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Chemistry

β बैरल बाहरी झिल्ली प्रोटीन की संरचना निर्धारण की ओर - निर्माण से क्रिस्टल करने के लिए

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/53245
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 2,3, 2
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

Introduction

β बैरल OMPs केवल माइटोकॉन्ड्रिया, क्लोरोप्लास्ट की बाहरी झिल्ली में पाया जा सकता है, और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया 1-3। जबकि वे α-पेचदार प्रोटीन के रूप में इसी तरह की भूमिकाओं की सेवा है, वे एक बहुत ही अलग 8-26 विरोधी समानांतर β-किस्में से लेकर हर कतरा परिचित दो पड़ोसी किस्में से जोड़ा जा रहा एक केंद्रीय झिल्ली एम्बेडेड β बैरल डोमेन से मिलकर गुना राशि (आंकड़े 1 और 2)। β बैरल डोमेन की पहली और आखिरी किस्में तो एक दूसरे के साथ, एक विरोधी समानांतर फैशन में (mitochondrial VDAC को छोड़कर), बातचीत लगभग विशेष रूप से बंद करने और आसपास के झिल्ली से β बैरल डोमेन सील करने के लिए। सभी β बैरल OMPs बदलती अनुक्रम और लंबाई के बाह्य छोरों जो इन छोरों कभी कभी ऐसी Neisserial transferrin में पाया समर्थक बंधन के रूप में 75 के अवशेष, के रूप में के रूप में बड़े होने के साथ ligand बातचीत और / या प्रोटीन, प्रोटीन संपर्क करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा हैTein एक (TbpA) 4। β बैरल OMPs भी एन टर्मिनल या सी टर्मिनल periplasmic एक्सटेंशन जो प्रोटीन के कार्यात्मक उद्देश्य के लिए के रूप में अतिरिक्त डोमेन की सेवा कर सकते हैं (जैसे, बामा 5-7, FimD 8,9, Fadl 10)। जबकि β बैरल OMPs के कई प्रकार मौजूद 11, और अधिक आम प्रकार के दो क्षेत्र, (1) TonB निर्भर ट्रांसपोर्टरों और (2) autotransporters के साथ कम परिचित लोगों के लिए उदाहरण के रूप में नीचे वर्णित हैं।

TonB निर्भर ट्रांसपोर्टरों (जैसे, FEPA, TbpA, BtuB, परि, आदि) पोषक तत्व आयात के लिए आवश्यक हैं और एक एन टर्मिनल प्लग डोमेन ~ 150 अवशेषों है कि एक सी टर्मिनल β- 22 असहाय अंदर tucked मिले मिलकर शामिल बैरल डोमेन बाहरी झिल्ली 12 (चित्रा 3) में एम्बेडेड। हालांकि इस प्लग डोमेन स्वतंत्र रूप से प्रति बैरल के डोमेन से गुजर से सब्सट्रेट को रोकता है, सब्सट्रेट बंधन प्लग डोमेन वीं के भीतर एक गठनात्मक परिवर्तन लाती हैसुराग में गठन के ध्यान में लीन होना करने के लिए (या तो प्लग पुनर्व्यवस्था द्वारा या प्लग का आंशिक / पूर्ण इंजेक्शन द्वारा) जो तब periplasm में बाहरी झिल्ली भर सब्सट्रेट परिवहन की सुविधा कर सकते हैं। TonB निर्भर ट्रांसपोर्टरों ऐसे नेइसेरिया meningitidis विशेष ट्रांसपोर्टरों कि इस तरह के मानव मेजबान प्रोटीन 4,13,14 से सीधे लोहे के रूप में पोषक तत्वों का अपहरण विकसित किया है कि के रूप में ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के कुछ रोगजनक उपभेदों के अस्तित्व के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं।

Autotransporters ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के प्रकार के वी स्राव प्रणाली के हैं और बीटा बैरल OMPs कि एक β बैरल डोमेन (एस्टा और ESPP साथ के रूप में आम तौर पर 12 किस्में) से मिलकर बनता है और एक यात्री डोमेन है कि या तो स्रावित या कम से प्रस्तुत कर रहे हैं सेल 15,16 (चित्रा 3) की सतह। ये β बैरल OMPs अक्सर यात्री डोमेन सेवा के साथ सेल अस्तित्व और डाह में महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा या तो एक प्रोटीज, adhesin, और / या अन्य एफई के रूप मेंफेक्टर कि रोगजनन मध्यस्थता करता है।

इस तरह के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) हमें परमाणु संकल्प पर OMPs जो बदले में समझने के लिए वास्तव में वे कैसे बाहरी झिल्ली के भीतर कार्य किया जा सकता है के लिए मॉडल निर्धारित करने की अनुमति के रूप में संरचनात्मक तरीकों। इस अमूल्य जानकारी तो यदि लागू नशीली दवाओं और वैक्सीन के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, transferrin बाध्यकारी एक प्रोटीन (TbpA) नेइसेरिया की सतह पर पाया जाता है और क्योंकि यह सीधे मानव transferrin बांधता है और फिर निकालता है और अपने स्वयं के अस्तित्व के लिए लोहे का आयात रोगजनन के लिए आवश्यक है। TbpA बिना, नेइसेरिया मानव मेजबान से लोहा मांजना नहीं कर सकते और गैर रोगजनक गाया जाता है। बाद TbpA 4 के लिए बाध्य मानव transferrin के क्रिस्टल संरचना हल किया गया था, यह बहुत स्पष्ट है कि कैसे दो प्रोटीन जुड़े बन गया, TbpA की क्या क्षेत्रों बातचीत की मध्यस्थता, क्या अवशेषों TbpA द्वारा लोहे की निकासी के लिए महत्वपूर्ण थे, औरकैसे एक को निशाना TbpA नेइसेरिया के खिलाफ चिकित्सा विज्ञान का विकास हो सकता है। इसलिए, अस्तित्व और रोगजनन के लिए ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में β बैरल OMPs के महत्व दिया है, साथ ही माइटोकॉन्ड्रिया और क्लोरोप्लास्ट समारोह, और झिल्ली प्रोटीन के इस अनूठे वर्ग के बारे में अतिरिक्त जानकारी संरचनात्मक और प्रणालियों में वे कार्य के लिए जरूरत , सामान्य प्रोटोकॉल व्यक्त करने और संरचनात्मक विधियों द्वारा लक्षण वर्णन के लिए उच्च स्तर पर लक्ष्य OMPs सफ़ाई के समग्र लक्ष्य के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Protocol

1. क्लोनिंग और अभिव्यक्ति

नोट: संरचनात्मक अध्ययन को सक्षम करने के लिए, अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में तैयार किया जाना चाहिए, और यह आम तौर पर क्लोनिंग और लक्ष्य β बैरल बाहरी झिल्ली प्रोटीन की overexpression (OMP) ई में साथ शुरू होता है कोली (चित्रा 4)। तिथि करने के लिए, mitochondrial VDAC के लिए उन संरचनाओं सहित सभी β बैरल OMP संरचनाओं, bacterially व्यक्त प्रोटीन 11 से प्राप्त किया गया है। इधर, सामान्य प्रोटोकॉल इन विट्रो 17 refolding के लिए समावेशन निकायों में क्लोनिंग और बैक्टीरियल झिल्ली में सीधे (1) मूल निवासी अभिव्यक्ति के लिए β बैरल OMPs व्यक्त करने और (2) अभिव्यक्ति के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं।

  1. एक अभिव्यक्ति का निर्माण डिजाइनिंग
    1. प्राप्त या कोडोन अनुकूलित लक्ष्य OMP जीन की खरीद।
    2. खरीद या एक T7 अभिव्यक्ति वेक्टर (i) periplasmic स्थानीयकरण संकेत अनुक्रम युक्त प्राप्त है, एक एन टर्मिनल 6x-Histidine टैग,और झिल्ली या (ii) इन विट्रो refolding के लिए शामिल किए जाने के शरीर के लिए अभिव्यक्ति के लिए एक periplasmic स्थानीयकरण संकेत अनुक्रम के बिना करने के लिए इन विवो अभिव्यक्ति के लिए एक TEV प्रोटीज साइट 4,18,19।
      नोट: एक एन टर्मिनल प्रोटीज cleavable 6x या 10x-Histidine टैग शुद्धि के लिए एक आसान तरीका प्रदान करेगा। घुलनशील प्रोटीन के साथ के रूप में, बाद में टैग हटाने के लिए आकर्षण टैग (Histidine, strep, जीएसटी, आदि), आत्मीयता टैग की स्थिति, और एक प्रोटीज साइट का समावेश (TEV, enterokinase, थ्रोम्बिन, आदि) के चुनाव के लिए अलग अलग ।
    3. पीसीआर उचित प्राइमरों और अभिव्यक्ति वेक्टर में subclone के साथ लक्ष्य अनुक्रम बढ़ाना। बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग (एलआईसी) subcloning के लिए 20,21 या पारंपरिक क्लोनिंग तकनीक (प्रतिबंध एंजाइमों / बंधाव) का प्रयोग करें। हालांकि, एलआईसी उच्च throughput सुविधा कर सकते हैं, विभिन्न निर्माणों (truncations, टैग की विविधता, प्रमोटरों की किस्म) की एक बड़ी संख्या के लिए अनुमति समानांतर में क्लोन करने के लिए और अधिकआसानी से।
  2. विवो झिल्ली-लक्षित अभिव्यक्ति में
    1. एक संकेत अनुक्रम के साथ लक्ष्य β बैरल OMP नीचे की ओर क्लोन है और फ्रेम में सत्यापित करने के लिए अनुक्रमण विश्लेषण का प्रयोग करें (यानी, pelB, OMPA) अभिव्यक्ति का निर्माण में।
      नोट: संकेत अनुक्रम periplasm और बाहरी झिल्ली में बाद में विधानसभा के स्राव के लिए सेकंड translocon को नवजात श्रृंखला का निर्देशन।
    2. अभिव्यक्ति के लिए बैक्टीरिया की एक अभिव्यक्ति तनाव में BL21 (DE3) रासायनिक सक्षम कोशिकाओं के 50 μl में प्लाज्मिड के 1.0 μl pipetting द्वारा निर्माण बदलने और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    3. 30 सेकंड के एक नहाने के पानी का उपयोग कर और फिर 1 मिनट के लिए बर्फ पर वापस जगह के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी नाड़ी।
    4. पूर्व गर्म समाज मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक benchtop प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर का उपयोग कर 1000 rpm पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिला।
    5. प्लेट 100 एक उपयुक्त antibiot युक्त लेग अगर प्लेटों पर कोशिकाओं की μlआईसी और सेते 37 पर रातोंरात डिग्री सेल्सियस उलटा।
    6. एक भी कॉलोनी के साथ एक 5 मिलीलीटर लेग + एंटीबायोटिक संस्कृति inoculating से छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति परीक्षण प्रदर्शन करना। 5-10 कालोनियों के लिए दोहराएँ।
      ध्यान दें: एक β बैरल OMP की संभावित विषाक्तता और बेसल अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भरता की वजह से, कॉलोनी करने वाली कॉलोनी परिवर्तनशीलता कभी कभी मनाया जाता है। इसलिए, कई कालोनियों स्क्रीनिंग प्रत्येक निर्माण परीक्षण किया जा रहा करने के लिए सिफारिश की है। छोटे पैमाने पर परीक्षण अभिव्यक्ति है, बजाय पारंपरिक 5 मिलीलीटर संस्कृतियों, Erlenmeyer बोतल चकित 125 मिलीलीटर में 25 मिलीलीटर संस्कृतियों से बढ़ के लिए सुझाव दिया है। इन शर्तों अक्सर बेहतर प्रतिबिंबित क्या एक बड़े पैमाने पर विकास में क्या होगा। इसके अतिरिक्त, यह एक अच्छा विचार भी, संस्कृति मीडिया (टीबी, पौंड, 2xYT, M9, आदि) के विभिन्न प्रकार के स्क्रीन करने के बाद सफलता के स्तर पर अलग लक्ष्य प्रोटीन के आधार पर सूचना दी गई है।
      1. 0.6 की ~ एक आयुध डिपो से 600 झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें।
      2. विज्ञापन द्वारा लक्ष्य OMP की अभिव्यक्ति प्रेरितडिंग 1 एम isopropyl प्रत्येक संस्कृति ट्यूब के लिए β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के 5 μl और एक अतिरिक्त 1-2 घंटा विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
      3. 15,000 XG पर 1 मिनट के लिए प्रत्येक संस्कृति के 1 मिलीलीटर (~ 0.6 के आयुध डिपो 600) centrifuging एक microcentrifuge का उपयोग करके सभी कालोनियों के लिए अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करें।
      4. तैरनेवाला निकालें और 1x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर के 200 μl में कोशिकाओं resuspend। 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी और फिर सेंट्रीफ्यूज फिर 5 मिनट के लिए 15,000 XG पर।
      5. एक 10% जेल के प्रत्येक कुएं में 20 μl pipetting द्वारा एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर नमूने का विश्लेषण करें। लगातार 200 वी पर 35 मिनट के लिए जेल चला
        नोट: यह इस बात पर लाभकारी निर्धारित करने के लिए यदि प्रोटीन लक्ष्य ठीक से तह किया जा रहा है या नहीं करने में सक्षम होना करने के लिए किया जाएगा। इस बार छोटे पैमाने शुद्धिकरण कर रही द्वारा या गर्मी परिवर्तनीयता के लिए परख करने की क्रिया के द्वारा पूरा किया जा सकता है।
    7. अच्छी अभिव्यक्ति दिखा कॉलोनी का चयन करें और माध्यम के 12-24 एल का उपयोग बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति प्रदर्शन।
      नोट: परम्परागत तरीकों आमतौर पर ~ 0.6 के एक आयुध डिपो से 600 झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों हो जाना और फिर एक उपयुक्त inducer के साथ प्रेरित (यानी, 0.1-1 IPTG के लिए मिमी या ~ arabinose के लिए 0.2%) एक अतिरिक्त 2-4 घंटे के लिए । अगर वांछित, प्रेरण से पहले, के रूप में कम के रूप में 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने और प्रेरण समय का विस्तार।
      1. टपकाया अभिव्यक्ति विधि के लिए, हो जाना एक 25 मिलीलीटर 37 पर संस्कृति टीका लगाना लेग माध्यम में डिग्री सेल्सियस उचित एंटीबायोटिक (ओं) तक आयुध डिपो 600 तक पहुँच जाता है ~ 0.6 से युक्त। फिर, टीबी मध्यम प्लस एंटीबायोटिक (एस) के बारह 1 एल बोतल को टीका लगाना के 1 मिलीलीटर जोड़ने और (3 दिनों ~) 20 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने संतृप्ति के लिए।
    8. 10 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल।
    9. शुद्धि कदम धारा 2.1 के लिए आगे बढ़ें या -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में सेल गोली फ्रीज।
  3. इन विट्रो Refol के लिए समावेश शरीर को अभिव्यक्तिझंकार
    1. अनुक्रमण विश्लेषण का प्रयोग अभिव्यक्ति का निर्माण सत्यापित करने के लिए एक संकेत अनुक्रम शामिल नहीं है। एक संकेत अनुक्रम के अभाव लक्ष्य प्रोटीन प्रत्यक्ष शामिल किए जाने के शरीर के रूप में cytosol में जमा करने के लिए होगा।
    2. अभिव्यक्ति के लिए बैक्टीरिया की एक अभिव्यक्ति तनाव में अभिव्यक्ति का निर्माण रूपांतरण। शामिल किए जाने के शरीर अभिव्यक्ति के लिए, यह प्रेरण (यानी, IPTG, arabinose, आदि) द्वारा अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए संभव विषाक्तता प्रभाव को कम करने के लिए सबसे अच्छा है।
    3. प्लेट लेग अगर एक उचित एंटीबायोटिक युक्त प्लेटों पर बदल कोशिकाओं के 100 μl और सेते रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर उलटा।
    4. एक भी कॉलोनी के साथ एक 5 मिलीलीटर लेग + एंटीबायोटिक संस्कृति inoculating से छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति परीक्षण प्रदर्शन करना।
    5. 2-4 अतिरिक्त कालोनियों के लिए दोहराएँ चरण 1.3.4।
    6. 0.6 की ~ एक आयुध डिपो से 600 झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें।
    7. 1-2 घंटे के लिए एक उपयुक्त inducer के साथ प्रेरित।
    8. सभी टी के लिए अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करेंवह एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर विश्लेषण द्वारा कालोनियों (चरण 1.2.6 देखें)। अच्छी अभिव्यक्ति दिखा कॉलोनी का चयन करें और माध्यम के 12-24 एल का उपयोग बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति प्रदर्शन करते हैं।
      1. 0.6-0.8 के एक आयुध डिपो 600 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के विकास और 3-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरित। जबकि समावेश शरीर को अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति के अन्य प्रकार की तुलना में अधिक मजबूत है, सभी प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रयोगों के साथ के रूप में है, अभिव्यक्ति मध्यम विकास, प्रेरण का समय, प्रेरण के तापमान, और उत्प्रेरण एजेंट की एकाग्रता अलग से सुधार किया जा सकता है।
    9. 10 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल।
    10. शुद्धि कदम धारा 2.2 के लिए आगे बढ़ें या -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में सेल गोली फ्रीज।

2. शोधन

  1. झिल्ली भागों से अलगाव
    नोट: घुलनशील प्रोटीन के विपरीत, अभिन्न झिल्ली प्रोटीन लिपिड bilayer में एम्बेडेड है और इसलिए कर रहे हैंडिटर्जेंट की आवश्यकता होती है आगे की शुद्धि और विश्लेषण (चित्रा 5) के लिए उन्हें निकालने के लिए। अभिव्यक्ति के बाद, एक β बैरल OMP की शुद्धि में पहला कदम झिल्ली अंश से निकासी है।
    1. 5 मिलीलीटर / जी सेल पेस्ट के अनुपात में lysis बफर (50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.4, 200 मिमी NaCl, 10 मिमी 2 MgCl, 50 माइक्रोग्राम / एमएल AEBSF, 5 माइक्रोग्राम / एमएल DNase मैं) में Resuspend कोशिकाओं।
    2. Lyse कोशिकाओं को एक फ्रांसीसी प्रेस या सेल homogenizer का उपयोग। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 XG पर lysed कोशिकाओं स्पिन unlysed कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए।
    3. सतह पर तैरनेवाला एक स्वच्छ ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए उच्च गति (200,000 XG) पर फिर से स्थानांतरण। जिसके परिणामस्वरूप गोली झिल्ली अंश जो ब्याज की प्रोटीन होता है।
    4. एक Dounce homogenizer का उपयोग, resuspend झिल्ली अंश, पहले झिल्ली के हस्तांतरण और फिर solubilization बफर (50 मिमी 2 के.एच. पीओ 4 पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl जोड़ने, 20 मिमी imidazole, पीएच 8.0) (2x एकाग्रता में 20 ग्राम कोशिकाओं प्रति 50 मिलीलीटर), डिटर्जेंट के बिना।
    5. एक छोटे से बीकर में resuspended झिल्ली डालो और डिटर्जेंट (यानी, एन dodecyl-β-D-maltoside (DDM), lauryldimethylamine-एन-ऑक्साइड (LDAO), एन octyl-β-D-glucopyranoside (ओग), ट्राइटन जोड़ने X-100, आदि) धीरे-धीरे ~ के 10x महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) एक अंतिम एकाग्रता के लिए।
    6. 1x solubilization बफर के अंतिम एकाग्रता जब तक पानी के साथ भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5-16 घंटे के लिए हिलाओ, कितनी आसानी से लक्ष्य प्रोटीन झिल्ली से निकाला जाता है पर निर्भर करता है।
      नोट: डिटर्जेंट धीरे धीरे लक्ष्य प्रोटीन निकालने के लिए झिल्ली solubilize के लिए प्रयोग किया जाता है। आयनिक (एसडीएस, deoxycholic एसिड), गैर ईओण (Elugent, बीच, ट्राइटन X-100, ओग, DDM), और zwitterionic (LDAO, लोग): वहाँ है कि यहां इस्तेमाल किया जा सकता है डिटर्जेंट के 3 प्रकार के होते हैं। एक प्रोटीन डिटर्जेंट जटिल है कि शुद्धि चरण के दौरान स्थिर और monodisperse है बहुत झिल्ली प्रोटीन crystallizat की सफलता में सहायता करेगाआयन। डिटर्जेंट, उनके गुणों, सीएमसी जानकारी है, और झिल्ली प्रोटीन और अन्य अनुप्रयोगों की शुद्धि में उनके उपयोग के बारे में अधिक सूचना के आधार पर वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता वेबसाइटों पाया जा सकता है।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 300,000 XG पर solubilized नमूना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला अब डिटर्जेंट solubilized लक्ष्य β बैरल OMP शामिल हैं।
    8. नीचे के रूप में उल्लिखित धारा 2.3 के साथ आगे बढ़ें।
  2. समावेश शरीर से refolding
    नोट: इन विट्रो refolding के लिए, लक्ष्य β बैरल OMP समावेश शरीर में सीधे व्यक्त की है। यहाँ एक लाभ यह है कि इन प्रोटीनों उच्च स्तर पर उत्पादन किया जा सकता है। हालांकि नुकसान यह है कि refolding अक्सर अक्षम है और अगले एक refolding प्रयोग से भिन्न होता है। फिर भी, वहाँ प्रोटीन है कि सफलतापूर्वक संरचनात्मक अध्ययन के लिए refolded कर दिया गया के कई उदाहरण हैं। शामिल किए जाने के शरीर में अभिव्यक्ति के बाद, अब एक प्रयोग refolding के लिए शामिल किए जाने के शव को अलग-थलग करना चाहिएएस।
    1. Lysis बफर में Resuspend कोशिकाओं (50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.4, 200 मिमी NaCl, 10 मिमी 2 MgCl, 50 माइक्रोग्राम / एमएल AEBSF, 5 माइक्रोग्राम / एमएल DNase मैं 4 मिमी 2-मर्केप्टोइथेनाल (बीएमई)) (5 प्रति मिलीलीटर जी सेल पेस्ट)। Lyse या तो एक फ्रांसीसी प्रेस, sonication, या सेल homogenizer का उपयोग।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000 XG पर एक कम गति स्पिन से शामिल किए जाने के शव गोली।
    3. 1.0 एम यूरिया की 25 मिलीलीटर में resuspending एक Dounce homogenizer का उपयोग करके समावेश शरीर को धो लें। फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000 XG पर एक कम गति स्पिन द्वारा गोली।
    4. दोहराएँ कदम 2.2.3 के रूप में आवश्यक।
    5. 10 मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए धोया समावेश शरीर Resuspend / एमएल 8.0 एम यूरिया युक्त बफर का उपयोग (या 6.0 एम guanidinium हाइड्रोक्लोराइड (GdCl)) प्लस डिटर्जेंट (यानी, DDM या LDAO) 2x सीएमसी या उच्च पर।
      नोट: अगर वांछित एक Histidine टैग युक्त झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य के लिए, स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) शुद्धि denaturing सह का उपयोग किया जा सकता हैnditions धारा 2.3 में नीचे उल्लिखित है कि इसी तरह एक प्रारंभिक कदम के रूप में (8.0 एम यूरिया या 6.0 एम GdCl में)।
    6. द्वारा धीरे-धीरे (रातोंरात) refolding प्रतिक्रिया denaturant कमी बफर में डायलिसिस द्वारा denaturant हटाने प्रदर्शन करना।
      नोट: यह यह पूरा करने के लिए डायलिसिस बफर के कई परिवर्तन लग सकता है। वैकल्पिक रूप से, अगर समावेश शरीर पहले एक imac स्तंभ के लिए बाध्य कर रहे हैं, एक refolding प्रतिक्रिया कर सकते हैं, जबकि अभी भी धीरे धीरे बफ़र्स का आदान प्रदान denaturant को दूर करने से स्तंभ के लिए बाध्य है। या तो मामले में, याद है कि यह एक झिल्ली प्रोटीन होता है, इसलिए, डिटर्जेंट लक्ष्य को स्थिर करने के लिए उपस्थित होना चाहिए। इसके अलावा, अगर डिटर्जेंट इस्तेमाल किया जा रहा dialyzable है, यह डायलिसिस बफर (एस) के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 200,000 XG पर refolded नमूने स्पिन। सतह पर तैरनेवाला refolded डिटर्जेंट solubilized लक्ष्य β बैरल OMP शामिल हैं।
    8. नीचे के रूप में उल्लिखित धारा 2.3 के साथ आगे बढ़ें।
  3. शुद्धीकरण मैं का उपयोगमैक, आयन एक्सचेंज, और जेल निस्पंदन
    नोट: प्रोटीन मानते हुए, एक Histidine टैग के साथ अंजाम दिया गया है कि क्या natively व्यक्त या refolded इन विट्रो तरीकों का उपयोग कर, उसके बाद स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) ज्यादा के लिए तरह Histidine टैग की घुलनशील प्रोटीन, सिवाय डिटर्जेंट में रखा जाना चाहिए शुद्धि के लिए किया जाता है बाद के सभी बफ़र्स लक्ष्य β बैरल OMP solubilized और स्थिर रखने के लिए।
    1. एक 1-5 मिलीलीटर IMAC स्तंभ तैयार है या एक prepacked स्तंभ का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर बाद में क्रोमैटोग्राफी चरणों का प्रदर्शन। पानी के साथ फ्लश परिरक्षकों के किसी भी अंश हटाने के लिए। अगर एक स्वचालित शोधन प्रणाली का उपयोग करते हुए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्तंभ स्थापित करें।
    2. IMAC बफर (50 मिमी कश्मीर 2 4 HPO, पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl, 0.1% DDM) और आईमैक बफर बी के 250 मिलीलीटर (50 मिमी कश्मीर 2 4 HPO, पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl, 0.1% की 500 मिलीलीटर की तैयारी DDM, और 1.0 एम imidazole)।
      नोट: अन्य डिटर्जेंट कि मैं इस्तेमाल किया जा सकता हैnclude Cymal -6 (0.05%), ट्राइटन X-100 (0.03%), और LDAO (0.05%)।
    3. IMAC बफर ए के 10 कॉलम की मात्रा का उपयोग कर IMAC स्तंभ संतुलित करना
    4. 25 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन के नमूने लिए imidazole और मिश्रण जोड़ें। 2 मिलीग्राम / मिनट पर equilibrated IMAC स्तंभ पर नमूना लोड। के माध्यम से प्रवाह लीजिए।
    5. 5 स्तंभ की मात्रा बफर बी का उपयोग कर imidazole की सांद्रता में वृद्धि से प्रत्येक के साथ IMAC स्तंभ धो लें (यानी, 25 मिमी, 50 मिमी, 100 मिमी)। 2 मिलीलीटर भागों में washes लीजिए।
    6. 5 स्तंभ संस्करणों के लिए 250 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के साथ नमूना Elute। 2 मिलीलीटर भागों में eluted नमूना ले लीजिए।
    7. के माध्यम से प्रवाह का विश्लेषण करें, धोने भिन्न और क्षालन भिन्न एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण का उपयोग (चरण 1.2.6 देखें) 280 एनएम पर उनकी absorbance पर आधारित है। के रूप में एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण द्वारा सत्यापित लक्ष्य β बैरल OMP युक्त भिन्न पूल।
    8. जमा नमूने के लिए TEV प्रोटीज जोड़कर 6x-Histidine टैग निकालें (अनुसारनिर्माता प्रोटोकॉल) और कोमल कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर incubating करने के लिए।
    9. फिर से (के माध्यम से प्रवाह) cleaved टैग और किसी भी uncleaved नमूना से लक्ष्य β बैरल OMP अलग करने के लिए एक imac स्तंभ पर नमूना / प्रोटीज समाधान लोड। प्रवाह के माध्यम से चिपके रहते नमूना टैग की कमी शामिल होंगे।
      नोट: यह भी तरह किसी भी प्रोटीज को दूर करेगा TEV उनकी है, जो भी एक गैर cleavable 6x-Histidine टैग ही है। अन्यथा, अन्य तरीकों पाचन के बाद प्रोटीज को दूर करने की जरूरत होगी।
    10. वैकल्पिक रूप से, प्रदर्शन आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी आगे नमूना शुद्ध करने के लिए। के लिए स्तंभ में इस्तेमाल किया जा करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें, सभी बफ़र्स में डिटर्जेंट शामिल करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा।
    11. इस तरह 25 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl, 1% ओग के रूप में क्रिस्टलीकरण के लिए तैयार करने के लिए, एक बफर डिटर्जेंट युक्त में एक जेल निस्पंदन स्तंभ पर नमूना लोड, क्रिस्टलीकरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    12. 1 मिलीलीटर अंशों लीजिए और उसी का विश्लेषणएनजी एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (देखें चरण 1.2.6) 280 एनएम पर उनकी absorbance पर आधारित है। 280 एनएम पर absorbances के साथ पूल अंशों वे लक्ष्य के रूप में प्रोटीन होते हैं। ~ 10 मिलीग्राम / एमएल के लिए ध्यान देना।
      नोट: अगर वांछित, उचित तह के रूप में नीचे उल्लिखित एक गर्मी परिवर्तनीयता परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है।
  4. हीट परिवर्तनीयता परख
    ध्यान दें: एक विधि शुद्ध β बैरल की उचित तह OMPs गर्मी परिवर्तनीयता एक अर्द्ध-देशी एसडीएस पृष्ठ 22 का उपयोग कर assays प्रदर्शन करने के लिए है पर नजर रखने के लिए। इधर, unheated नमूने है कि ठीक से जोड़ रहे हैं आम तौर पर उन है कि गर्मी विकृत कर रहे हैं से अलग ढंग से पलायन होगा। यह संपत्ति बीटा प्रति बैरल पर OMPs अद्वितीय और व्यापक रूप से झिल्ली प्रोटीन के इस परिवार का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. नमूने की तैयारी करने से पहले, जेल तंत्र को इकट्ठा। शुरू करने के लिए, एक बर्फ बाल्टी में बफर टैंक जगह और बर्फ के साथ पूरी तरह से चारों ओर। एक घर में डाली या धारक में वाणिज्यिक मूल निवासी ढाल जेल डालें और टैंक में जगह है। टी भरेंवह चल बफर ठंड 1x एमईएस के साथ पूरी तरह से टैंक (50 मिमी 2 [एन morpholino] ethanesulfonic एसिड, 50 मिमी Tris आधार, 1 मिमी EDTA, 0.1% एसडीएस, पीएच 7.3)।
    2. पिपेट दो 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में नमूना (10 मिलीग्राम / एमएल) के 0.25 μl। 'उबला हुआ' और 'आर टी' के रूप में अन्य के रूप में एक लेबल।
    3. प्रत्येक के लिए नमूना बफर के 9.75 μl जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण। दोनों नमूने लिए, 2x एसडीएस लोड हो रहा है बफर (100 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 6.8, 2% एसडीएस, 0.2% bromophenol नीले, और 20% ग्लिसरॉल) के 10 μl जोड़ें और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण।
    4. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 'उबला हुआ' नमूना उबाल लें, जबकि आरटी पर 'आर टी' नमूना छोड़ने। 'उबला हुआ' नमूना संक्षेप में स्पिन।
    5. लोड preassembled देशी जेल पर दोनों नमूने के 20 μl। लगातार 150 वी पर 60 मिनट के लिए चलाने के लिए जेल निकालें और धुंधला समाधान में लेना परिणाम कल्पना करने के लिए।

3. Crystallization

नोट: दोनों के क्रिस्टलीकरण के लिएघुलनशील और झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य है, यह नमूना पवित्रता और स्थिरता (यानी, सबसे अच्छा डिटर्जेंट, ligands, सहकारकों, आदि) को अधिकतम करने के लिए मानक प्रोटोकॉल है। (1) डिटर्जेंट, (2) bicelle, और (3) lipídic घन चरण (LCP) (चित्रा 6) 23: सामान्य में झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य crystallizing के लिए वर्तमान कार्यप्रणाली तीन प्रमुख दृष्टिकोण है कि bilayer एम्बेडेड प्रोटीन के amphiphilic आवश्यकताओं को पूरा शामिल हैं। एक nanoliter क्रिस्टलीकरण रोबोट का उपयोग पुरजोर सिफारिश की है जब संभव आदेश संरचना निर्धारण (चित्रा 7) सहायता करने के उद्देश्य से उपकरण में स्थिति है कि किसी नमूने मात्रा के लिए जांच की जा सकती है, की संख्या है, साथ ही, हाल के अग्रिमों के उपयोग को बढ़ाने के लिए।

  1. Crystallization का उपयोग कर डिटर्जेंट
    1. एक डिटर्जेंट solubilized प्रोटीन नमूना ~ 10 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता में है कि प्राप्त करते हैं। वैकल्पिक रूप से, एडिटिव 1,2,3-heptanetriol सीधे नमूना करने के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए 3% की जोड़ने deterg कम करने के लिएईएनटी मिसेल आकार।
    2. particulates और वर्षा को हटाने के लिए एक 0.22 माइक्रोन केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग नमूना फ़िल्टर।
    3. एक crystallization रोबोट का उपयोग, व्यापक मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण या तो फांसी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 96 स्क्रीन का उपयोग कर या ~ 200 nl प्रोटीन नमूना और ~ 200 nl क्रिस्टलीकरण बफर की रचना की बूंदों के साथ बूंद वाष्पीकरण विधि बैठे स्क्रीनिंग प्रदर्शन करते हैं।
    4. ~ 21 डिग्री सेल्सियस पर क्रिस्टलीकरण प्लेटें सेते हैं। प्लेटें एक stereomicroscope का उपयोग क्रिस्टल विकास के लिए साप्ताहिक निरीक्षण किया।
    5. (बढ़ती / नमक या तेज़ सांद्रता, बफर पीएच, ऊष्मायन के तापमान को कम करने, और / या प्रोटीन एकाग्रता) एक व्यवस्थित तरीके से क्रिस्टलीकरण हालत के घटकों को अलग से क्रिस्टलीकरण सुराग अनुकूलन।
  2. Crystallization Bicelles का प्रयोग
    नोट: bicelle तकनीक के एक अधिक विस्तृत प्रदर्शन पहले से Ujwal और अब्रामसन 24 से वर्णित किया गया है।
    1. तैयार करें या एक 3 खरीद1 प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार 25: 2.8 के अनुपात में CHAPSO: 5% bicelle DMPC से मिलकर मिश्रण। अन्य सांद्रता भी यत्न किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से, के रूप में अन्य लिपिड और डिटर्जेंट, आवश्यक के रूप में।
    2. एक डिटर्जेंट solubilized प्रोटीन नमूना ~ 10 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता में है कि प्राप्त करते हैं।
    3. 1 वी / वी: 4 का मूल्य उस अनुपात में, bicelle मिश्रण जोड़ें बर्फ पर (प्रोटीन: bicelle) (जैसे, प्रोटीन के 40 μl के लिए bicelle मिश्रण के 10 μl जोड़ें और pipetting द्वारा तेजी से मिक्स)।
    4. बर्फ 30-60 मिनट पर सेते हैं।
      नोट: प्रोटीन: bicelle समाधान मुख्य रूप से साफ रहना चाहिए लेकिन अक्सर थोड़ा अपारदर्शी बदल सकते हैं। हालांकि, अगर प्रोटीन: bicelle समाधान दूधिया सफेद है, यह दर्शाता वर्षा हो जाती है, तो दूसरे चर यत्न किया जाना चाहिए (यानी, डिटर्जेंट, बफर, आदि)। नए नमूने, कर छोटे पैमाने पर परीक्षण (8 μl प्रोटीन और 2 μl bicelles) के लिए स्केलिंग अनावश्यक नमूना नुकसान को रोकने के लिए करने से पहले स्थिरता को सत्यापित करने के लिए सिफारिश की है।
    5. एक crystallization रोबोट का उपयोग, व्यापक मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण या तो फांसी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 96 स्क्रीन का उपयोग कर या ~ 200 nl प्रोटीन नमूना और ~ 200 nl क्रिस्टलीकरण बफर की रचना की बूंदों के साथ बूंद वाष्पीकरण विधि बैठे स्क्रीनिंग प्रदर्शन करते हैं।
    6. ~ 21 डिग्री सेल्सियस पर क्रिस्टलीकरण प्लेटें सेते हैं। प्लेटें एक stereomicroscope का उपयोग क्रिस्टल विकास के लिए साप्ताहिक निरीक्षण किया।
    7. (बढ़ती / नमक या तेज़ सांद्रता, बफर पीएच, ऊष्मायन के तापमान को कम करने, और / या प्रोटीन एकाग्रता) एक व्यवस्थित तरीके से क्रिस्टलीकरण हालत के घटकों को अलग से क्रिस्टलीकरण सुराग अनुकूलन।
  3. Crystallization lipídic घन चरण का उपयोग करना (LCP)
    नोट: LCP तकनीक के एक अधिक विस्तृत प्रदर्शन पहले से लियू और Cherezov 26,27 से वर्णित किया गया है।
    1. एक डिटर्जेंट solubilized प्रोटीन नमूना ~ 20 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता में है कि प्राप्त करते हैं।
    2. पूर्व गर्म monoolein करने के लिए ~ 40 डिग्री सेल्सियस। भार60 μl एक गैस तंग 100 μl सिरिंज और दूसरे में 40 μl प्रोटीन नमूना में monoolein।
    3. एक मिश्रण युग्मक का प्रयोग, सीरिंज कनेक्ट, सावधान किया जा रहा एयर परिचय नहीं।
    4. दूसरे के लिए एक सिरिंज से मिश्रण को आगे बढ़ाने के लिए पूरी तरह से जब तक नमूना पारदर्शी और समरूप हो जाता है सिरिंज plungers पर बारी दबाव लागू करने से धीरे मिलाएं।
    5. LCP तरीकों के लिए बनाया गया एक क्रिस्टलीकरण रोबोट का उपयोग, व्यापक मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण 100 nl प्रोटीन नमूना और 750 nl क्रिस्टलीकरण बफर की रचना की बूंदों के साथ सैंडविच शैली क्रिस्टलीकरण प्लेट (0.1 मिमी मोटाई में अच्छी तरह से) के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 96 स्क्रीन का उपयोग स्क्रीनिंग प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: ड्रॉप अनुपातों अगर जरूरत समायोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, ठोस कवर (यानी, कांच या प्लास्टिक की मोटी), जो अच्छी तरह से बूंदों के बजाय फिल्मों पतली है, जो बूंदों के रूप में प्लेटों नियंत्रित किया जाता है के बारे में अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए करते हैं समर्थन सिफारिश कर रहे हैं।
    6. क्रिस्टलीकरण पी सेतेlates ~ 21 डिग्री सेल्सियस पर। प्लेटें एक stereomicroscope का उपयोग क्रिस्टल विकास के लिए साप्ताहिक निरीक्षण किया।
    7. (बढ़ती / नमक या तेज़ सांद्रता, बफर पीएच, ऊष्मायन के तापमान को कम करने, और / या प्रोटीन एकाग्रता) एक व्यवस्थित तरीके से क्रिस्टलीकरण हालत के घटकों को अलग से क्रिस्टलीकरण सुराग अनुकूलन।

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Representative Results

YiuR एक TonB निर्भर लोहे ट्रांसपोर्टर Yersinia pestis के खिलाफ एक ख्यात टीका लक्ष्य है। यह मूल रूप से एक माइक्रोएरे परख का उपयोग पहचान की थी। इधर, कदम है कि एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग कर YiuR की संरचना निर्धारित करने के लिए ले जाया गया (9 चित्रा) रेखांकित कर रहे हैं। क्लोनिंग के लिए, (शून्य से एन टर्मिनल संकेत अनुक्रम) YiuR के डीएनए अनुक्रम पीसीआर जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित और एक सदिश एक एन टर्मिनल pelB संकेत अनुक्रम और 10x-Histidine समानता टैग एक TEV प्रोटीज साइट के द्वारा पीछा युक्त में subcloned था। अभिव्यक्ति के लिए, YiuR युक्त प्लाज्मिड 600 ~ 0.5 ओवर ड्राफ्ट के लिए BL21 (DE3) सक्षम कोशिकाओं और एक भी एक 5 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया कॉलोनी में तब्दील हो गया था। बारह टीबी माध्यम की 750 मिलीलीटर की बोतल युक्त तो स्टार्टर संस्कृति के 1 मिलीलीटर के साथ टीका और 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 डी विकसित करने के लिए (220 rpm पर मिलाते हुए) की अनुमति दी गई। कोशिकाओं तो काटा गया, 150-200 के बारे में उत्पादनकुल सेल का पेस्ट जी, जो था फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में ठंडा और उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।

YiuR की शुद्धि के लिए, कोशिकाओं के 20 ग्राम (1.8 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 2.7 मिमी KCl, 137 मिमी NaCl, 7.4 पीएच 10 मिमी ना 2 HPO 4,) DNase मैं के साथ आरटी पर सरगर्मी से 1x पीबीएस के 120 मिलीलीटर में resuspended थे और AEBSF जोड़ा जा रहा है। सेल एक homogenizer के माध्यम से दो गुजरता द्वारा किया गया था। lysate तो centrifuged था 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर (अटूट कोशिकाओं और शामिल किए जाने के शव नीचे स्पिन करने के लिए)। सतह पर तैरनेवाला झिल्ली अंश (YiuR) युक्त गोली के साथ 60 मिनट के लिए 235,000 XG पर फिर centrifuged किया गया था। झिल्ली फिर एक Dounce homogenizer का उपयोग 1x पीबीएस की 100 मिलीलीटर में resuspended थे। YiuR solubilized था, 5% अंतिम एकाग्रता में Elugent का उपयोग कर झिल्ली से निकाले / 4 डिग्री सेल्सियस पर (16 घंटा तक) रात भर क्रियाशीलता। solubilized झिल्ली फिर 60 मिनट के लिए 371,000 XG पर फिर centrifuged थे, सु साथYiuR सहित solubilized अंश युक्त pernatant। YiuR अलग करने के लिए, आईमैक बफर (1x पीबीएस, 0.1% DDM) और बफर बी (1x पीबीएस, 1 एम imidazole, 0.1% DDM), 30-50 मिमी से imidazole सांद्रता के साथ धोया और 250-500 मिमी के साथ eluted उपयोग किया गया था । एन टर्मिनल 10x-Histidine टैग निकालने के लिए, TEV साथ ऊष्मायन अपने प्रोटीज रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस बफर में डायलिसिस के दौरान किया गया था। नमूना तो के माध्यम से ध्यान केंद्रित किया, dialyzed प्रवाह एक imac स्तंभ पर पारित किया गया था फिर से, और फिर 50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5 में एक आयन एक्सचेंज स्तंभ पर एक 0-1.0 एम NaCl ढाल का उपयोग कर आगे अलग कर दिया। YiuR युक्त भिन्न तो जमा, केंद्रित और 25 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl, और 0.05% LDAO का उपयोग कर एक जेल निस्पंदन स्तंभ पर दौड़ा रहे थे। YiuR युक्त भिन्न तो जमा और क्रिस्टलीकरण के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल के लिए ध्यान केंद्रित किया गया।

ब्रॉड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग तो प्रदर्शन किया गया था और शर्तों चुना गयाकि कुछ प्रारंभिक diffracting क्रिस्टल का उत्पादन किया। इसके अलावा अनुकूलन बड़ा क्रिस्टल जो देशी एक्स-रे विवर्तन डेटा इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया करने के लिए नेतृत्व किया। चित्रा 8 में दिखाया गया क्रिस्टल क्रिस्टल एक यहाँ प्रस्तुत तरीकों का उपयोग कर प्राप्त कर सकते हैं के प्रतिनिधि हैं। डिटर्जेंट स्क्रीनिंग और bicelles से क्रिस्टल आम तौर पर घुलनशील प्रोटीन के लिए प्राप्त क्रिस्टल के रूप में के रूप में बड़े हो सकता है; हालांकि, LCP से उन लगभग हमेशा बहुत छोटे होते हैं। डेटा काफी अच्छा आणविक प्रतिस्थापन जो 2.65 एक संकल्प के लिए दृढ़ संकल्प की संरचना करने के लिए नेतृत्व के लिए इस्तेमाल किया जाना था।

आकृति 1
चित्रा 1. पूरी तरह से एकीकृत झिल्ली प्रोटीन के दो प्रकार α-पेचदार और β बैरल रहे हैं। यहाँ दिखाया β2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर (पी डी बी कोड 2RH1, α-पेचदार) और TonB निर्भर ट्रांसपोर्टर BtuB (पी डी बी कोड 1NQE के साथ प्रत्येक के उदाहरण हैं,बीटा बैरल)। जबकि नीचे पंक्ति झिल्ली देखने से पता चलता शीर्ष पंक्ति बाह्य दृश्य दिखाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. β बैरल OMPs कई अलग अलग कार्यों की सेवा और विविध संरचनाओं हो सकता है। α-पेचदार झिल्ली प्रोटीन एक या एक से अधिक transmembrane डोमेन शामिल कर सकते हैं, वहीं β बैरल OMPs 8-26 किस्में से लेकर और हर कतरा परिचित पड़ोसी किस्में के साथ सूचना का आदान प्रदान। आउटर के अवशेष, जो झिल्ली के साथ बातचीत, जबकि आंतरिक अवशेष, जो विलायक के साथ बातचीत, आम तौर पर ध्रुवीय और हाइड्रोफिलिक हैं आम तौर पर हाइड्रोफोबिक हैं। शीर्ष पंक्ति बाह्य दृश्य दिखाता है, मध्य पंक्ति झिल्ली देखने से पता चलता है, और नीचे पंक्ति periplasmi चलताग देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. आम β बैरल OMPs के दो प्रकार के उदाहरण हैं। वाम, TonB निर्भर ट्रांसपोर्टर FEPA (पी डी बी कोड 1FEP) की संरचना, बाह्य (ऊपर) का चित्रण, झिल्ली (मध्य) और periplasmic (नीचे) के विचार। β बैरल डोमेन हरे रंग में संकेत दिया है, जबकि प्लग डोमेन मैजेंटा में है। ठीक है, autotransporter एस्टा (पी डी बी कोड 3KVN) की संरचना, बाह्य (ऊपर) का चित्रण, झिल्ली (मध्य) और periplasmic (नीचे) के विचार। Β बैरल डोमेन सोने में संकेत दिया है, जबकि यात्री डोमेन नीले रंग में है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की पर।

चित्रा 4
चित्रा 4. β बैरल OMPs के उत्पादन के लिए क्लोनिंग और अभिव्यक्ति पाइपलाइन के योजनाबद्ध। क्लोन और या तो मूल झिल्ली अभिव्यक्ति (बाएं) द्वारा एक लक्ष्य OMP को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल पाइप लाइन के योजनाबद्ध या समावेश शरीर में अभिव्यक्ति द्वारा refolding (दाएं) के लिए। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. β बैरल OMPs के अलगाव के लिए शुद्धि पाइपलाइन के योजनाबद्ध। OMPs की निकासी कि सीधे ओम में व्यक्त किया गया है के लिए इस्तेमाल पाइप लाइन के योजनाबद्ध। इधर, लक्ष्य OMP निकालने हो गया हैएक उपयुक्त साबुन के साथ solubilization द्वारा झिल्ली से एड और फिर IMAC द्वारा शुद्ध, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, और जेल निस्पंदन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 β बैरल OMPs के क्रिस्टल से बढ़ के लिए क्रिस्टलीकरण पाइपलाइन के योजनाबद्ध। तीन तरीकों β बैरल OMPs के क्रिस्टलीकरण के लिए उपयोग किया जा सकता डिटर्जेंट स्क्रीनिंग, bicelles, और lipídic घन चरण (LCP) भी शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7 चित्रा क्रि में 7 नए उपकरण है कि काफी β बैरल OMPs के निर्धारण संरचना करने के लिए योगदान दिया है। उदाहरण क्रिस्टलीकरण रोबोट / LCP रोबोट (ए), यूवी माइक्रोस्कोप (बी), Chiral क्रिस्टल के दूसरे क्रम Nonlinear इमेजिंग (SONICC) दृश्य (सी), रोबोट pucks / रोबोट (डी), rastering / वेक्टर / पेचदार डेटा संग्रह तरीकों (ई शामिल ), और microfocus बीम (एफ)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा क्रिस्टल प्रोटोकॉल से उत्पन्न के प्रतिनिधि छवि। डिटर्जेंट स्क्रीनिंग और bicelles से क्रिस्टल क्रिस्टल के रूप में के रूप में बड़ा हो सकता हैआम तौर पर घुलनशील प्रोटीन के लिए प्राप्त; हालांकि, LCP से उन लगभग हमेशा बहुत छोटे होते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
9 चित्रा क्रिस्टल करने के निर्माणों से Yersinia pestis। समग्र YiuR की संरचना निर्धारण के लिए इस्तेमाल पाइप लाइन से ख्यात टीका लक्ष्य YiuR के लिए दृढ़ संकल्प संरचना करने के लिए, कदम क्लोन करने के लिए लिया illustrating, एक्सप्रेस, शुद्ध, मणिभ, और संरचना का समाधान। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

β बैरल OMPs ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, माइटोकॉन्ड्रिया और क्लोरोप्लास्ट में आवश्यक भूमिकाओं की सेवा और कहा कि इन संबंधित अंगों की बाहरी झिल्ली पर आवश्यक आणविक तंत्र के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान करते हैं संरचनात्मक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य कर रहे हैं। हालांकि, संरचनात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूना उत्पादन हमेशा सीधा नहीं है और इसलिए, एक सामान्य पाइपलाइन संरचना निर्धारण के लिए लक्ष्य β बैरल OMPs के लिए पर्याप्त मात्रा के उत्पादन के लिए प्रस्तुत किया जाता है, विस्तार से क्रिस्टल करने के निर्माणों से प्रक्रिया को समझा। इन प्रोटोकॉल परीक्षण किया गया है जबकि और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से सबसे OMPs के लिए काम करने के लिए मिला है, वहाँ उस में सीमाओं कुछ लक्ष्यों को, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रिया और क्लोरोप्लास्ट के लिए है, जो अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए अन्य तरीकों की आवश्यकता हो सकती है कि वहाँ हो रहे हैं। इस तरह के रूप में, यहाँ तरीकों सबसे परियोजनाओं है कि ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से OMPs शामिल है, अभी तक अभिव्यक्ति के स्तर के लिए लागू किया जाना चाहिएशुद्ध नमूना की है और राशि लक्ष्य OMP के आधार पर अलग अलग होंगे।

इसमें संरचनात्मक अध्ययन के लिए β बैरल OMPs की अभिव्यक्ति के लिए दो सामान्य दृष्टिकोण, कर रहे हैं (1) सीधे इन विट्रो refolding के लिए बाहरी झिल्ली और शामिल किए जाने के शरीर के लिए (2) अभिव्यक्ति में विवो अभिव्यक्ति में। इन विवो अभिव्यक्ति दृष्टिकोण के लिए, β बैरल OMPs ई की बाहरी झिल्ली को लक्षित कर रहे हैं कोलाई जहां वे natively मुड़ा और झिल्ली से सीधे अलग कर रहे हैं। झिल्ली को अभिव्यक्ति पसंदीदा तरीका है क्योंकि लक्ष्यों को अधिक ठीक से तह किया जा करने की संभावना है। हालांकि इस दृष्टिकोण आमतौर पर समग्र प्रोटीन का स्तर कम पैदावार, यह कभी कभी इन विट्रो refolding से संबंधित जटिलताओं से बचा जाता है। कई β बैरल OMPs सफलतापूर्वक संरचना निर्धारण 4,5,11 के लिए इस तरह से व्यक्त किया गया है। सफलता अक्सर एक प्रणाली है कि एक T7 बढ़ावा देने से निम्न स्तर के विधान अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है का उपयोग कर हासिल की हैआर, लेकिन अन्य प्रणालियों जो प्रेरण पर भरोसा करते हैं (यानी, IPTG, arabinose) अभिव्यक्ति के लिए भी नियमित रूप से सफलता के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं।

सीधे बाहरी झिल्ली में अभिव्यक्ति एक एन टर्मिनल संकेत अनुक्रम जो, सेक translocon को राइबोसोम-नवजात श्रृंखला जटिल निर्देशन periplasm में नवजात β बैरल OMP के स्राव के लिए है करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन की आवश्यकता है। संकेत अनुक्रम भीतर की झिल्ली की periplasmic तरफ cleaved है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है संकेत अनुक्रम पूर्व में होना है कि किसी भी एन टर्मिनल टैग लक्ष्य के लिए कहा। नवजात β बैरल OMP तो बाहरी झिल्ली 2,3 में सम्मिलन के लिए बेम जटिल करने के लिए periplasm के माध्यम से chaperones से ले रही है।

लक्ष्य है कि झिल्ली में overexpressed नहीं किया जा सकता है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण इन विट्रो 28-30 refolding लिए शामिल किए जाने निकायों में अभिव्यक्ति है। यह दृष्टिकोण आम तौर पर उच्च स्तर और मजबूत अभिव्यक्ति ओ में यह परिणामलक्ष्य प्रोटीन एफ। हालांकि, यह स्थितियों refolding की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के रूप में refolding अक्षम हो सकता है। इसके अलावा, यह परख करने के लिए जब β बैरल लक्ष्य OMP ठीक से जोड़ रहा है मुश्किल हो सकता है। फिर भी, वहाँ प्रोटीन है कि सफलतापूर्वक OMPA 31, बीमार 19, OmpF 32, और 33 VDAC सहित संरचनात्मक अध्ययन के लिए refolded कर दिया गया के कई उदाहरण हैं। क्लोन है कि (natively या समावेश शरीर में) सभी पर अभिव्यक्त नहीं है या व्यक्त करते हैं लेकिन झिल्ली (natively) में ठीक से इकट्ठे नहीं कर रहे हैं, एक और अधिक बारीकी से ई की कि सदृश β बैरल परिवर्तनशील की कोशिश कर सकते कोलाई 34,35। बैरल डोमेन के β-संकेत में अमीनो एसिड अनुक्रम काफी लक्ष्य β बैरल OMP 11,34 के दोनों उचित जीवजनन और अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं बेम जटिल और β-संकेत अनुक्रम में बदलाव से मान्यता और विधानसभा के लिए महत्वपूर्ण है 35। लक्ष्य के समुचित एकीकरण β बर्रएल OMP झिल्ली विभाजन और डिटर्जेंट extractability गर्मी परिवर्तनीयता assays के द्वारा पीछा के लिए स्क्रीनिंग द्वारा नजर रखी जा सकती है।

डिटर्जेंट micelles की उपस्थिति में झिल्ली प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण सबसे पुरानी तकनीक है और पारंपरिक घुलनशील प्रोटीन crystallization के उपकरण और रणनीतियों के लिए आसान अनुकूलन की अनुमति देता है। झिल्ली डिटर्जेंट अणुओं के साथ एम्बेडेड क्षेत्रों मास्किंग द्वारा, केंद्रित प्रोटीन घुलनशील प्रोटीन (जैसे, क्रिस्टलीकरण मां शराब के साथ मिश्रित और एक वाष्प प्रसार तंत्र है कि प्रोटीन बूंद की धीमी गति से निर्जलीकरण का कारण बनता में संलग्न) के लिए एक समान फैशन में इलाज किया जा सकता है। जबकि अवधारणा में सरल, डिटर्जेंट विशेषताओं और गुणों के सामान्य क्रिस्टलीकरण चुनौतियों के शीर्ष पर जटिलता का एक महत्वपूर्ण परत जोड़ें। विशेष रूप से, एक साबुन की आणविक चरित्र अनुभव से दिए गए लक्ष्य को प्रोटीन, मिसेल आकार, सिर समूह polarity (ऋणात्मक, cationic, गैर ईओण, या सहित अनुरूप होना चाहिएzwitterionic), और हाइड्रोकार्बन श्रृंखला लंबाई, इनमें से प्रत्येक के समाधान में लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन की स्थिरता को प्रभावित करते हैं। इस दृष्टिकोण की कमियां गैर देशी रासायनिक वातावरण, सतह क्षेत्रों है कि क्रिस्टल संपर्क, और डिटर्जेंट एकाग्रता मुद्दों फार्म सकता है की क्षमता obscuring शामिल हैं।

Bicelles लिपिड और amphiphiles (जैसे, डिटर्जेंट या लघु श्रृंखला लिपिड) कि व्यक्तिगत कणों कि एक bilayer संरचना झिल्ली कोशिकाओं 36,37 में पाया करने के लिए इसी तरह की नकल में इकट्ठा का मिश्रण हैं। amphiphile मास्क इस bilayer जहां यह डिटर्जेंट क्रिस्टलीकरण में micelles के लिए एक समान फैशन में अपने किनारों पर सामने आ रहा है की हाइड्रोफोबिक कोर। यह मदद करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन को स्थिर एक अधिक देशी-तरह के माहौल प्रदान करता है।

झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य भी lipídic घन चरण (LCP) तरीकों 38 के साथ सघन जा सकता है। LCP एक mesophase लिपिड और पानी के मिश्रण द्वारा गठित, में हैजो एक सतत bilayer विलायक चैनलों के दो गैर पारस्परिक नेटवर्क से रिस चुका है। इस तीन आयामी संरचना एक बड़े पैमाने पर देशी-तरह के माहौल में लिपिड एम्बेडेड झिल्ली प्रोटीन के प्रसार की अनुमति देता है और क्रिस्टल संपर्कों प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक सतहों के बीच के रूप में करने की अनुमति देता है और जब तक उनके आदेश को बढ़ाने क्रिस्टल के समग्र विलायक सामग्री कम हो जाती है। 1990 के दशक में अपनी शुरुआत के बाद से, LCP तकनीक कई मायावी झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य के ढांचे का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हो गया है, rhodopsins 39,40 और GPCRs 41-43 जैसे। उच्च throughput स्क्रीन में LCP के उपयोग मोटी monoolein सामान्यतः LCP के लिए इस्तेमाल के रूप में विशेष प्रावधान (यानी, LCP विशेष रोबोट, गैस तंग सीरिंज, LCP वितरण उपकरण, सैंडविच क्रिस्टलीकरण प्लेट आदि) पारंपरिक nanoliter तरल से निपटने के द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है की आवश्यकता रोबोट।

जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी एक अत्यंत महत्वपूर्ण कदम हैसामान्य में झिल्ली प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण के लिए है क्योंकि यह कैसे चुना डिटर्जेंट स्थिर झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य है, जो वर्णलेख द्वारा देखे जा सकते हैं के लिए है के बारे में जानकारी अर्जित करता है। शून्य मात्रा, प्रतिधारण बार, और चोटियों के आकार में नमूने की राशि की तुलना करके, समग्र स्थिरता और नमूने के monodispersity पहुँचा जा सकता है। एक आदर्श नमूना कोई नमूना शून्य मात्रा में खो करने के लिए बहुत कम होता है और एक गाऊसी वितरण के साथ एक एकल सममित क्षालन चोटी होगा। डिटर्जेंट सी 8 ई 4 (0.8%), ओग (1.0%), और LDAO (0.05%) नियमित तौर पर सफलता के साथ β बैरल OMPs के क्रिस्टलीकरण के लिए इस्तेमाल किया और अच्छे लोगों के साथ शुरू करने के लिए कर रहे हैं। आदर्श रूप में, छोटे पैमाने पर प्रयोग जो निर्धारित करने के क्रिस्टलीकरण के लिए सबसे उपयुक्त हैं डिटर्जेंट के कई डिटर्जेंट या मिश्रण की तुलना किया जाता है। पाए जाते हैं कि उन सबसे स्थिर तो लक्ष्य β-बीए की बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं होने के लिएrrel OMP और crystallization परीक्षण के लिए।

एक बार जब क्रिस्टल लक्ष्य β बैरल OMP, सीसा अनुकूलन के बनते हैं (यानी, एडिटिव स्क्रीनिंग, क्रायो स्क्रीनिंग, डिटर्जेंट additive स्क्रीनिंग, आदि) और घुलनशील प्रोटीन लक्ष्य के लिए इसी तरह की अन्य तकनीकों के कुछ मतभेदों के साथ पीछा किया जा सकता है। हालांकि, वहाँ कुछ हाल ही में अग्रिम कि अत्यंत उपयोगी होते हैं जब झिल्ली प्रोटीन के साथ काम कर रहे हैं। विशेष रूप से, झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल अक्सर कारणों की एक किस्म के लिए उनकी मां शराब के भीतर का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है। झिल्ली प्रोटीन अक्सर अपेक्षाकृत छोटे क्रिस्टल के रूप में और झूठी सकारात्मक क्रिस्टल अनुकूलन गुमराह कर सकते हैं। LCP तकनीक विशेष रूप से उपस्थित अतिरिक्त चुनौतियों, अत्यधिक चिपचिपा, अक्सर अपारदर्शी वातावरण में जो क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं दी। रणनीतियाँ संबोधित करने के लिए इन मुद्दों को अनुमति देने के लिए स्वाभाविक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन क्रिस्टल प्रतिष्ठित किया जा एफ, प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन के रूप में पराबैंगनी माइक्रोस्कोप (यूवी) के उपयोग में शामिलROM गैर fluorescing नमक और डिटर्जेंट क्रिस्टल (चित्रा 7)। चुनौतियां, रहने हालांकि, प्रोटीन क्रिस्टल कि तेज़ के क्षेत्र के भीतर फार्म की सकारात्मक पहचान में। क्रिस्टल भी SONICC प्रौद्योगिकी 44 द्वारा कार्यान्वित के रूप में, जब femtosecond स्कैनिंग लेजर दालों द्वारा imaged सबसे अनुकृति क्रिस्टल की आवृत्ति को दोगुना प्रभाव के शोषण से पता लगाया जा सकता है। इस उच्च संकल्प, उच्च विपरीत तकनीक ढक स्थितियों से submicron क्रिस्टल भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

कटाई झिल्ली प्रोटीन मानक क्रि तकनीक का उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से साबुन और bicelle क्रिस्टलीकरण के लिए। पाशन एक कम बढ़ाई माइक्रोस्कोप और एक क्रिस्टल-बढ़ते पाश (यानी, नायलॉन फाइबर, तार, या बहुलक) का उपयोग कर हाथ से किया जाता है। अतिरिक्त विलायक और क्रायो संरक्षण की बाती भी मानक प्रक्रियाओं क्रायोजेनिक तरल में ठंड जब β बैरल OMP क्रिस्टल कटाई कर रहे हैं डुबकी से पहले। हालांकि, फसलLCP उगाया क्रिस्टल के आईएनजी विशेष समस्या प्रस्तुत करता है, खासकर अगर सैंडविच प्लेटों से सीधे कटाई, के रूप में क्रिस्टल का उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है और आसानी से माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा नहीं जा सकता है। इसके अलावा, LCP में उगाया क्रिस्टल कभी कभी थोक में काटा जाना चाहिए क्योंकि LCP मिश्रण आसानी से पाश के भीतर अलग नहीं किया जा सकता है।

β बैरल OMPs के लिए डेटा संग्रह केवल कुछ अतिरिक्त विचार के साथ घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल के साथ के रूप में किया जा सकता है। डिटर्जेंट और bicelle तरीकों की वृद्धि हुई क्रिस्टल का आकार अक्सर घुलनशील प्रोटीन के साथ हो उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं, वहीं LCP विधि द्वारा उगाई क्रिस्टल लगभग हमेशा काफी छोटे होते हैं। इसके अलावा, क्योंकि नमूने LCP मैट्रिक्स से काटा अक्सर कई क्रिस्टल जो निरीक्षण करने के लिए मुश्किल है, एक विकिरण स्रोत है कि मिनी-बीम और पाश rastering क्षमताओं जो व्यवस्थित क्रिस्टल के पदों का पता लगाने के लिए पूरे पाश स्कैन कर सकते हैं diffra पर आधारित का उपयोग करना चाहिए रहे होते हैंction (चित्रा 7)। LCP क्रिस्टल के छोटे आकार भी उन्हें विशेष रूप से विकिरण क्षति के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है। इसलिए कई क्रिस्टल से डेटा अक्सर क्रम में एक पूरा डाटासेट को इकट्ठा करने में विलय कर रहे हैं।

एक बार अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल प्राप्त कर रहे हैं और एक पूरा डाटासेट एकत्र किया जाता है, β बैरल OMPs के लिए संरचना निर्धारण ध्यान में रखते हुए कि झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल आम तौर पर एक उच्च विलायक सामग्री का प्रदर्शन घुलनशील प्रोटीन के लिए के रूप में एक ही प्रक्रियाओं का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। सभी क्रि लक्ष्य के साथ के रूप में, चाहे घुलनशील प्रोटीन या झिल्ली प्रोटीन, प्रत्येक की अपनी चुनौतियों प्रदान करता है और उस कारण के लिए कोई भी पाइप लाइन सीधे सभी लक्ष्यों को लागू कर सकते हैं। इसलिए, यह प्राथमिक शोधकर्ता (एस) के हिसाब से इन सामान्य प्रोटोकॉल दर्जी को उसकी / उसके परियोजना की सफलता सुनिश्चित करने का काम है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystallization Robot TTP Labtech, Art Robbins - Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler Eppendorf, BioRad -
Media Shaker New Brunswick, Infors HT -
UV-vis spectrometer Eppendorf -
SDS-PAGE apparatus BioRad 1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels BioRad, Life Technologies 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime GE Healthcare -
AkTA Purifier GE Healthcare -
Microcentrifuge Eppendorf -
Centrifuge (low-medium speed) Beckman-Coulter -
Ultracentrifuge (high speed) Beckman-Coulter -
SS34 rotor Sorvall -
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter -
Type 70 Ti rotor Beckman-Coulter -
Dounce homogenizer Fisher Scientific 06 435C
Emulsiflex Avestin -
Dialysis tubing Sigma D9652
LCP tools Hamilton, TTP Labtech -
VDX 24 well plates Hampton Research HR3-172
Sandwich plates Hampton Research, Molecular Dimensions HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets Grace Bio-Labs 875238
HiPrep S300 HR column GE Healthcare 17-1167-01
Q-Sepharose column GE Healthcare 17-0510-01
Crystallization screens Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions -
Gas-tight syringe (100 ml) Hamilton 

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References

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रसायन विज्ञान अंक 113 β बैरल झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन क्रिस्टलीकरण संरचनात्मक जीव विज्ञान झिल्ली प्रोटीन refolding प्रोटीन शुद्धि
β बैरल बाहरी झिल्ली प्रोटीन की संरचना निर्धारण की ओर - निर्माण से क्रिस्टल करने के लिए
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Noinaj, N., Mayclin, S., Stanley, A. … More

Noinaj, N., Mayclin, S., Stanley, A. M., Jao, C. C., Buchanan, S. K. From Constructs to Crystals – Towards Structure Determination of β-barrel Outer Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (113), e53245, doi:10.3791/53245 (2016).

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