Introduction
βバレルのOMPは、ミトコンドリア、葉緑体、およびグラム陰性菌1-3の外膜で見つけることができます。彼らはαヘリックスタンパク質と同様の役割を果たしているが、彼らはそれぞれの鎖が密接に隣接する二つの鎖に接続されて8月26日、反平行のβ鎖に至るまで中央の膜に埋め込まれたβバレルドメインからなる非常に異なる倍を持っています（ 図1及び2）。 βバレルドメインの最初と最後のストランドは、その後、周囲の膜からβバレルドメインを閉じて密封するために、（ミトコンドリアVDACを除く）反平行にほぼ独占的に、互いに相互作用します。すべてのβバレルのOMPは、これらのループは、時々そのようなプロ結合ナイセリアトランスフェリンにおいて見出されるような75残基と同じ大きさで、リガンド相互作用および/またはタンパク質 - タンパク質接触に重要な役割を果たして変化配列および長さの細胞外ループを有しますテインA（のTbpA）4。 βバレルのOMPは、タンパク質の機能的な目的（ 例えば、バマ5-7、FimD 8,9、ファドル10）のような追加のドメインを果たすN末端 またはC末端ペリプラズム拡張機能をも持つことができます。 βバレルのOMPの多くの種類が11存在するが、より一般的なタイプの2は、フィールド、（1）TonB依存トランスポーター及び（2）オートトランスポーターとあまり慣れているため、例として、以下に記載されています。
TonB依存トランスポーター（ 例えば、FEPA、のTbpA、のbtuB、Cirの、 など ） は 、栄養のインポートのために不可欠であり、C末端の22本鎖β-内側に隠れて発見された〜150残基からなるN末端 プラグドメインを含みますバレルドメインは、外膜12（ 図3）の中に埋め込 まれました。このプラグインのドメインを自由にバレルドメインを通過する基板を防ぎながら、基質結合は、プラグドメイン番目の内のコンホメーション変化を誘導しますリードで（プラグ転位によって、またはプラグの部分的/完全な排出のいずれかによって）、その後ペリプラズムに外膜を横切って基板搬送を容易にすることができる形成を細孔します。 TonB依存のトランスポーターは、直接ヒト宿主タンパク質4,13,14から鉄などの栄養素をハイジャック特殊なトランスポーターを進化させてきたような髄膜炎菌などのグラム陰性菌のいくつかの病原性株の生存のために特に重要です。
オートトランスポーターは、グラム陰性菌のV型分泌系に属し、βバレルドメインからなるβバレルのOMP（ESTA及びESPPと同様に、通常、12ストランド）とで分泌または提示されているいずれかのパッセンジャードメインですセル15,16（ 図3）の表面。これらのβバレルのOMPは、多くの場合、サービングパッセンジャードメインと細胞の生存と病原性において重要な役割を果たしいずれかのプロテアーゼ、付着、および/または他のEFなどfectorそれは病因を媒介します。
このようなX線結晶学、NMR分光法、および電子顕微鏡（EM）、私たちは順番に、それらは、外膜内で機能する方法を正確に解読するために使用することができ、原子分解能でのOMPのためのモデルを決定することを可能にするような構造の方法。該当する場合は、この貴重な情報は、薬物およびワクチンの開発のために使用することができます。例えば、トランスフェリン結合タンパク質A（のTbpA）はナイセリアの表面上に見出され、それが直接ヒトトランスフェリンを結合し、その後抽出し、自身の生存のために鉄をインポートするため、病原性のために必要とされます。 TbpAがなければ、 ナイセリアはヒト宿主から鉄を除去することができず、非病原性にされます。 TbpA 4に結合したヒトトランスフェリンの結晶構造が解明された後、それは2つのタンパク質が関連するどのくらい鮮明になった、のTbpAのどの領域が相互作用を媒介、のTbpAによって鉄抽出のための重要な何であったか残基、およびどのように1はのTbpAを標的ナイセリアに対する治療薬を開発する可能性があります。したがって、生存と病原性グラム陰性細菌中のβバレルのOMPの重要性を与えられただけでなく、ミトコンドリアと葉緑体機能、および追加の構造膜タンパク質のこのユニークなクラスに関する情報とそれらが機能するシステムの必要性、一般的なプロトコルは、構造的な方法によって特徴づけのために高レベルでターゲットのOMPを発現させ、精製の全体的な目標が提示されています。
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Protocol
1.クローニングおよび発現
注意：構造研究を有効にするには、高度に精製されたタンパク質の十分な量を準備する必要があり、これは一般的に大腸菌におけるターゲットβバレル外膜タンパク質のクローニングおよび過剰発現（OMP）で始まります大腸菌 （ 図4）。現在までに、ミトコンドリアVDACのためのこれらの構造を含む全てのβバレルOMP構造は、細菌で発現された蛋白質11に由来しています。ここでは、一般的なプロトコルは、in vitroで 17をリフォールディングするための介在物の体にクローニングおよび細菌膜に直接（1）ネイティブの発現のためにβバレルのOMPを発現させ、（2）の発現のために提示されています。
- 発現構築物を設計します
- コドン最適化されたターゲットOMP遺伝子を入手するか、購入します。
- ペリプラズム局在化シグナル配列、N末端6×ヒスチジンタグを含むT7発現ベクター（i）を購入または取得し、および膜または（ii）のin vitroでのリフォールディングのための封入体に発現させるためのペリプラズム局在化シグナル配列を含まないにインビボ発現のためのTEVプロテアーゼ部位4,18,19。
注：N末端プロテアーゼ切断可能な6倍または10倍のヒスチジンタグを精製するための簡単な方法を提供します。可溶性タンパク質と同様に、後続のタグ除去のための親和性タグ（ヒスチジン、連鎖球菌、GST など ）、アフィニティータグの位置、およびプロテアーゼ部位の包含（TEV、エンテロキナーゼ、トロンビン、 等 ）の選択を変化させます。 - PCRは、発現ベクターに適切なプライマーおよびサブクローンを用いて標的配列を増幅します。ライゲーション依存しないクローニング（LIC）サブクローニングのための20,21または従来のクローニング技術（制限酵素/連結）を使用します。しかし、LICは、種々の構築物（切断、タグの様々な、多様なプロモーター）の膨大な数がより平行にクローン化することを可能にする、高スループットを容易にすることができます簡単に。
- インビボでの膜を標的発現には
- OMPは、ダウンストリームおよび発現構築物におけるシグナル配列（ すなわち、のpelB、のOmpA）とインフレームでクローン化された目標βバレルを確認するために配列分析を使用してください。
注：シグナル配列は、外膜にペリプラズム及びその後の組み立てへの分泌のためのSecトランスロコンに新生鎖を導きます。 - BL21（DE3）化学的コンピテント細胞を50μlに、プラスミドの1.0μLをピペットでの発現のための細菌の発現株にコンストラクトを変換し、ピペッティングにより穏やかに混合します。氷上で30分間インキュベートします。
- 水浴を用いて30秒間42ºCでの熱パルスした後、1分間氷上に戻って置きます。
- 予め温めておいたSOC培地の1ミリリットルを追加し、ベンチトップシェーカーインキュベーターを用いて、1000rpmで1時間、37ºCで振ります。
- 適切antibiotを含むLB寒天プレート上に細胞のプレートを100μl反転37ºCで一晩ICとインキュベートします。
- 単一コロニーを5ミリリットルのLB +抗生物質文化を接種することにより小規模発現テストを実行します。 5-10コロニーを繰り返します。
注：ので、βバレルOMPの潜在的毒性および基底発現レベルへの依存のため、コロニー・ツー・コロニーの変動が時々観察されます。そのため、複数のコロニーをスクリーニングすることはテストされている各構築物のために推奨されます。三角フラスコバッフル125ミリリットルで25ミリリットルの文化を成長小規模発現試験ではなく、従来の5ミリリットル文化、ために提案されています。これらの条件は、多くの場合、より優れた大規模な成長に何が起こるかを反映します。さらに、それは成功の様々なレベルが標的タンパク質に応じて報告されているので、培養培地（TB、LB、の2×YT、M9、 等 ）の様々なタイプのもを選別することをお勧めします。- 〜0.6のOD 600に振とうしながら37ºCで成長。
- 広告によって、ターゲットOMPの発現を誘導します各培養チューブに丁1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の5μLをし、さらに1〜2時間を成長させます。
- マイクロ遠心を使用して15,000×gで1分間、各培養物の1ミリリットル（〜0.6のOD 600）を遠心分離することによって、すべてのコロニーのための発現レベルを比較します。
- 上清を除去し、1×SDS-PAGEローディング緩衝液200μl中に細胞を懸濁します。 5分間100ºCで加熱した後、5分間、15,000×gで再び遠心します。
- 10％ゲルの各ウェルに20μLをピペットでSDS-PAGEを用いてサンプルを分析します。定数200 Vで35分間ゲルを実行します。
注：タンパク質標的が適切に折り畳まれたかされている場合には、決定することができるために、この時点では有益であろう。これは、多くの場合、小規模な精製を行うことによって、または熱修正可能をアッセイすることによって達成することができます。
- 最高の発現を示すコロニーを選択し、メディアの12-24 Lを用いた大規模発現を行います。
注：従来の方法は、典型的には、〜0.6のOD 600に振とうしながら37ºCで培養物を成長させ、その後、追加の2-4時間のための適切な誘導物質（IPTGのためのすなわち、0.1〜1 mMのまたはアラビノースのための〜0.2％）で誘導。所望であれば、誘導前に、のように低い°20℃まで温度を低下させ、誘導時間を延長します。- リーキー表現方法については、25ミリリットルが37で培養物に接種成長 OD 600が 〜0.6に達するまで、適切な抗生物質（単数または複数）を含有するLB培地中でC°。そして、TB培地+抗生物質（複数可）の12 1Lのフラスコに接種の1ミリリットルを追加し、（〜3日）飽和まで20℃で成長します。
- 10分間、6000×gでの遠心分離によって細胞を回収します。
- 精製工程の第2.1節に進んまたは-80ºCで長期保存のために液体窒素中で細胞ペレットを凍結します。
- OMPは、ダウンストリームおよび発現構築物におけるシグナル配列（ すなわち、のpelB、のOmpA）とインフレームでクローン化された目標βバレルを確認するために配列分析を使用してください。
- インビトロ Refolための封入体に式チーン
- シグナル配列を含まない発現構築物を確認するために配列分析を使用。シグナル配列の欠如は、封入体として細胞質に蓄積する標的タンパク質を導くであろう。
- 発現のための細菌の発現株に発現構築物を変換します。封入体の発現のために、可能な毒性効果を最小にするために、誘導（ すなわち、IPTG、アラビノースなど ）によって発現を制御するのが最善です。
- プレート適切な抗生物質を含むLB寒天プレート上に形質転換された細胞を100μlと反転37ºCで一晩インキュベートします。
- 単一コロニーを5ミリリットルのLB +抗生物質文化を接種することにより小規模発現テストを実行します。
- 2-4追加のコロニーのための手順を繰り返し1.3.4。
- 〜0.6のOD 600に振とうしながら37ºCで成長。
- 1-2時間のための適切な誘導因子で誘導します。
- すべてのtについて発現レベルを比較彼は、SDS-PAGEを用いて分析することによりコロニー（ステップ1.2.6を参照）。最高の発現を示すコロニーを選択し、メディアの12-24 Lを用いた大規模発現を行います。
- 0.6〜0.8のOD 600まで37℃で細胞を増殖し、3-5時間37℃で誘導します。封入体の発現は、全てのタンパク質発現実験と同様に、式の他のタイプよりも堅牢であるが、発現は、増殖培地、誘導時間、誘導温度、誘導剤の濃度を変化させることによって改善することができます。
- 10分間、6000×gでの遠心分離によって細胞を回収します。
- 精製工程の2.2節に進んまたは-80ºCで長期保存のために液体窒素中で細胞ペレットを凍結します。
2.精製
- 膜画分からの単離
注：可溶性タンパク質とは対照的に、内在性膜タンパク質は、脂質二重層に埋め込まれ、したがってされさらなる精製および分析（ 図5）のためにそれらを抽出するために界面活性剤を必要とします。発現後、βバレルOMPの精製における最初のステップは、膜画分からの抽出です。- 5ミリリットル/グラムの細胞ペーストの割合で溶解緩衝液（50mMのトリス-HCl、pH7.4中、200mMのNaCl、10mMのMgCl 2を、50μg/ mlのAEBSF、5μg/ mlのDNアーゼI）で再懸濁細胞。
- 溶解フレンチプレスまたは細胞ホモジナイザーを用いて細胞。未溶解細胞および細胞破片を除去するために、4ºCで30分間15,000×gで溶解した細胞をスピン。
- 4ºCで1時間、高速（20万XG）で再びきれいなチューブと遠心分離機に上清を移します。得られたペレットは、目的のタンパク質を含有する膜画分です。
- ダウンスホモジナイザーを用いて、第一の膜を転写した後、可溶化緩衝液（50mMのKH 2 PO 4 pH7.5で、200mMのNaCl、20mMのイミダゾールを添加すること、膜画分を再懸濁、pH8.0）に20gの細胞あたり（50ml）で2×濃度で、界面活性剤なし。
- 小さ なビーカーに再懸濁させた膜を注ぎ、界面活性剤（ すなわち、n-ドデシルβ-D-マルトシド（DDM）、ラウリルジメチルアミン-N-オキシド（LDAO）、n-オクチルβ-D-グルコピラノシド（OG）を追加し、トリトンX-100、 等 ）をゆっくり〜10倍の臨界ミセル濃度（CMC）の最終濃度。
- 1×可溶化バッファーの最終濃度まで水で満たします。標的タンパク質を膜から抽出される方法を簡単に応じて、4ºCで0.5〜16時間攪拌します。
注意：洗剤をゆっくり標的タンパク質を抽出するために、膜を可溶化するために使用されます。イオン（SDS、デオキシコール酸）、非イオン性（Elugent、TWEEN、トリトンX-100、OG、DDM）、および両性イオン（LDAO、CHAPS）：ここで用いることができる界面活性剤の3種類があります。精製工程の間に安定した単分散であるタンパク質 - 界面活性剤複合体が大幅膜タンパク質crystallizatの成功に役立ちますイオン。洗剤、それらの特性、CMC情報、および膜タンパク質や他のアプリケーションの精製におけるそれらの使用に関する詳しい情報は、商業的供給業者のウェブサイト上で見つけることができます。 - 4ºCで1時間30万×gで可溶化したサンプルを遠心。上清は現在、界面活性剤で可溶化ターゲットβバレルOMPが含まれています。
- 以下に概説するように、2.3節に進みます。
- 封入体からリフォールディング
注：in vitroでのリフォールディングのために、ターゲットβバレルOMPを直接封入体中に発現されます。ここでの一つの利点は、これらのタンパク質を高レベルで産生することができることです。しかし欠点は、リフォールディングは、しばしば非効率的であり、1リフォールディング実験から次へと変化することです。それでも、成功した構造研究のためにリフォールディングされたタンパク質の多くの例があります。封入体への発現に続いて、1は現在の実験をリフォールディングするための封入体を分離する必要があります秒。- 溶解緩衝液（50mMトリス-HCl、pH7.4、200mMのNaCl、10mMのMgCl 2を、50μg/ mlのAEBSF、5μg/ mlのDNアーゼI、4 mMの2-メルカプトエタノール（BME））あたり（5ミリリットル中に細胞を再懸濁しグラム細胞ペースト）。フレンチプレス、超音波処理、または細胞ホモジナイザーのいずれかを使用して溶解します。
- 4ºCで10分間、6000×gで低速回転によって封入体をペレット。
- ダウンスホモジナイザーを用いて1.0 M尿素25mlに再懸濁することにより、封入体を洗ってください。 4ºCで10分間、6000×gで低速回転によって再びペレット。
- 必要に応じて手順を繰り返し2.2.3。
- 10 mg / mlで2×CMC以上で8.0 M尿素（または6.0 M塩酸グアニジン（のGdCl））を含有する緩衝液に加えて界面活性剤（ すなわち、DDM又はLDAO）を使用して、最終濃度になるまで洗浄した封入体を再懸濁します。
注記：所望であれば、ヒスチジンタグを含む膜タンパク質標的について、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）精製変性COを用いて行うことができます2.3節で以下に概説と同様の最初のステップとして、（8.0 M尿素または6.0 MのGdClで）nditions。 - ゆっくりと（一晩）変性剤を欠く緩衝液中で透析により変性剤を除去することにより、リフォールディング反応を実行します。
注：これは、これを達成するために透析緩衝液のいくつかの変更を取ることができます。封入体は、最初のIMACカラムにバインドされている場合は、まだゆっくりと変性剤を除去するために、バッファを交換することにより、カラムに結合しながら、あるいは、1は、リフォールディング反応を行うことができます。いずれの場合も、これは膜タンパク質であることを覚えておいて、そのため、洗剤は、ターゲットを安定させるために存在しなければなりません。使用されている洗剤は透析可能である場合にも、それは同様に透析緩衝液（複数可）に追加する必要があります。 - 4ºCで1時間200,000×gでリフォールディングサンプルをスピン。上清をリフォールディング界面活性剤で可溶化目標βバレルOMPが含まれています。
- 以下に概説するように、2.3節に進みます。
- 私を使用して精製MAC、イオン交換、およびゲルろ過
注：タンパク質がネイティブに表現するかどうかを、ヒスチジンタグで操作またはインビトロの方法で使用してリフォールディング、界面活性剤が内に保持されなければならない以外は、次に固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）が精製の ために行われている多くのヒスチジンのためのように、可溶性タンパク質をタグ付けされていると仮定すると、目標βバレルOMP可溶化及び安定を維持するための後続のすべてのバッファ。- 1〜5ミリリットルIMACカラムを準備したり、プレパックカラムを使用します。 4℃で、その後のクロマトグラフィーの手順を実行します。防腐剤の痕跡を除去するために水で洗浄します。自動精製システムを使用している場合は、製造元の指示に従って列をインストールします。
- IMAC緩衝液A（50mMのK 2 HPO 4、pH7.5で、200mMのNaCl、0.1％DDM）とIMAC緩衝液B（50mMのK 2 HPO 4、pH7.5で、200mMのNaCl、0.1％の250ミリリットルの500ミリリットルを準備DDM、および1.0 Mイミダゾール）。
注：私は使用することができる他の界面活性剤nclude Cymal-6（0.05％）、トリトンX-100（0.03％）、及びLDAO（0.05％）。 - IMAC緩衝液Aの10カラム容量を用いたIMACカラムを平衡化
- 25mMのミックスの最終濃度までタンパク質試料にイミダゾールを加えます。 2ミリリットル/分で平衡化したIMACカラムにサンプルをロードします。フロースルーを収集します。
- 5カラム容量の緩衝液Bを用いて、イミダゾールの濃度を増加させるの各々とIMACカラムを洗浄（ すなわち、25ミリメートル、50ミリメートル、100ミリモル）。 2ミリリットルの分画での洗浄を収集します。
- 5カラム容量のための250mMの最終濃度で試料を溶出します。 2ミリリットルの画分で溶出されたサンプルを収集します。
- フロースルーを分析し、洗浄画分のSDS-PAGE分析を用いて溶出画分を、280nmでのその吸光度に基づいて（ステップ1.2.6を参照します）。 SDS-PAGE分析によって確認として目標βバレルOMPを含む画分をプールします。
- プールされたサンプルにTEVプロテアーゼを添加することにより、6×ヒスチジンタグを削除します（応じて製造業者のプロトコル）と穏やかに揺らしながら4ºCで一晩インキュベートします。
- 切断されたタグと任意の非切断サンプルから（フロースルー）目標βバレルOMPを分離するために、再度IMACカラムにサンプル/プロテアーゼ溶液をロードします。フロースルーは、タグを欠く切断されたサンプルが含まれています。
注：これはまた、非切断6×ヒスチジンタグ自体を持っているTEV-Hisを、のような任意のプロテアーゼを取り除くことになります。そうでなければ、他の方法は、消化後にプロテアーゼを除去するために必要とされます。 - 必要に応じて、さらにサンプルを精製するために、イオン交換クロマトグラフィーを行います。すべてのバッファに洗剤が含まれていることを確認され、使用する列については、製造元の指示に従ってください。
- 結晶化のために準備するために、25mMのトリス-HCl、pH7.5で、200mMのNaCl、1％OGとして、結晶化に使用される界面活性剤を含有する緩衝液中にゲル濾過カラムにサンプルをロードします。
- 1mlの画分を収集し、USIを分析ngのSDS-PAGE分析（参照 280nmでのその吸光度に基づいて、ステップ1.2.6）。 280 nmでの吸光度を有するプール画分を、それらが標的タンパク質を含有します。 〜を10mg / mlに濃縮します。
注記：所望であれば、適切な折り畳みは、以下に概説するように、熱修正可能アッセイを用いて評価することができます。
- ヒート修正可能アッセイ
注：精製されたβバレルのOMPの適切な折り畳みを監視するための1つの方法は、半ネイティブSDS-PAGE 22を用いた熱修正可能アッセイを実行することです。ここでは、適切に折り畳まれている非加熱サンプルは、一般的に異なる熱変性されたものから移行されます。このプロパティは、のOMP-バレルβに固有であり、広く膜タンパク質のこのファミリーを研究するために使用されます。- 試料を調製する前に、ゲル装置を組み立てます。開始するには、氷のバケツにバッファタンクを配置し、氷で完全に囲みます。ホルダーに社内キャストまたは商業ネイティブ勾配ゲルを挿入し、タンク内に配置します。トンを埋めますランニングバッファー冷たい1×MESと完全に彼がタンク（50mMの2- [N-モルホリノ]エタンスルホン酸、50mMのトリス塩基、1mMのEDTA、0.1％SDS、pHは7.3）。
- ピペット2 1.5mlの微小管への試料（10mg / ml）の0.25μlの。 「ゆ」と「RT」などの他のような一つのラベルを付けます。
- それぞれにサンプルバッファーの9.75μl加え、ピペッティングにより混合します。両方のサンプルに、2×SDSローディング緩衝液（100mMのトリス-HCl、pH6.8の、青、2％SDS、0.2％ブロモフェノール、及び20％グリセロール）10μlを添加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。
- RTで「RT」のサンプルを残しながら5分間95ºCで「ゆ」のサンプルを沸騰させます。簡単に「ゆ」のサンプルをスピン。
- 組み立て済みの天然ゲル上に負荷の両方のサンプルを20μl。ゲルを削除し、結果を可視化するために染色液に浸し一定の150 Vで60分間実行します。
3.結晶化
注：両方の結晶化のために可溶性および膜タンパク質の標的は、サンプルの純度および安定性（ すなわち 、最高の洗浄剤、リガンド、補因子など ）を最大化するための標準プロトコルです。 （1）界面活性剤、（2）バイセル、及び（3）脂質立方相（LCP）（ 図6）23：一般的に、膜タンパク質標的を結晶化するための現在の方法は、二重層に埋め込 まれたタンパク質の両親媒性の要件を満たす三つの主要なアプローチを包含する。可能な場合はナノリットル結晶化ロボットの使用を強く与えられた試料容積についてスクリーニングすることができる条件の数を増やすだけでなく、構造の決意（ 図7）を支援することを目的としたツールの最近の進歩を利用するために推奨されます。
- 洗剤を使用して結晶化
- 〜10 mg / mlでの濃度である、界面活性剤可溶化タンパク質のサンプルを入手します。必要に応じて、detergを低減するために、3％の最終濃度まで試料に直接添加1,2,3- heptanetriolを追加耳鼻咽喉科ミセルサイズ。
- 微粒子および沈殿を除去するために、0.22μmの遠心フィルターを使用してサンプルをフィルタリングします。
- 結晶化ロボットを使用して、いずれかの吊り下げにより、市販の96ウェルの画面を使用してや〜200 nlのタンパク質試料と〜200 nlの結晶化緩衝液で構成滴の滴蒸発法を座っ広いマトリックス結晶化スクリーニングを行います。
- 〜21℃で結晶化プレートをインキュベートします。実体顕微鏡を用いた結晶成長のための週刊版を点検します。
- 系統的な様式で結晶化条件の成分を変化させることによって結晶化リードを最適化する（増加/塩または沈殿剤の濃度、緩衝液のpH、インキュベーション温度を低下させる、および/またはタンパク質濃度）。
- バイセルを用いた結晶化
注：バイセル技術のより詳細なデモは、以前Ujwalとエイブラムソン24によって記載されています。- 準備または3を購入DMPCからなる5％のバイセル混合物：CHAPSO 2.8：1の比で公表されたプロトコル25に従って。他の濃度もまた、必要に応じて、他の脂質および界面活性剤、アッセイ、ならびにことができます。
- 〜10 mg / mlでの濃度である、界面活性剤可溶化タンパク質のサンプルを入手します。
- 1 V / V：4の開始比で、氷上で、バイセル混合物を追加します（タンパク質：バイセル）（ 例えば、タンパク質の40μlにバイセル液10μlを加え、ピペッティングにより急速に混合します）。
- 氷の30〜60分でインキュベートします。
注：タンパク質：バイセルソリューションは、主に明確なままであるべきであるが、多くの場合、わずかに不透明にすることができます。タンパク質ただし、：バイセルソリューションは降水量を示し、乳白色になり、その後、他の変数は（ すなわち、洗剤、緩衝液など）を検定する必要があります。新しいサンプル、やっ小規模試験（8μlのタンパク質と2μlのバイセル）について前に不必要なサンプルの損失を防ぐために、スケールアップに安定性を確認することをお勧めします。 - 結晶化ロボットを使用して、いずれかの吊り下げにより、市販の96ウェルの画面を使用してや〜200 nlのタンパク質試料と〜200 nlの結晶化緩衝液で構成滴の滴蒸発法を座っ広いマトリックス結晶化スクリーニングを行います。
- 〜21℃で結晶化プレートをインキュベートします。実体顕微鏡を用いた結晶成長のための週刊版を点検します。
- 系統的な様式で結晶化条件の成分を変化させることによって結晶化リードを最適化する（増加/塩または沈殿剤の濃度、緩衝液のpH、インキュベーション温度を低下させる、および/またはタンパク質濃度）。
- 脂質立方相を用いて結晶化（LCP）
注：LCP技術のより詳細なデモは、以前リューとCherezov 26,27によって記載されています。- 〜20 mg / mlでの濃度である、界面活性剤可溶化タンパク質のサンプルを入手します。
- プリ暖かいモノオレインへ〜40ºC。負荷他に1気密の100μlの注射器および40μlのタンパク質試料に60μlのモノオレイン。
- 混合性結合器を使用して、空気を導入しないように注意しながら、注射器を接続してください。
- サンプルは半透明で均質になるまで完全にもう一方のシリンジから混合を押し、シリンジプランジャに交互に圧力を適用することによって穏やかに混合します。
- LCP法用に設計された結晶化ロボットを使用して、100 nlのタンパク質試料と750 nlの結晶化緩衝液で構成滴とのサンドイッチスタイルの結晶化プレート（0.1ミリメートルウェル厚さ）で市販の96ウェルスクリーンを用いたスクリーニング広いマトリックス結晶化を行います。
注：必要に応じて、ドロップ率が調整されてもよいです。また、固体カバー（ すなわち、ガラスや厚いプラスチック）をプレートが処理されるように滴が十分に動き回ることができるように傾向がある滴きれいではなく、薄膜を、サポートすることをお勧めします。 - 結晶pをインキュベート〜21℃でlates。実体顕微鏡を用いた結晶成長のための週刊版を点検します。
- 系統的な様式で結晶化条件の成分を変化させることによって結晶化リードを最適化する（増加/塩または沈殿剤の濃度、緩衝液のpH、インキュベーション温度を低下させる、および/またはタンパク質濃度）。
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Representative Results
YiuRはペスト菌に対する推定上のワクチンの標的であるTonB依存鉄トランスポーターである。これは、本来、マイクロアレイアッセイを用いて同定しました。ここでは、X線結晶学を用いYiuRの構造を決定するために取られたステップは（ 図9）に概説されています。クローニングのため、YiuRのDNA配列（マイナスN末端シグナル配列）PCRは、ゲノムDNAから増幅し、N末端pelBシグナル配列およびTEVプロテアーゼ部位、続いて10×ヒスチジンアフィニティータグを含むベクターにサブクローニングしました。発現のために、YiuR含有プラスミド〜0.5 600 ODするBL21（DE3）コンピテント細胞を、5mlのスターター培養物を成長させるために使用される単一のコロニーを形質転換しました。 TB培地750 mlを含む十二のフラスコは、次に、スターター培養物1mlを接種し、20ºC（220 rpmで振盪しながら）で3日間増殖させました。次いで、細胞を、約150〜200を生成し、回収しましたフラッシュた全細胞ペーストgを、液体窒素で冷却し、使用するまで-80ºCで保存しました。
YiuRの精製の ために、細胞を20 gの（1.8mMのKH 2 PO 4、2.7 mMの塩化カリウム、137mMの塩化ナトリウム、pH7.4中の10mMのNa 2 HPO 4）、DNアーゼIを用いて、室温で攪拌し、1×PBS 120mlに再懸濁しましたそして、AEBSFが追加されています。溶解は、ホモジナイザーを2回通過することにより行いました。次いで、溶解物を、（破壊されていない細胞と封入体をスピンダウンする）10分間12,000×gで遠心分離しました。上清を膜画分（YiuR）を含有するペレットで、60分間、235,000×gで再度遠心分離しました。次いで、膜をダウンスホモジナイザーを用いて1×PBS 100mlに再懸濁しました。 YiuRは4ºCで（16時間まで）一晩攪拌し、5％の最終濃度でElugentを使用して膜から抽出/可溶化しました。可溶化した膜は、その後suコマンドで、60分間、371000×gで再び遠心分離しましたYiuRを含む可溶化画分を含むpernatant。 YiuRを単離するために、IMACは、緩衝液A（1×PBS、0.1％DDM）及び緩衝液B（1×PBS、1 Mイミダゾール、0.1％DDM）、30~50ミリモルのイミダゾール濃度で洗浄し、250〜500 mMので溶出を使用して行きました。 N末端 の10倍-ヒスチジンタグを削除するには、TEVとのインキュベーションは、HISプロテアーゼは、1×PBS緩衝液で透析中に4ºCで一晩行いました。次いで、試料を濃縮し、透析を介して、再度IMACカラムに流れを通過し、その後、50mMのトリス-HCl、pH7.5中のイオン交換カラム上で0〜1.0M NaCl勾配を用いてさらに分離しました。 YiuRを含有する画分を濃縮し、プールし、25mMのトリス-HCl、pH7.5で、200mMのNaCl、および0.05％のLDAOを用いたゲル濾過カラム上で実行しました。 YiuRを含有する画分をプールし、結晶化のためミリリットルの10mg /まで濃縮しました。
ブロードマトリックススクリーニングを実施したとの条件が決定しますそれは、いくつかの初期の回折結晶を生成しました。さらなる最適化は、天然のX線回折データを収集するために使用されたより大きな結晶をもたらしました。 図8に示された結晶は1つがここに提示される方法を用いて達成することができる結晶の代表的なものです。洗剤のスクリーニングおよびバイセルからの結晶は、通常、可溶性タンパク質のために得られた結晶の大きさであってもよいです。しかし、LCPからのものは、ほとんどの場合、はるかに小さいです。データは2.65Å分解能に決意を構築するために導いた分子置換に使用されるのに十分に良好でした。
図1. 完全に統合された膜タンパク質の2つのタイプは、αヘリックスとβバレルです 。 β2アドレナリン受容体（PDBコード2RH1、αヘリックス）およびTonB依存トランスポーターのbtuB（PDBコード1NQE、とそれぞれの例は、ここに示しますβバレル）。一番下の行は、膜の図を示しながら、一番上の行には、細胞外の図を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2β バレルのOMPは、多くの異なる機能を提供し、多様な構造を有することができます 。 αヘリックス膜タンパク質は、1つ以上の膜貫通ドメインを含めることができますが、βバレルのOMPは、8月26日ストランドの範囲と各鎖は密接に隣接鎖と相互作用します。溶媒と相互作用する内部残基は、典型的には、極性および親水性であるが、膜と相互作用する外側の残基は、典型的には疎水性です。一番上の行は、細胞外図を示し、中段は、膜の図を示し、下段はperiplasmiを示しCビュー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
共通のβバレルのOMPの2つのタイプの 3 例を 図 。左、TonB依存トランスポーターFEPA（PDBコード1FEP）の構造、細胞外（上）を示す、膜（中央）とペリプラズム（下）の景色。プラグドメインはマゼンタであり、一方βバレルドメインは緑色で示されています。右、オートトランスポーターESTA（PDBコード3KVN）の構造、細胞外（上）を示す、膜（中央）とペリプラズム（下）の景色。パッセンジャードメインは青色である間にβバレルドメインは金に示されている。 より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の上。
βバレルのOMPの生産のためのクローニングおよび発現のパイプラインの 図4 の回路図。リフォールディングのための封入体の中にネイティブの膜発現（左）または式いずれかによって、ターゲットOMPのクローンを作成し、表現するために使用されるパイプラインの回路図（右）。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
βバレルのOMPの単離のための精製、パイプラインの 図5 の回路図。OMに直接発現されているのOMPの抽出に使用されるパイプラインの模式図。ここでは、ターゲットOMPは、抽出物である必要があります適切な洗剤で可溶化により膜から編、次にIMAC、イオン交換クロマトグラフィー、およびゲル濾過により精製した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
βバレルのOMPの結晶を成長させるための結晶化のパイプラインの 図6 の回路図。3つの方法がβバレルのOMPの結晶化のために利用することができます 洗剤スクリーニング、バイセル、および脂質立方相（LCP）を含む。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 大幅βバレルのOMPの決意を構築するために貢献してきた結晶7.新しいツール 。例としては、キラル結晶（SONICC）視覚化（C）、ロボットパック/ロボット（D）の結晶化ロボット/ LCPロボット（A）、UV顕微鏡（B）、二次非線形イメージング、ラスタ/ベクタ/ヘリカルデータ収集方法（Eを含みます）、およびマイクロフォーカスビーム（F）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
プロトコルから得られた結晶の 図8. 代表的イメージが。洗剤スクリーニングおよびバイセルからの結晶は、結晶の大きさであってもよいです通常、可溶性タンパク質に対して得られました。しかし、LCPからのものは、ほとんどの場合、はるかに小さいです。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
、急行クローン、精製、結晶化、および構造を解明するための手順を示す、 ペスト菌 。YiuRの構造決意のために使用される全体的なパイプラインから推定されるワクチンターゲットYiuRための決意を構造化する結晶に構築物から 図9。 クリックしてください。ここで、この図の拡大版を表示します。
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Discussion
βバレルのOMPは、グラム陰性菌、ミトコンドリアと葉緑体中で重要な役割を果たし、これらのそれぞれの細胞小器官の外膜に不可欠な分子メカニズムに関する豊富な情報を提供する構造解析のための重要な標的です。しかし、構造分析のための十分なサンプルを生成することは必ずしも簡単ではないので、一般的なパイプラインを詳細に結晶に構築物からの処理を説明するための、構造決意に対する目標βバレルのOMPの十分な量の生産のために提示されています。これらのプロトコルは、テストの結果、グラム陰性菌から、ほとんどのOMPのために働くことが判明しているが、それには限界が発現および精製のための他の方法が必要になる場合があり、特にミトコンドリアと葉緑体のためのいくつかのターゲットは、ありますがあります。このように、ここでの方法は、ほとんどのグラム陰性細菌からのOMPを伴うプロジェクト、まだ発現レベルのために適用可能であるべきです精製試料の量は、ターゲットOMPに依存して変化します。
構造研究のためのβバレルのOMPの発現のために、2つの一般的なアプローチ、（1）in vivo発現は、外膜とのin vitroリフォールディングのための封入体への（2）式に直接あります。 in vivo発現のアプローチについては、βバレルのOMPは、Eの外膜を標的とします彼らはネイティブに折り畳まれ、膜から直接単離されている大腸菌 。目標が適切に折り畳まれる可能性が高いので、膜への発現が好ましいアプローチです。このアプローチは、通常、全体のタンパク質の低いレベルをもたらすが、それは時々 、in vitroでのリフォールディングに関連する合併症を回避することができます。多くのβバレルのOMPが正常構造の決意4,5,11のために、この方法で表現されています。成功は、しばしば促進T7から低レベルの構成的発現に依存しているシステムを使用して達成されますRが、発現のための誘導に依存している他のシステム（ すなわち、IPTG、アラビノース）も、日常的に成功を収めて使用されています。
直接外膜に発現がペリプラズムに新生βバレルOMPの分泌のために、秒のトランスロコンにリボソーム - 新生鎖複合体を導くN末端シグナル配列を有するように標的タンパク質を必要とします。シグナル配列は内膜のペリプラズム側で切断されるので、シグナル配列は、任意のN末端タグをターゲットに追加先行することが重要です。新生βバレルOMPは、その後、外膜2,3に挿入するためのBAM複合体にペリプラズムを通じてシャペロンに護衛されています。
膜中に過剰発現させることができないターゲットの場合、別のアプローチは、in vitroで 28から30をリフォールディングするための封入体への発現です。このアプローチは、一般的に高レベルと強い発現のOになります標的タンパク質F。リフォールディングは、非効率的であることができるしかし、リフォールディング条件を同定するために挑戦することができます。ターゲットβバレルOMPが正しく折り畳まれたときに加えて、アッセイに困難な場合があります。それでも、成功したのOmpA 31、Ailの19、のOmpF 32、およびVDAC 33を含む構造研究のためにリフォールディングされたタンパク質の多くの例があります。 （ネイティブまたは封入体の中に）すべてで発現するかまたは発現するが、膜（ネイティブ）に正しく組み立てられていないされていないクローンの場合、1は、より密接Eのことを似せ てβバレルを突然変異試みることができます大腸菌 34,35。バレルドメインのβ-信号中のアミノ酸配列は、著しく目標βバレルOMP 11,34の両方の適切な生合成および発現レベルに影響を与えることができるβ-シグナル配列でBAM錯体及び変動による認識およびアセンブリのために重要です、35。 β-Barrの目標を適切に統合エルOMPは膜分画および熱修正可能アッセイ続い洗剤抽出性についてスクリーニングすることによってモニターすることができます。
界面活性剤ミセルの存在下での膜タンパク質の結晶化は最も古い技術であり、従来の可溶性タンパク質の結晶化装置と戦略を簡単に適応することができます。界面活性剤分子と膜埋め込 み領域をマスクすることにより、タンパク質は可溶性タンパク質（ 例えば、結晶化母液と混合し、タンパク質液滴の遅い脱水を引き起こす蒸気拡散装置で囲まれた）と同様に処理することができる濃縮しました。コンセプトはシンプルながら、洗剤の特徴および特性は、通常の結晶化の課題の上に複雑の重要な層を追加します。具体的には、界面活性剤の分子の文字は、経験的にミセルのサイズ、ヘッド基の極性（アニオン性、カチオン性、非イオン性、または含む所与の標的タンパク質に合わせて調整されなければなりません両性イオン性）、炭化水素鎖の長さ、これらの各々は、溶液中の標的膜蛋白質の安定性に影響します。このアプローチの欠点は、非ネイティブの化学的環境、結晶の接点を形成することができる表面領域の潜在的な隠蔽、および界面活性剤濃度の問題があります。
バイセルは、細胞36,37に見られる膜に似た二層構造を模倣する個々の粒子に集合脂質および両親媒性物質（ 例えば、界面活性剤または短鎖脂質）の混合物です。両親媒性物質マスクそれは界面活性剤結晶化ミセルと同様に、その縁部に露出され、この二重層の疎水性コア。これは、標的タンパク質の安定化を助けるために、よりネイティブのような環境を提供します。
膜タンパク質の標的もまた、脂質立方相（LCP）法38を用いて結晶化することができます。 LCPはで、脂質と水との混合により形成された中間相であります連続的な二重層は、溶媒チャンネルの二つの非交差ネットワークが浸透しています。この三次元構造は、主に天然様環境における脂質埋め込まれた膜タンパク質の拡散を可能にし、結晶接触がタンパク質の疎水性および親水性表面の間に形成することができ、それらの順序を高めながら、結晶の全体的な溶媒含量を減少させます。 1990年代に導入されて以来、LCP技術は39,40とのGPCR 41-43をロドプシンなど、多くのとらえどころのない膜タンパク質標的の構造を決定する上で非常に重要となっています。ハイスループットスクリーニングにおけるLCPの使用は、従来のナノリットルの液体処理によって処理することはできません一般的にLCPのために使用される厚さのモノオレインのような特別な規定（ すなわち、LCP固有のロボット、ガスタイトシリンジ、LCP調剤ツール、サンドイッチ結晶化プレートなど）が必要ですロボット。
ゲル濾過クロマトグラフィーは、非常に重要なステップであります一般に、膜タンパク質の結晶化のためには、選択された界面活性剤を安定化することはクロマトグラムによって可視化することができる膜タンパク質ターゲット、のためのものである方法に関する情報が得られるからです。空隙容量、保持時間、およびピークの形状に試料の量を比較することにより、サンプルの全体的な安定性、単分散性にアクセスすることができます。理想的なサンプルは、ボイドボリュームで失われていないサンプルと非常に少ないだろうとガウス分布を持つ単一の対称溶出ピークを持っているでしょう。洗剤C 8 E 4（0.8％）、OG（1.0％）、およびLDAO（0.05％）が日常的に成功を収めβバレルのOMPの結晶化に使用されて開始するには良いものですされています。理想的には、小規模の実験は、結晶化のために最も適切であるかを決定するために界面活性剤のいくつかの界面活性剤またはそれらの混合物の比較が行われます。最も安定であることが判明しているものは、その後、β-BA標的の大規模調製のために使用されますrrelのOMPと結晶化試験のために。
結晶をターゲットβバレルOMP、リード最適化で形成された後（ すなわち、添加剤スクリーニングは、クライオスクリーニング、洗剤添加スクリーニングなど ）および可溶性タンパク質標的と同様の他の技術は、いくつかの違いを用いて追跡することができます。しかし、膜タンパク質を操作するときに非常に便利ですいくつかの最近の進歩があります。具体的には、膜タンパク質の結晶は、多くの場合、様々な理由のために彼らの母液内で検出することが難しいことができます。膜タンパク質は、多くの場合、比較的小さな結晶を形成し、偽陽性は、結晶の最適化を誤った方向に行くことができます。 LCPの特に技術に存在する追加の課題は、結晶が成長する高粘性、多くの場合、不透明な環境を与えられました。これらの問題に対処するための戦略は、天然蛍光タンパク質結晶を区別Fできるように、光顕微鏡と組み合わせて紫外線顕微鏡（UV）の使用を含みますROMには、非蛍光性の塩および界面活性剤結晶（ 図7）。課題は、沈殿剤の分野内で形成タンパク質結晶の陽性同定に、しかし、残っています。フェムト秒の走査レーザーパルスによって撮像されたときSONICC技術44によって実装される結晶はまた、大部分のキラル結晶の周波数倍増効果を利用することによって検出することができます。この高解像度、高コントラスト技術は、条件を不明瞭からサブミクロンの結晶を区別するために使用することができます。
収穫膜タンパク質は、特に界面活性剤とバイセルの結晶化のため、標準的な結晶化技術を用いて行われます。ループは、低倍率顕微鏡と結晶取り付けループ（ すなわち、ナイロン繊維、ワイヤ、またはポリマー）を用いて手で行われます。 βバレルOMP結晶を採取する際に前の極低温液体で凍結急落する過剰な溶媒および凍結保護のウィッキングすることも、標準的な手順です。しかし、収穫LCP成長した結晶のingは結晶がアクセスすることは困難であるとして、サンドイッチプレートから直接採取し、簡単に顕微鏡で観察されないことがあります場合は特に、特定の問題を提示します。 LCP混合物を簡単にループ内で分離することができないため、また、LCPに成長した結晶は時々大量に収穫されなければなりません。
βバレルのOMPのためのデータ収集はわずか数その他の事項も考慮した可溶性タンパク質の結晶を有するように行うことができます。洗剤とバイセル方法によって成長した結晶の大きさは、多くの場合、可溶性タンパク質を用いて成長させたものと同等であるが、LCP法により成長した結晶は、ほとんど有意に小さいです。 LCPマトリクスから採取試料がしばしば観察することが困難である複数の結晶を含むために加えて、1体系diffraに基づく結晶の位置を特定するために、ループ全体をスキャンすることができ、ミニビームとループラスター能力を有するシンクロトロン源を利用する必要がありますction（ 図7）。 LCP結晶の小さなサイズは、放射線損傷にそれらを特に受けやすくなります。従って、複数の結晶からのデータは、多くの場合、完全なデータセットを収集するためにマージされます。
一度十分に回折する結晶が得られ、完全なデータセットが収集され、βバレルのOMPのための構造の決意は、膜タンパク質の結晶は、一般に、より高い溶媒含有量を示すことを念頭において、可溶性タンパク質の場合と同じ手順を用いて達成することができます。すべての結晶学の目標と同じように、可溶性タンパク質または膜タンパク質かどうか、それぞれが独自の課題を提供していますし、その理由のために単一のパイプラインは、直接すべてのターゲットに適用することはできません。したがって、それは彼/彼女のプロジェクトの成功を確実にするために、それに応じてこれらの一般的なプロトコルを調整するための主要研究者（複数可）の仕事です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
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