Introduction
β-fat OMP kan bare finnes i de ytre membraner av mitokondrier, kloroplaster, og Gram-negative bakterier 1-3. Mens de tjener lignende roller som a-heliks-proteiner, de har en helt annen fold som består av en sentral membran-forankret β-fat domene som strekker seg fra 8-26 antiparallelle P-tråder med hver streng som blir intimt knyttet til de to nabotråder (figur 1 og 2). Den første og siste tråder av β-fat domene deretter kommuniserer med hverandre, nesten utelukkende på en anti-parallell måte (med unntak av mitokondrielle VDAC), for å lukke og forsegle β-fat domene fra den omgivende membran. Alle β-barrel OMPer har ekstracellulære løkker av forskjellig sekvens og lengde som spiller en viktig rolle i ligand interaksjoner og / eller protein-protein kontakter med disse løkker og til å være så store som 75 rester, slik som funnet i transferrin Neisserial binding protein A (TBPA) 4. β-fat OMP kan også ha N-terminale eller C-terminale periplasmatiske utvidelser som fungerer som flere domener for protein funksjonelle formål (f.eks Bama 5-7, fimd 8,9, Fadl 10). Selv om mange typer av β-fat OMPer eksistere 11, to av de vanligste typene er beskrevet nedenfor som eksempler for de som er mindre kjent med banen (1) TonB avhengige transportører og (2) autotransporters.
TonB-avhengige transportører (f.eks FEPA, TBPA, BtuB, Cir, etc.) er avgjørende for nærings import og inneholder en N-terminal plugg domene bestående av ~ 150 rester som er funnet gjemt inne i en C-terminal 22-strandet β- fat domene innebygd i den ytre membran 12 (figur 3). Mens denne pluggen domene hindrer underlaget fra fritt passere gjennom fat domene, underlaget bindende induserer en konformasjonsendring i pluggen domene thved fører til poredannelse (enten ved plugg-omleiring eller ved partiell / fullstendig utstøting av pluggen) som deretter kan lette substrat transport over den ytre membran inn i periplasmaet. TonB avhengige transportører er spesielt viktig for overlevelsen av noen patogene stammer av gram-negative bakterier slik som Neisseria meningitidis som har utviklet seg spesialiserte transportører som kapre næringsstoffer som jern direkte fra humane vertsproteiner 4,13,14.
Autotransporters tilhører den type V sekresjon system av Gram-negative bakterier, og er p-barrel OMP-proteiner som består av en β-fat domene (typisk 12-tråder som med esta og EspP) og en passasjer domene som blir enten utskilt eller presentert på overflaten av cellen 15,16 (figur 3). Disse β-barrel OMPer tjener ofte en viktig rolle i celleoverlevelse og virulens med passasjeren domene tjener enten som en protease, adhesin, og / eller andre effector som formidler patogenesen.
Strukturelle metoder som røntgen-krystallografi, NMR-spektroskopi og elektronmikroskopi (EM) tillater oss å bestemme modeller for OMP ved atom-oppløsning som kan i sin tur brukes til å dechiffrere nøyaktig hvordan de fungerer i den ytre membranen. Denne uvurderlig informasjon kan så brukes for narkotika og vaksineutvikling hvis det er aktuelt. For eksempel er transferrin-bindende protein A (TBPA) finnes på overflaten av Neisseria og er nødvendig for patogenesen fordi den direkte binder human transferrin og deretter trekker og importerer jernet for sin egen overlevelse. Uten TBPA kan Neisseria ikke skatte jern fra menneskelig vert og gjengis ikke-sykdomsfremkallende. Etter at krystallstrukturen til human transferrin bundet til TBPA 4 var løst, ble det mye tydeligere hvordan de to proteinene forbundet, hvilke områder av TBPA mediert interaksjonen, hvilke rester var viktig for jernutvinning ved TBPA, oghvordan man kan utvikle behandlingsformer mot Neisseria målretting TBPA. Derfor, gitt betydningen av β-fat OMP-proteiner i gramnegative bakterier for å overleve og patogenese, samt i mitochondria og kloroplast funksjon, og behovet for ytterligere strukturell informasjon om denne unike klasse av membranproteiner og systemene hvori de fungerer Generelle protokoller presenteres med det overordnede målet om å uttrykke og rense målet OMP på et høyt nivå for karakterisering av strukturelle metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning og Expression
Merk: For å aktivere strukturelle studier, må tilstrekkelige mengder av svært renset protein være forberedt, og dette vanligvis starter med kloning og overekspresjon av målet β-fat ytre membran protein (OMP) i E. coli (figur 4). Til dags dato, alle β-fat OMP strukturer, inkludert de strukturer for mitokondrie VDAC, er avledet fra bakterielt uttrykte protein 11. Her blir generelt presentert protokoller for kloning og uttrykking β-barrel OMPer for (1) naturlig ekspresjon direkte inn i bakterielle membraner og (2) ekspresjon inn i inneslutninger organer for in vitro refolding 17.
- Designe et uttrykk Construct
- Skaffe eller kjøpe kodon optimalisert målet OMP-genet.
- Kjøp eller få en T7-ekspresjonsvektor (i) inneholdende et periplasmatisk lokaliseringssignalsekvens, en N-terminal 6x histidin-tag,og en TEV protease område 4,18,19 for in vivo-ekspresjon til membranen eller (ii) uten et periplasmatisk lokaliseringssignalsekvens for ekspresjonen til inklusjonslegemer for in vitro refolding.
Merk: Et N-terminalt protease spaltbare 6x eller 10x-histidin-tag ville tilveiebringe en enkel metode for rensing. Som med løselige proteiner, variere valget av affinitetsmerkelapp (histidin, Strep, GST, etc.), posisjonen til affinitetsmerkelapp, og inkluderingen av en protease område (TEV, enterokinase, trombin, etc.) for etterfølgende fjernelse tag . - PCR amplifisere målsekvensen med passende primere og subklon inn i ekspresjonsvektoren. Bruk ligation uavhengig kloning (LIC) 20,21 eller konvensjonelle kloningsteknikker (restriksjon enzymer / ligation) for subkloning. Imidlertid kan LIC lette høy gjennomstrømning, noe som åpner for et stort antall ulike konstruksjoner (trunkeringer, utvalg av koder, rekke arrangører) som skal klones parallelt merEnkelt.
- I Vivo Membran-målrettet Expression
- Bruk sekvensanalyse for å bekrefte den målet β-fat OMP er klonet nedstrøms og i ramme med en signalsekvens (dvs. pelB, OmpA) i ekspresjonskonstruksjonen.
Merk: signalsekvensen dirigerer den gryende kjeden til Sec translocon for sekresjon til periplasmaet og påfølgende montering i den ytre membran. - Transform konstruksjonen inn i et uttrykk stamme av bakterier for ekspresjon ved å pipettere 1,0 mL av plasmidet inn i 50 ul av BL21 (DE3) kjemisk kompetente celler og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Inkuber på is i 30 min.
- Varmepulsen ved 42 ° C i 30 sek ved hjelp av et vannbad, og deretter sette inn igjen på is i 1 minutt.
- Tilsett 1 ml forvarmes SOC media og rist ved 37 ºC i 1 time ved 1000 rpm ved hjelp av en benkeplate Bøk shaker inkubator.
- Platen 100 ul av celler på LB-agar-plater inneholdende en passende Antibiotic og inkuberes over natten ved 37 ºC invertert.
- Utføre småskala uttrykk tester ved inokulering av en 5 ml LB + antibiotikum kultur med en enkel koloni. Gjenta for 5-10 kolonier.
Merk: På grunn av den potensielle toksisitet av et β-fat OMP og avhengigheten av basale uttrykk nivåer, er koloni til koloni variasjon noen ganger observert. Derfor screening av flere kolonier anbefales for hver enkelt konstruksjon som skal testes. For småskala uttrykk tester, i stedet for konvensjonelle 5 ml kulturer som vokser 25 ml kulturer i 125 ml Erlenmeyer-kolber med ledeplater er foreslått. Disse forholdene ofte bedre gjenspeile hva som vil skje i en storstilt vekst. I tillegg er det en god idé å screene også ulike typer kulturmedium (TB, LB, 2 x YT, M9, etc.), ettersom varierende grad av suksess er blitt rapportert avhengig av målproteinet.- Grow ved 37 ºC med risting til en OD 600 av ~ 0,6.
- Fremkall uttrykk for målet OMP ved annonsending 5 ul av 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) til hver kultur rør og tillate å vokse ytterligere 1-2 timer.
- Sammenlign ekspresjonsnivåene for alle koloniene ved sentrifugering av 1 ml av hver kultur (OD-600 på ~ 0,6) i 1 min ved 15 000 x g ved anvendelse av en mikrosentrifuge.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 200 mL av 1x SDS-PAGE lasting buffer. Oppvarm til 100 ° C i 5 min og deretter igjen Sentrifuger ved 15.000 xg i 5 minutter.
- Analysere prøvene ved hjelp av SDS-PAGE ved å pipettere 20 ul i hver brønn av en 10% gel. Kjør gel for 35 min med konstant 200 V.
Merk: Det ville være fordelaktig på dette tidspunkt å være i stand til å bestemme om proteinet mål blir riktig foldet eller ikke. Dette kan ofte oppnås ved å gjøre småskala rensinger eller ved å analysere for varme modifiserbarhet.
- Velg kolonien viser det beste uttrykket og utføre storskala uttrykk ved hjelp av 12-24 liter medium.
Merk: Konvensjonelle metoder vanligvis dyrke kulturer ved 37 ºC med risting til en OD 600 av ~ 0,6 og deretter indusere med en passende inducer (dvs. 0,1-1 mm IPTG eller ~ 0,2% for arabinose) for en ekstra 2-4 timer . Dersom det er ønskelig, før induksjon, redusere temperaturen til så lavt som 20 ° C og forlenge induksjonstiden.- For utett ekspresjon metode, blir en 25 ml inokulering av kulturen ved 37 ° C i LB medium inneholdende det passende antibiotikum (e) inntil OD600 når ~ 0,6. Deretter legger 1 ml Inokuler tolv en L kanner TB medium pluss antibiotika (e) og vokse ved 20 ° C til metning (~ 3 dager).
- Høste cellene ved sentrifugering ved 6000 xg i 10 min.
- Fortsett til rensetrinnet punkt 2.1 eller fryse cellepelleten i flytende nitrogen for langtidslagring ved -80 ºC.
- Bruk sekvensanalyse for å bekrefte den målet β-fat OMP er klonet nedstrøms og i ramme med en signalsekvens (dvs. pelB, OmpA) i ekspresjonskonstruksjonen.
- Expression til inklusjonslegemer for In Vitro Refolding
- Bruk sekvensanalyse for å bekrefte den ekspresjonskonstruksjon ikke inneholder en signalsekvens. Fraværet av en signalsekvens vil direkte målproteinet til å akkumulere i cytosol som inklusjonslegemer.
- Transform uttrykket konstruere inn et uttrykk stamme av bakterier for uttrykk. For inkludering kroppen uttrykk, er det best å styre uttrykk ved induksjon (dvs. IPTG, arabinose, etc.) for å minimere mulige giftvirkninger.
- Plate 100 ul av transformerte celler på LB-agarplater inneholdende et passende antibiotikum og inkuber over natten ved 37 ° C invertert.
- Utføre småskala uttrykk tester ved inokulering av en 5 ml LB + antibiotikum kultur med en enkel koloni.
- Gjenta trinn 1.3.4 for 2-4 ekstra kolonier.
- Grow ved 37 ºC med risting til en OD 600 av ~ 0,6.
- Fremkall med et passende inducer i 1-2 timer.
- Sammenligne uttrykk nivåer for alle than kolonier ved analyse ved hjelp av SDS-PAGE (se trinn 1.2.6). Velg kolonien viser det beste uttrykket og utføre storskala uttrykk ved hjelp av 12-24 liter medium.
- Dyrke cellene ved 37 ° C til en OD 600 på 0,6 til 0,8 og indusere ved 37 ° C i 3-5 timer. Mens uttrykket til inklusjonslegemer er mer robust enn andre typer av uttrykk, som med alle protein ekspresjonseksperimenter, kan ekspresjon bli forbedret ved å variere vekstmedium, tidspunkt for induksjon, temperatur av induksjon, og konsentrasjonen av det induserende middel.
- Høste cellene ved sentrifugering ved 6000 xg i 10 min.
- Fortsett til rensetrinnet § 2.2 eller fryse cellepelleten i flytende nitrogen for langtidslagring ved -80 ºC.
2. Rensning
- Isolasjon fra membranfraksjoner
Merk: I motsetning til oppløselige proteiner, er integrerte membranproteiner innebygd i det ytre lipid bilaget og dermedkrever vaskemidler til å trekke dem for ytterligere rensing og analyse (figur 5). Følgende uttrykk, det første trinn i rensingen av en β-fat OMP er ekstraksjon fra membranfraksjonen.- Resuspender celler i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I) i et forhold på 5 ml / g cellepasta.
- Lyse cellene ved hjelp av en fransk presse eller celle homogenisator. Spinne de lyserte cellene ved 15 000 xg i 30 min ved 4 ° C for å fjerne ulyserte celler og celleavfall.
- Overfør supernatanten til et rent rør og sentrifuger på nytt ved høy hastighet (200 000 xg) i 1 time ved 4 ° C. Den resulterende pellet er membranfraksjon som inneholder proteinet av interesse.
- Ved hjelp av en Dounce homogenisator, resuspender den membranfraksjonen, først overfører membranene og deretter tilsette oppløseliggjørende buffer (50 mM KH 2PO 4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazol, PH 8,0) (50 ml per 20 g celler) ved 2x konsentrasjon, uten vaskemiddel.
- Hell de resuspenderte membranene inn i et lite begerglass og tilsett vaskemiddel (dvs., n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), lauryldimethylamine-N-oksyd (LDAO), n-oktyl-β-D-glukopyranosid (OG), Triton X-100, etc.) langsomt til en sluttkonsentrasjon på ~ 10x kritiske micellekonsentrasjon (CMC).
- Fylles med vann til en sluttkonsentrasjon på 1 x oppløseliggjørende buffer. Omrør i 0,5 til 16 timer ved 4 ° C, avhengig av hvor lett målproteinet er trukket ut fra membranene.
Merk: Vaskemiddel brukes til langsomt oppløse membraner for å ekstrahere målproteinet. Det er 3 typer vaskemidler som kan brukes her: ionisk (SDS, deoksykolsyre), ikke-ionisk (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), og zwitterionisk (LDAO, CHAPS). Et protein-detergent kompleks som er stabilt og monodisperse under rensetrinnet vil i stor grad hjelpe til med suksess for membranprotein crystallization. Mer informasjon om vaskemidler, deres egenskaper, CMC informasjon, og deres bruk i rensing av membranproteiner og andre programmer kan bli funnet på kommersielle leverandør nettsteder. - Sentrifuger den oppløste prøven ved 300 000 xg i 1 time ved 4 ° C. Supernatanten inneholder nå vaskemiddel-solubilisert target β-fat OMP.
- Fortsett med punkt 2.3 som beskrevet nedenfor.
- Refolding fra inklusjonslegemer
Merk: For in vitro refolding, målet β-fat OMP uttrykkes direkte i inklusjonslegemer. En fordel her er at disse proteiner kan bli produsert i høye nivåer. Men ulempen er at refolding er ofte lite effektiv og varierer fra en folding på nytt eksperiment til den neste. Likevel er det mange eksempler på proteiner som har blitt refoldede for strukturelle studier. Følgende uttrykk i inklusjonslegemer, må en nå isolere inklusjonslegemene for refolding eksperiments.- Resuspender celler i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 ug / ml AEBSF, 5 pg / ml DNase I, 4 mM 2-merkaptoetanol (BME)) (5 ml per g-celler lim). Lyse ved hjelp av enten en fransk presse, lydbehandling, eller celle homogenisator.
- Pellet av inklusjonslegemene ved en lav hastighet sentrifugering ved 6000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Vask av inklusjonslegemene ved resuspendering i 25 ml 1,0 M urea ved anvendelse av en Dounce homogenisator. Pellet på nytt ved en lav hastighet sentrifugering ved 6000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Gjenta trinn 2.2.3 etter behov.
- Resuspender de vaskede inklusjonslegemene til en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml ved bruk av buffer inneholdende 8,0 M urea (eller 6,0 M guanidiniumhydroklorid (GdCl)) pluss detergent (dvs. DDM eller LDAO) ved 2x CMC eller høyere.
Merk: Dersom det er ønskelig, for membran protein målene som inneholder et histidin tag, kan immobilisert metall-affinitet kromatografi (IMAC) rensing utføres ved hjelp av denaturering cold (i 8,0 M urea eller 6,0 M GdCl) som et første skritt lik som beskrevet nedenfor i punkt 2.3. - Utfør refoldingsreaksjonen ved sakte (over natten) fjerne denaturant ved dialyse i buffer mangler denatureringsmiddel.
Merk: Det kan ta flere endringer av dialyse buffer for å oppnå dette. Alternativt, hvis inklusjonslegemene blir først bundet til en IMAC-kolonne, kan man gjøre det refolding reaksjon mens de fremdeles var bundet til kolonnen ved langsomt å utveksle buffere for å fjerne denaturant. I begge tilfeller huske på at dette er et membranprotein, og derfor vaskemiddel må være tilstede for å stabilisere målet. Likeledes, hvis det vaskemiddel som brukes kan dialyseres, må det tilsettes til dialysebuffer (e) i tillegg. - Spinn refoldede prøvene på 200 000 xg i 1 time ved 4 ºC. Supernatanten inneholder refolded vaskemiddel-solubilisert target β-fat OMP.
- Fortsett med punkt 2.3 som beskrevet nedenfor.
- Rensing hjelp jegMAC, Ion-Exchange og Gel Filtration
Merk: Forutsatt at protein er konstruert med en histidin tag, enten opprinnelig uttrykt eller foldet bruker in vitro metoder, så immobilisert metall-affinitet kromatografi (IMAC) utføres for rensing mye som for Histidine tagget løselige proteiner, unntatt vaskemiddel må holdes i alle etterfølgende buffere for å holde målet β-fat OMP oppløst og stabil.- Forbered en 1-5 ml IMAC kolonne eller bruk en ferdigpakket kolonne. Utfør påfølgende kromatografi trinn ved 4 ° C. Spyl med vann for å fjerne alle spor av konserveringsmidler. Hvis du bruker et automatisert rensing system, installere kolonne i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fremstille 500 ml IMAC buffer A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) og 250 ml IMAC buffer B (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM, og 1,0 M imidazol).
Merk: Andre vaskemidler som kan brukes include Cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%), og LDAO (0,05%). - Ekvilibrere IMAC-kolonne ved bruk av 10 kolonnevolumer av IMAC buffer A.
- Legg imidazol til proteinet prøven til en sluttkonsentrasjon på 25 mM og bland. Laste prøven på den ekvilibrerte IMAC-kolonne ved 2 ml / min. Samle strømningen gjennom.
- Vask IMAC-kolonne med 5 kolonnevolumer av hver av økende konsentrasjoner av imidazol ved bruk av buffer B (dvs. 25 mM, 50 mM, 100 mM). Samle vasker i 2 ml fraksjoner.
- Eluere prøven med en sluttkonsentrasjon på 250 mM til 5 kolonnevolumer. Samle den eluerte prøve i 2 ml fraksjoner.
- Analyser strømningen gjennom, vaskefraksjonene og elueringsfraksjonene ved hjelp av SDS-PAGE-analyse (se trinn 1.2.6) basert på deres absorbans ved 280 nm. Pool fraksjonene inneholdende target β-fat OMP som bekreftet ved hjelp av SDS-PAGE-analyse.
- Fjern 6x-histidin tag ved å legge TEV protease til samleprøve (i henholdtil produsentens protokoll) og ruger over natten ved 4 ºC med milde rocking.
- Last prøven / protease løsning på en IMAC kolonne på nytt for å skille målet β-fat OMP (strømme gjennom) fra spaltede koder og noen uspaltede prøve. Strømmen gjennom vil inneholde spaltet prøven mangler merkelappen.
Merk: Dette vil også fjerne protease som TEV-Hans, som også har en ikke-spaltbare 6x-histidin tag selv. Ellers vil andre fremgangsmåter være nødvendig for å fjerne den protease etter fordøyelse. - Eventuelt kan utføre ionebytterkromatografi for ytterligere å rense prøven. Følg produsentens instruksjoner for kolonnen som skal brukes, være sikker på å inkludere vaskemiddel i alle buffere.
- For å forberede for krystallisering, laste prøven på en gelfiltreringskolonne inn i en buffer inneholdende vaskemiddel som skal benyttes til krystallisasjon, så som 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1% OG.
- Samle 1 ml fraksjoner og analysere USIng SDS-PAGE analyse (se Trinn 1.2.6) basert på deres absorbans ved 280 nm. Pool fraksjoner med absorbanser ved 280 nm etter hvert som de inneholder målproteinet. Konsentrer til ~ 10 mg / ml.
Merk: Om ønsket kan riktig folding bli vurdert ved anvendelse av en varme modifiserbarhet analysen som beskrevet nedenfor.
- Heat modifiserbarhet analyse
Merk: En metode for å overvåke riktig folding av renset β-fat OMP er å utføre varme modifiserbarhet analyser ved hjelp av en semi-innfødte SDS-PAGE 22. Her vil uoppvarmede prøvene som er foldet på riktig måte typisk migrere forskjellig fra de som er varme denatureres. Denne egenskapen er unik p-fat OMP og mye brukt til å studere denne familien av membranproteiner.- Før fremstilling av prøvene, montere gelen apparat. For å begynne, plassere buffertanken i en isen bøtte og surround helt med is. Sett en in-house støpt eller kommersiell mors gradient gel inn i holderen og sett inn i tanken. Fyll than tank fullstendig med kald 1 x MES-buffer (50 mM 2- [N-morfolino] etansulfonsyre, 50 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
- Pipetter 0,25 ul av prøven (10 mg / ml) i to 1,5 ml mikrosentrifugerør. Merk en som "kokt" og den andre som "RT".
- Legg 9,75 ul prøvebuffer til hver og blandes ved pipettering. Til begge prøver, tilsett 10 ul av 2 x SDS lastebuffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% bromfenolblått og 20% glycerol), og bland forsiktig ved pipettering.
- Kok 'Boiled "prøven ved 95 ºC i 5 min og samtidig la' RT 'prøven ved RT. Snurr 'Boiled "sample kort.
- Load 20 mL av begge prøvene ut mot preassembled innfødte gel. Løpe i 60 minutter ved konstant 150 V. fjerne gelen og synke ned i fargeløsning for å visualisere resultatene.
3. Krystallisering
Merk: For krystallisering av bådeoppløselige og membranprotein mål, er det standard protokoll for å maksimere prøven renhet og stabilitet (dvs. beste vaskemiddel, ligander, kofaktorer, etc.). Nåværende metoder for å krystallisere membranprotein målene generelt omfatter tre hovedtilnærmingsmåter som tilfredsstiller de amfifile kravene i bilag-innleiret proteiner: (1) vaskemiddel, (2) bicelle, og (3) lipide kubiske fase (LCP) (figur 6) 23. Anbefales bruk av et nanoliter krystallisering robot når det er mulig, for å øke antallet tilstander som kan bli screenet for en gitt prøvevolum, så vel som anvendelse av nylige fremskritt i verktøy rettet for å hjelpe til strukturbestemmelse (figur 7).
- Krystallisering bruker Vaskemidler
- Skaff et vaskemiddel oppløst proteinprøven som er på ~ 10 mg / ml konsentrasjon. Eventuelt legge den additive 1,2,3-heptanetriol direkte til prøven til en sluttkonsentrasjon på 3% for å redusere detergent micelle størrelse.
- Filtrer prøven ved bruk av en 0,22 um sentrifugal-filter for å fjerne partikler og nedbør.
- Ved hjelp av en krystallisering robot, utføre bred matrise krystallisering screening ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 96 vel skjermer enten hengende eller sittende slipp fordamping metode med dråper sammensatt av ~ 200 nl proteinprøven og ~ 200 nl krystallisering buffer.
- Inkuber platene krystallisering ved ~ 21 ° C. Inspiser platene ukentlig for krystallvekst ved hjelp av en stereomikroskop.
- Optimaliser krystallisering ledningene ved å variere komponentene av krystallisering tilstand på en systematisk måte (økende / minkende salt eller fellingsmiddel konsentrasjoner, pH, inkubering temperatur, og / eller proteinkonsentrasjon).
- Krystallisering Bruke Bicelles
Merk: En mer detaljert demonstrasjon av bicelle teknikker har tidligere blitt beskrevet av Ujwal og Abramson 24.- Forbered eller kjøpe et tre5% bicelle blanding bestående av DMPC: CHAPSO i et forhold på 2,8: 1 i henhold til publiserte protokoller 25. Andre konsentrasjoner kan også bli analysert, så vel som, andre lipider og vaskemidler, etter behov.
- Skaff et vaskemiddel oppløst proteinprøven som er på ~ 10 mg / ml konsentrasjon.
- Tilsett bicelle blandingen på is, ved en startforhold på 4: 1 volum / volum (protein: bicelle) (f.eks, tilsett 10 ul av bicelle blandingen til 40 ul protein og blandes hurtig ved pipettering).
- Inkuber på is 30-60 min.
Merk: protein: bicelle løsning bør forbli det meste klart, men kan ofte vise litt ugjennomsiktig. Imidlertid, dersom protein: bicelle løsning er melkeaktig, hvitt, noe som indikerer nedbør, da andre variable skal bli analysert (dvs. vaskemiddel, buffer, etc.). For nye prøver, gjøre småskala tester (8 mL protein og 2 mL bicelles) anbefales å verifisere stabilitet før skalere opp for å hindre unødig prøve tap. - Ved hjelp av en krystallisering robot, utføre bred matrise krystallisering screening ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 96 vel skjermer enten hengende eller sittende slipp fordamping metode med dråper sammensatt av ~ 200 nl proteinprøven og ~ 200 nl krystallisering buffer.
- Inkuber platene krystallisering ved ~ 21 ° C. Inspiser platene ukentlig for krystallvekst ved hjelp av en stereomikroskop.
- Optimaliser krystallisering ledningene ved å variere komponentene av krystallisering tilstand på en systematisk måte (økende / minkende salt eller fellingsmiddel konsentrasjoner, pH, inkubering temperatur, og / eller proteinkonsentrasjon).
- Krystallisering Bruke lipidic Cubic Phase (LCP)
Merk: En mer detaljert demonstrasjon av LCP teknikker har tidligere blitt beskrevet av Liu og Cherezov 26,27.- Skaff et vaskemiddel oppløst proteinprøven som er på ~ 20 mg / ml konsentrasjon.
- Forvarm den monoolein til ~ 40 ºC. Laste60 ul monoolein inn i en gasstett sprøyte 100 ul og 40 ul proteinprøven inn i en annen.
- Ved hjelp av en blanding kobling, koble sprøytene, være forsiktig med å innføre luft.
- Bland forsiktig ved å bruke vekslende trykk på sprøyten stemplene presser blandingen fra en sprøyte til den andre helt til prøven blir gjennomskinnelig og homogen.
- Ved hjelp av en krystallisering robot designet for LCP metoder, utføre bred matrise krystallisering screening ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 96 brønner skjermer med smørbrød-stil krystallisering plater (0,1 mm vel tykkelse) med dråper som består av 100 nl proteinprøven og 750 nl krystallisering buffer.
Merk: Drop forhold kan justeres ved behov. Dessuten er solide dekker (dvs. glass eller tykk plast) anbefales som støtter dråpene pent fremfor tynne filmer, som har en tendens til å tillate dråpene å flytte om vel som platene håndteres. - Inkuber krystallisering plates på ~ 21 ° C. Inspiser platene ukentlig for krystallvekst ved hjelp av en stereomikroskop.
- Optimaliser krystallisering ledningene ved å variere komponentene av krystallisering tilstand på en systematisk måte (økende / minkende salt eller fellingsmiddel konsentrasjoner, pH, inkubering temperatur, og / eller proteinkonsentrasjon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yiur er en TonB avhengig jern transporter som er en antatt vaksine mål mot Yersinia pestis. Det var opprinnelig identifisert ved hjelp av en microarray analyse. Her er fremgangsmåten som ble tatt for å bestemme strukturen av yiur å bruke røntgenkrystallografi skissert (figur 9). For kloning av DNA-sekvensen av yiur (minus den N-terminale signalsekvens) ble PCR-amplifisert fra genomisk DNA og subklonet inn i en vektor som inneholder en N-terminal signalsekvens pelB og 10x-histidin affinitetsmerkelapp etterfulgt av en TEV protease-området. For ekspresjon ble yiur-inneholdende plasmid transformert inn i BL21 (DE3) kompetente celler og en enkelt koloni brukes til å dyrke en 5 ml starterkultur til OD600 ~ 0,5. Tolv flasker inneholdende 750 ml TB-medium ble så inokulert med 1 ml av startkulturen og tillatt å vokse i 3 dager ved 20 ° C (risting ved 220 rpm). Cellene ble deretter høstet, og produserer omtrent 150-200g av den totale cellepasta, som ble flash-kjølt i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
For rensing av yiur, ble 20 g celler resuspendert i 120 ml av 1 x PBS (10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4) ved omrøring ved RT med DNase og AEBSF blir lagt. Lysis ble utført ved to passeringer gjennom en homogenisator. Lysatet ble deretter sentrifugert ved 12 000 xg i 10 minutter (for å spinne ned ubrutte celler og inklusjonslegemer). Supernatanten ble sentrifugert på nytt ved 235 000 xg i 60 min, og pelleten inneholdende membranfraksjonen (yiur). Membranene ble deretter resuspendert i 100 ml av 1 x PBS ved hjelp av en Dounce homogenisator. Yiur ble oppløseliggjort / ekstrahert fra membranene ved hjelp av Elugent ved 5% sluttkonsentrasjon, omrøring natten over (opptil 16 timer) ved 4 ° C. De oppløseliggjorte Membranene ble deretter sentrifugert på nytt ved 371 000 xg i 60 min, med supernatant inneholder oppløste fraksjonen inkludert yiur. For å isolere yiur, ble utført ved anvendelse av IMAC buffer A (1 x PBS, 0,1% DDM) og buffer B (1 x PBS, 1 M imidazol, 0,1% DDM), vasket med imidazol konsentrasjoner fra 30-50 mM og eluert med 250-500 mM . For å fjerne den N-terminale 10x-histidin tag, inkubasjon med TEV HIS protease ble utført over natten ved 4 ºC under dialyse i 1x PBS buffer. Prøven ble deretter ført over en IMAC-kolonne nytt, vil den strømme gjennom konsentrert, dialysert, og deretter separeres ytterligere ved bruk av en 0-1,0 M NaCl-gradient på en ionebytte-kolonne i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Fraksjoner inneholdende yiur ble deretter samlet, konsentrert og kjørt over en gelfiltrerings-kolonne ved anvendelse av 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl og 0,05% LDAO. Fraksjonene inneholdende yiur ble deretter samlet og konsentrert til 10 mg / ml for krystallisering.
Bred matrise screening ble deretter utført og vilkår fastsattsom produserte noen innledende diffraksjon krystaller. Videre optimalisering ført til større krystaller som ble brukt til å samle inn innfødte røntgendiffraksjons-data. Krystaller som er vist i figur 8 er representative for krystaller man kan oppnå ved hjelp av de metoder som er presentert her. Krystaller fra vaskemiddel screening og bicelles kan være så stor som krystaller som oppnås typisk for løselige proteiner; imidlertid de fra LCP er nesten alltid meget mindre. Dataene var gode nok til å brukes for molekylær erstatning som førte til strukturbestemmelse til 2,65 en løsning.
Figur 1. De to typer av fullstendig integrerte membranproteiner er α-heliks og β-fat. Vist her er eksempler på hver med β2-adrenerge reseptor (PDB kode 2RH1, α-heliks) og TonB avhengige transporter BtuB (PDB kode 1NQE,P-fat). Den øverste raden viser ekstracellulære utsikten mens den nederste raden viser membranen visningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. β-fat OMP tjene mange ulike funksjoner og kan ha ulike strukturer. Mens a-heliks membran proteiner kan inneholde en eller flere av transmembranområdene, β-fat OMPer varierer fra 8-26 tråder og hver tråd intimt samvirker med de nærliggende tråder. Ytre rester, som vekselvirker med membranen, er vanligvis hydrofobe, mens de indre rester, som reagerer med oppløsningsmidlet, er typisk polare og hydrofile. Øverste raden viser ekstracellulære visning, viser den midterste raden membranen visning, og den nederste raden viser periplasmic visning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksempler på to typer av vanlige β-fat OMP. Venstre, strukturen i TonB avhengige transporter Fepa (PDB kode 1FEP), som skildrer den ekstracellulære (øverst), membran (i midten) og periplasmatiske (nederst) visninger. Den β-fat domenet er angitt i grønt mens pluggen domenet er i magenta. Høyre, strukturen i auto ESTA (PDB kode 3KVN), som skildrer den ekstracellulære (øverst), membran (i midten) og periplasmatiske (nederst) visninger. Den β-fat domenet er angitt i gull, mens passasjeren domenet er i blått. Klikk her for å se et større Versipå denne figuren.
Figur 4. Skjematisk av kloning og ekspresjon rørledning for produksjon av β-fat OMP'er. Skjematisk av rørledningen som brukes for å klone og uttrykke et mål OMP enten ved naturlig membran uttrykk (venstre) eller ved ekspresjon i inklusjonslegemer for refolding (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Skjematisk av rensing rørledning for isolering av β-fat OMP'er. Skjematisk av rørledningen som brukes til utvinning av OMP som har blitt uttrykt direkte inn i OM. Her har målet OMP å være ekstrakted fra membranen ved oppløseligheten med et passende rengjøringsmiddel og deretter renset ved IMAC, ionebytterkromatografi, og gelfiltrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Skjematisk av krystallisering rørledning for dyrking av krystaller av β-fat OMP'er. Tre fremgangsmåter kan anvendes for krystallisering av β-fat OMPer inkludert vaskemiddel screening, bicelles, og lipidic kubikk fase (LCP). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Nye verktøy i krystallografi som har vesentlig bidratt til å strukturere fastsettelse av β-fat OMP. Eksempler er krystallisering roboter / LCP roboter (A), UV-mikroskoper (B), Second Order-lineær avbildning av kirale krystaller (SONICC) visualisering (C), robot Puck / roboter (D), rastrere / vektor / spiraldatainnsamlingsmetoder (E ), og mikrofokus bjelker (F). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Representative bilde av krystallene som følge av protokollen. Krystaller fra vaskemiddel screening og bicelles kan være så stor som krystallerinnhentet typisk for løselige proteiner; imidlertid de fra LCP er nesten alltid meget mindre. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Fra konstruksjoner til krystaller til strukturbestemmelse for den antatte vaksine målet yiur fra Yersinia pestis. Den samlede rørledningen brukes til strukturbestemmelse av yiur, illustrerer trinnene tatt å klone, uttrykke, rense, krystallisere og løse strukturen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β-fat OMP tjene viktige roller i Gram-negative bakterier, mitokondrier og kloroplaster og er viktige mål for strukturell analyse som tilbyr et vell av informasjon om viktige molekylære mekanismene ved de ytre membranene av disse respektive organeller. Imidlertid produserer nok prøve for strukturell analyse er ikke alltid enkel og derfor en generell rørledning presentert for fremstilling av tilstrekkelige mengder av mål-β-barrel OMPer for strukturbestemmelse, forklarer i detalj fremgangsmåten fra konstruksjoner til krystaller. Selv om disse protokollene har blitt testet og funnet å fungere for de fleste OMP fra Gram-negative bakterier, er det begrensninger i at det er noen mål, spesielt for mitokondrier og kloroplaster, som kan kreve andre metoder for uttrykk og rensing. Som sådan bør metodene her komme til anvendelse for de fleste prosjekter som involverer OMP fra Gram-negative bakterier, men likevel ekspresjonsnivåets og mengden av renset prøve vil variere avhengig av målet OMP.
Det er to generelle fremgangsmåter for ekspresjon av β-fat OMPer for strukturelle studier, (1) in vivo ekspresjon direkte inn i den ytre membranen og (2) ekspresjon i inklusjonslegemer for in vitro refolding. For in vivo-ekspresjon tilnærming, blir β-fat OMPer målrettet mot ytre membran av E. coli hvor de opprinnelig foldet og isolert direkte fra membraner. Ekspresjon til membranen er den foretrukne metode fordi målene er mer sannsynlig å bli brettet skikkelig. Mens denne tilnærmingen vanligvis gir lavere nivåer av total protein, unngår den komplikasjonene noen ganger i forbindelse med in vitro refolding. Mange β-barrel OMP har blitt uttrykt på denne måten for strukturbestemmelse 4,5,11. Suksess oppnås ofte ved hjelp av et system som er avhengig av lav-nivå konstitutiv ekspresjon fra en T7 fremmerR, men andre systemer som baserer seg på induksjon (dvs. IPTG, arabinose) for ekspresjon blir også rutinemessig brukt med hell.
Ekspresjon direkte inn i den ytre membran krever målproteinet for å ha en N-terminal signalsekvens som styrer ribosom-nascerende; kompleks til Sec translocon, for sekresjon av den begynnende β-fat OMP inn i periplasmaet. Signalsekvensen spaltes på det periplasmatiske side av den indre membranen, slik at det er viktig at signalsekvensen forut for eventuelle N-terminale koder legges til målet. Den begynnende β-fat OMP blir deretter fulgt ved anstand inn i periplasma til BAM-komplekset for innføring i den ytre membranen 2,3.
For mål som ikke kan overuttrykt i membranen, er en alternativ tilnærming uttrykk i inklusjonslegemer for in vitro refolding 28-30. Denne tilnærmingen vanligvis resulterer i høy og robust uttrykk of målproteinet. Imidlertid kan det være utfordrende å identifisere refolding betingelser, som refolding kan være ineffektive. I tillegg kan det være vanskelig å analysere når målet β-fat OMP er korrekt foldet. Likevel er det mange eksempler på proteiner som har blitt refoldede for strukturelle studier inkludert OmpA 31, Ail 19, OmpF 32, og VDAC 33. For kloner som ikke uttrykker det hele tatt (nativt eller i inklusjonslegemer), eller uttrykke men er ikke montert på riktig måte inn i membranen (opprinnelig), kan man prøve å mutere den β-fat for å ligne det av E. coli 34,35. Aminosyresekvensen i den β-signal av tønnen domenet er viktig for gjenkjenning og montering av BAM-komplekset og variasjoner i β-signalsekvensen i betydelig grad kan påvirke både riktige og biogenese ekspresjonsnivåene av målet β-fat OMP 11,34 , 35. Riktig integrering av puls β-barrel OMP kan overvåkes ved å screene for membranfraksjonering og vaskemiddel extractability etterfulgt av varme modifiserbarhet analyser.
Krystallisering av membranproteiner i nærvær av vaskemiddel miceller er den eldste teknikk og tillater enkel tilpasning av tradisjonelle oppløselig protein krystallisering utstyr og strategier. Ved å maskere membranen innebygde områder med detergentmolekyler, konsentrert protein kan behandles på en lignende måte som løselige proteiner (f.eks blandet med krystallisering moderluter og innesluttet i en dampdiffusjon apparat som forårsaker langsom dehydrering av protein dråpe). Mens enkel i konseptet, vaskemiddel karakteristikker og egenskaper legge et betydelig lag av kompleksitet på toppen av de normale krystallisering utfordringer. Nærmere bestemt må den molekylære karakter av en detergent empirisk skreddersydd for et gitt mål-protein, inkludert micelle størrelse, hodegruppe polaritet (anioniske, kationiske, ikke-ioniske, ellerzwitterioniske), og hydrokarbonkjedelengde, som hver av disse påvirke stabiliteten av målet membranprotein i oppløsning. Ulempene ved denne tilnærmingen inkluderer ikke-innfødte kjemisk miljø, potensiell tilsløring av overflateområder som kan danne krystaller kontakter og vaskemiddel konsentrasjonsproblemer.
Bicelles er en blanding av lipider og amfifiler (f.eks, vaskemidler eller kortkjedede lipider) som settes sammen til individuelle partikler som etterligner en to-lags struktur som ligner på membranene som finnes i celler 36,37. De amfifile maskene den hydrofobe kjerne av dette bilaget hvor det ligger fritt ved sine kanter på en lignende måte til micellene i vaskemiddel krystallisering. Dette gir en mer naturlig-lignende miljø for å bidra til å stabil target proteiner.
Membranprotein mål kan også bli krystallisert med lipid kubisk fase (LCP) metoder 38. LCP er en mesofase som dannes ved blanding av lipid og vann, isom en kontinuerlig bilayer er gjennomsyret av to ikke-kryssende nettverk av løsemiddel kanaler. Denne tredimensjonale strukturen tillater diffusjon av lipid innebygd membran proteiner i en stor grad innfødt-lignende miljø og gir krystall kontakter for å danne mellom de hydrofobe og hydrofile overflater av proteiner og reduserer det totale innholdet av løsemidler krystaller og samtidig forbedre sin bestilling. Siden introduksjonen i 1990-årene, har LCP teknikker vært avgjørende for å fastslå strukturene av mange unnvikende membran protein mål, slik som rhodopsins 39,40 og GPCR 41-43. Bruk av LCP i høy gjennomstrømning skjermer krever spesielle bestemmelser (dvs. LCP-spesifikke robot, gasstette sprøyter, LCP dispensering verktøy, smørbrød krystallisering plater, etc.) som den tykke monoolein ofte brukt for LCP kan ikke håndteres av tradisjonell nanoliter væske håndtering roboter.
Gelfiltreringskromatografi er et svært viktig skrittfor krystallisering av membranproteiner generelt, fordi den gir informasjon om hvordan å stabilisere den valgte vaskemiddel er for det membranprotein målet, som kan visualiseres ved kromatogrammet. Ved å sammenligne mengden av prøve i void-volumet, oppholdstider, og former av toppene, kan den samlede stabilitet og monodispersitet av prøven nås. En ideell prøven ville ha veldig liten eller ingen prøve tapt i void-volumet og ville ha en enkelt symmetrisk elueringstoppen med en Gaussisk fordeling. Den vaskemidler C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%), og LDAO (0,05%) blir rutinemessig anvendt for krystallisasjon av β-fat OMP'er med suksess og er gode til å begynne med. Ideelt sett er småskala eksperimenter utført sammenligne flere vaskemidler eller blandinger av vaskemidler til å bestemme hva som er mest hensiktsmessig for krystallisering. De som er funnet å være mest stabiliserende blir så brukt for storskala preparater av target β-barrel OMP og for krystallisering prøvelser.
Når krystallene er dannet av skiven β-fat OMP, bly optimalisering (dvs. additiv screening, cryo-screening, vaskemiddel additiv screening, etc.) og andre teknikker i likhet med løselige protein målene kan bli fulgt med noen få forskjeller. Det er imidlertid noen nylige fremskritt som er svært nyttig når du arbeider med membran proteiner. Nærmere bestemt, kan membranproteinkrystaller ofte være vanskelig å oppdage innenfor deres moderlut for en rekke årsaker. Membran proteiner danner ofte relativt små krystaller og falske positiver kan omdirigere krystall optimalisering. LCP teknikker spesielt tilstede ekstra utfordringer, gitt den svært tyktflytende, ofte ugjennomsiktig miljøer der krystallene er dyrket. Strategier for å løse disse problemene omfatter bruk av ultrafiolette mikroskoper (UV) i forbindelse med lysmikroskoper, slik at naturlig fluorescerende protein krystaller skal skilles from ikke-fluorescerende salt og detergent krystaller (figur 7). Utfordringer gjenstår, men i positiv identifikasjon av protein krystaller som danner innenfor felt av fellings. Krystaller kan også påvises ved utnyttelse av frekvensdoblings effekten av de fleste kirale krystaller når avbildes ved femtosecond scanning laserpulser, som implementert av SONICC teknologi 44. Den høye oppløsningen, kan høy kontrast teknikk som brukes for å skille submikron krystaller fra fjernlyset betingelser.
Høsting membran proteiner er gjort ved hjelp av standard krystallografi teknikker, spesielt for vaskemiddel og bicelle krystallisering. Looping utføres ved hånd ved hjelp av en lav forstørrelse mikroskop og en krystall-monterings sløyfe (dvs. nylon fiber, tråd, eller polymer). Wicking overflødig løsemiddel og cryo beskyttelse før stupe frysing i kryogenisk væske er også standard prosedyrer når høst β-fat OMP krystaller. Men innhøstinging av LCP dyrket krystaller presenterer spesielle problemer, særlig hvis høsting direkte fra sandwich-plater, som krystallene kan være vanskelig å få tilgang til, og kan ikke lett observeres gjennom mikroskopet. Også krystaller dyrket i LCP må noen ganger bli slaktet i bulk siden LCP blanding ikke lett kan skilles i sløyfen.
Datainnsamling for β-fat OMP kan utføres som med løselige protein krystaller med bare noen få ekstra hensyn. Mens størrelsen av krystaller dyrket ved vaskemiddel og bicelle metoder er ofte sammenlignes med de som var dyrket med oppløselige proteiner, krystallene ble dyrket av LCP fremgangsmåten er nesten alltid er betydelig mindre. I tillegg, fordi prøvene høstet fra LCP matrise ofte inneholde flere krystaller som er vanskelige å observere, man må utnytte synkrotron kilder som har mini-bjelke og loop rastrere evner som systematisk kan skanne hele løkken å finne posisjonene til krystaller basert på diffraDette skjer (figur 7). Den lille størrelsen på LCP krystaller også gjør dem særlig utsatt for strålingsskade. Derfor er data fra flere krystaller er ofte slått sammen for å samle inn et fullstendig datasett.
Når godt diffraksjon krystaller og et komplett datasett er samlet inn, kan strukturbestemmelse for β-fat OMP oppnås ved hjelp av de samme prosedyrer som for løselige proteiner, husk at membran protein krystaller utviser generelt et høyere innhold av løsemidler. Som med alle krystallografi mål, enten løselig protein eller membran protein, hver tilbyr sine egne utfordringer og av den grunn ingen enkelt rørledning kan direkte gjelde for alle mål. Derfor er det jobben av den primære forskeren (e) til å skreddersy disse generelle protokoller tilsvarende for å sikre suksess for hans / hennes prosjekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
