β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
β-fat OMP kan endast hittas i de yttre membranen hos mitokondrier, kloroplaster, och gramnegativa bakterier 1-3. Medan de tjänar liknande roller som a-spiral proteiner, har de en helt annan veck bestående av en central membran inbäddade β-fat domän som sträcker sig från 8-26 anti-parallella p-strängar med varje sträng är intimt förbunden med de två grann strängarna (figurerna 1 och 2). De första och sista delarna av β-fat-domänen interagerar sedan med varandra, nästan uteslutande i ett anti-parallellt sätt (med undantag för mitokondriell VDAC), för att stänga och försegla β-fat domän från den omgivande membranet. Alla β-fat OMP har extracellulära loopar av varierande sekvens och längd som spelar en viktig roll i ligandinteraktioner och / eller protein-protein-kontakter, med dessa slingor ibland vara så stor som 75 rester, såsom återfinns i Neisserial transferrinbindning protein A (TbpA) 4. β-fat OMP kan också ha N-terminala eller C-terminala periplasmiska tillägg som fungerar som ytterligare domäner för proteinets funktionella ändamål (t.ex. bama 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Medan många typer av β-fat OMP finns 11, två av de vanligaste typerna beskrivs nedan som exempel för de mindre bekanta med området, (1) TonB beroende transportörer och (2) autotransporters.
TonB-beroende transportörer (t.ex., FEPA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) är väsentliga för näringsämne import och innehålla en N-terminal plugg domän som består av ~ 150 rester som hittas tucked insida en C-terminal 22-strängat β- fat domän inbäddad i det yttre membranet 12 (fig 3). Även om denna plugg domän förhindrar substrat från fritt passera genom pipan domän, substratbindning inducerar en strukturförändring inom plugg domänen thvid leder till porbildning (antingen genom kontakten ombildning eller genom partiell / full utstötning av pluggen) som sedan kan underlätta substrat transport över det yttre membranet i periplasman. TonB-beroende transportörer är speciellt viktiga för överlevnaden av vissa patogena stammar av gramnegativa bakterier såsom Neisseria meningitidis som har utvecklats specialiserade transportörer som kapar näringsämnen såsom järn direkt från humana värdproteiner 4,13,14.
Autotransporters tillhör den typ V-sekretionssystemet av Gram-negativa bakterier och är p-fat OMP som består av en β-fat domän (typiskt 12-strängar som med ESTA och EspP) och en passagerare domän som antingen utsöndras eller presenteras på cellytan 15,16 (Figur 3). Dessa β-fat OMP tjänar ofta viktiga roller i cellöverlevnad och virulens med passagerar domänen tjänar antingen som ett proteas, adhesin, och / eller annan effector som förmedlar patogenes.
Strukturella metoder såsom röntgenkristallografi, NMR-spektroskopi och elektronmikroskopi (EM) tillåter oss att bestämma modeller för OMP på atomär upplösning som i sin tur kan användas för att dechiffrera exakt hur de fungerar inom det yttre membranet. Denna ovärderlig information kan sedan användas för läkemedel och vaccinutveckling i förekommande fall. Till exempel är transferrinbindande proteinet A (TbpA) som finns på ytan av Neisseria och krävs för patogenesen, därför att den direkt binder humant transferrin och sedan extraherar och importerar järn för sin egen överlevnad. Utan TbpA kan Neisseria inte rensar järn från den mänskliga värden och återges icke-patogena. Efter kristallstrukturen av humant transferrin bundet till TbpA 4 löstes, blev det mycket tydligare hur de två proteinerna associeras vilka regioner av TbpA medierad växelverkan, vilka rester var viktiga för järn utvinning av TbpA, ochhur man kan utveckla läkemedel mot Neisseria riktar TbpA. Med tanke på den betydelse β-fat OMP i gramnegativa bakterier för överlevnad och patogenes, liksom i mitokondrier och kloroplaster funktion och behovet av ytterligare strukturell information om denna unika klass av membranproteiner och de system där de fungerar allmänna protokoll presenteras med det övergripande målet att uttrycka och rena mål OMP på höga nivåer för karakterisering av strukturella metoder.
β-fat OMP tjäna viktiga roller i gramnegativa bakterier, mitokondrier och kloroplaster och är viktiga mål för strukturanalys som erbjuder en mängd information om väsentliga molekylära mekanismer vid de yttre membranen hos dessa respektive organeller. Men producera tillräckligt med prov för strukturanalys är inte alltid enkelt och därför är en allmän pipeline presenteras för produktion av tillräckliga mängder av mål β-fat OMP för strukturbestämning, förklarar i detalj processen från konstruktioner…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
SS34 rotor | Sorvall | – | |
Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
Emulsiflex | Avestin | – | |
Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |