Ultracentrifuge (high speed) Beckman-Coulter -
SS34 rotor Sorvall -
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter -
Type 70 Ti rotor Beckman-Coulter -
Dounce homogenizer Fisher Scientific 06 435C
Emulsiflex Avestin -
Dialysis tubing Sigma D9652
LCP tools Hamilton, TTP Labtech -
VDX 24 well plates Hampton Research HR3-172
Sandwich plates Hampton Research, Molecular Dimensions HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets Grace Bio-Labs 875238
HiPrep S300 HR column GE Healthcare 17-1167-01
Q-Sepharose column GE Healthcare 17-0510-01
Crystallization screens Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions -
Gas-tight syringe (100 ml) Hamilton 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2, (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. e3383 (2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. e4000 (2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noinaj, N., Mayclin, S., Stanley, A. M., Jao, C. C., Buchanan, S. K. From Constructs to Crystals – Towards Structure Determination of β-barrel Outer Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (113), e53245, doi:10.3791/53245 (2016).More

Noinaj, N., Mayclin, S., Stanley, A. M., Jao, C. C., Buchanan, S. K. From Constructs to Crystals – Towards Structure Determination of β-barrel Outer Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (113), e53245, doi:10.3791/53245 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter