β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
β-barrel OMP's alleen worden gevonden in het buitenmembraan van mitochondria, chloroplasten, en Gram-negatieve bacteriën 1-3. Terwijl ze gelijkaardige rol dienen als α-helix eiwitten, ze hebben een heel andere plooi bestaande uit een centrale membraan ingebedde β-barrel domein variërend 8-26 antiparallelle β-strengen met elk onderdeel zijn nauw verbonden met de twee aangrenzende strengen (figuren 1 en 2). De eerste en laatste strengen van het β-barrel domein interageren dan met elkaar bijna uitsluitend in een anti-parallelle wijze (behalve mitochondriale VDAC), sluiten en afdichten van de β-barrel domein van de omringende membraan. Alle β-barrel OMP's zijn extracellulaire lussen van verschillende sequentie en lengte die een belangrijke rol ligand interacties en / of eiwit-eiwit contacten spelen met deze loops soms zijn zo groot als 75 resten, zoals in Neisseria transferrine bindende proTein A (TbpA) 4. β-barrel OMP kunnen ook N-terminale of C-terminale periplasmatische extensies, die als extra domeinen dienen voor het eiwit functioneel doel (bijv BAMA 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Hoewel vele soorten β-barrel OMP aanwezig 11 zijn twee van de meest voorkomende hierna beschreven als voorbeeld voor niet-ervaren het veld (1) TonB-afhankelijke transporters en (2) autotransporters.
TonB-afhankelijke transporters (bv, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) zijn essentieel voor voedingsstoffen import en bevatten een N-terminaal plug domein bestaande uit ~ 150 resten die gevonden is weggestopt in een C-terminaal 22-stranded β- barrel domein ingebed in de buitenste membraan 12 (figuur 3). Hoewel deze plug domein voorkomt substraat vrijelijk door het vat domein, substraatbinding induceert een conformationele verandering binnen het plug domein thbij leidt tot de vorming van poriën (hetzij door plug herschikking of door gedeeltelijke / volledige uitwerpen van de stop), die vervolgens substraat transport over de buitenste membraan kan faciliteren in het periplasma. TonB-afhankelijke transporteurs zijn vooral belangrijk voor de overleving van sommige pathogene stammen van Gram-negatieve bacteriën zoals Neisseria meningitidis die gespecialiseerde transporteurs die voedingsstoffen kapen zoals ijzer direct uit menselijke gastheer- 4,13,14 geëvolueerd.
Autovrachtwagens behoren tot het type V secretiesysteem van Gram-negatieve bacteriën en zijn P-barrel OMP's die bestaan uit een β-barrel domein (typisch 12-strengen als met ESTA en ESPP) en een passagier domein dat ofwel wordt uitgescheiden en gepresenteerd op de oppervlak van de cel 15,16 (figuur 3). De β-barrel OMP's dienen vaak een belangrijke rol in celoverleving en virulentie bij de passagier domein dienen ofwel als een protease, adhesine, en / of andere effector die bemiddelt pathogenese.
Structurele werkwijzen zoals röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie en elektronenmicroscopie (EM) laten modellen bepalen de OMP's bij atomaire resolutie die weer gebruikt kan worden om te ontcijferen hoe ze functioneren in het buitenmembraan. Deze waardevolle informatie kan dan worden gebruikt voor het geneesmiddel en vaccinontwikkeling, indien van toepassing. Bijvoorbeeld, transferrine bindend eiwit A (TbpA) gevonden op het oppervlak van Neisseria en is vereist voor pathogenese omdat het direct bindt humaan transferrine en vervolgens extraheert en invoert ijzer tot zijn eigen overleving. Zonder TbpA, kan Neisseria niet vangen ijzer uit de menselijke gastheer en zijn gemaakt van niet-pathogene. Na de kristalstructuur van humaan transferrine gebonden aan TbpA 4 opgelost, het veel duidelijker hoe de twee eiwitten geassocieerd werden, welke gebieden van TbpA gemedieerde interactie, welke residuen belangrijk ijzer extractie waren door TbpA enhoe men zou kunnen ontwikkelen therapieën tegen Neisseria targeting TbpA. Daarom, gezien het belang van β-barrel OMP's in Gram-negatieve bacteriën om te overleven en pathogenese, en in mitochondria en chloroplasten functie en de behoefte aan aanvullende structurele informatie over deze unieke klasse van membraaneiwitten en de systemen waarin ze functioneren , algemene protocollen worden met de algemene doelstelling van het uitdrukken en zuiveren doel OMP op een hoog niveau voor de karakterisering door structurele methoden.
β-barrel OMP dienen een essentiële rol in Gram-negatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten en zijn belangrijke doelen voor structurele analyse die een schat aan informatie over wezenlijke moleculaire mechanismen die aan de buitenste membranen van deze respectieve organellen bieden. Echter produceert genoeg monster voor structurele analyse is niet altijd eenvoudig en daarom wordt een algemene pijpleiding gepresenteerd voor de productie van voldoende hoeveelheden doelwit β-barrel OMP's voor structuurbepal…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
SS34 rotor | Sorvall | – | |
Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
Emulsiflex | Avestin | – | |
Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |