β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
β-fat OMP kan bare finnes i de ytre membraner av mitokondrier, kloroplaster, og Gram-negative bakterier 1-3. Mens de tjener lignende roller som a-heliks-proteiner, de har en helt annen fold som består av en sentral membran-forankret β-fat domene som strekker seg fra 8-26 antiparallelle P-tråder med hver streng som blir intimt knyttet til de to nabotråder (figur 1 og 2). Den første og siste tråder av β-fat domene deretter kommuniserer med hverandre, nesten utelukkende på en anti-parallell måte (med unntak av mitokondrielle VDAC), for å lukke og forsegle β-fat domene fra den omgivende membran. Alle β-barrel OMPer har ekstracellulære løkker av forskjellig sekvens og lengde som spiller en viktig rolle i ligand interaksjoner og / eller protein-protein kontakter med disse løkker og til å være så store som 75 rester, slik som funnet i transferrin Neisserial binding protein A (TBPA) 4. β-fat OMP kan også ha N-terminale eller C-terminale periplasmatiske utvidelser som fungerer som flere domener for protein funksjonelle formål (f.eks Bama 5-7, fimd 8,9, Fadl 10). Selv om mange typer av β-fat OMPer eksistere 11, to av de vanligste typene er beskrevet nedenfor som eksempler for de som er mindre kjent med banen (1) TonB avhengige transportører og (2) autotransporters.
TonB-avhengige transportører (f.eks FEPA, TBPA, BtuB, Cir, etc.) er avgjørende for nærings import og inneholder en N-terminal plugg domene bestående av ~ 150 rester som er funnet gjemt inne i en C-terminal 22-strandet β- fat domene innebygd i den ytre membran 12 (figur 3). Mens denne pluggen domene hindrer underlaget fra fritt passere gjennom fat domene, underlaget bindende induserer en konformasjonsendring i pluggen domene thved fører til poredannelse (enten ved plugg-omleiring eller ved partiell / fullstendig utstøting av pluggen) som deretter kan lette substrat transport over den ytre membran inn i periplasmaet. TonB avhengige transportører er spesielt viktig for overlevelsen av noen patogene stammer av gram-negative bakterier slik som Neisseria meningitidis som har utviklet seg spesialiserte transportører som kapre næringsstoffer som jern direkte fra humane vertsproteiner 4,13,14.
Autotransporters tilhører den type V sekresjon system av Gram-negative bakterier, og er p-barrel OMP-proteiner som består av en β-fat domene (typisk 12-tråder som med esta og EspP) og en passasjer domene som blir enten utskilt eller presentert på overflaten av cellen 15,16 (figur 3). Disse β-barrel OMPer tjener ofte en viktig rolle i celleoverlevelse og virulens med passasjeren domene tjener enten som en protease, adhesin, og / eller andre effector som formidler patogenesen.
Strukturelle metoder som røntgen-krystallografi, NMR-spektroskopi og elektronmikroskopi (EM) tillater oss å bestemme modeller for OMP ved atom-oppløsning som kan i sin tur brukes til å dechiffrere nøyaktig hvordan de fungerer i den ytre membranen. Denne uvurderlig informasjon kan så brukes for narkotika og vaksineutvikling hvis det er aktuelt. For eksempel er transferrin-bindende protein A (TBPA) finnes på overflaten av Neisseria og er nødvendig for patogenesen fordi den direkte binder human transferrin og deretter trekker og importerer jernet for sin egen overlevelse. Uten TBPA kan Neisseria ikke skatte jern fra menneskelig vert og gjengis ikke-sykdomsfremkallende. Etter at krystallstrukturen til human transferrin bundet til TBPA 4 var løst, ble det mye tydeligere hvordan de to proteinene forbundet, hvilke områder av TBPA mediert interaksjonen, hvilke rester var viktig for jernutvinning ved TBPA, oghvordan man kan utvikle behandlingsformer mot Neisseria målretting TBPA. Derfor, gitt betydningen av β-fat OMP-proteiner i gramnegative bakterier for å overleve og patogenese, samt i mitochondria og kloroplast funksjon, og behovet for ytterligere strukturell informasjon om denne unike klasse av membranproteiner og systemene hvori de fungerer Generelle protokoller presenteres med det overordnede målet om å uttrykke og rense målet OMP på et høyt nivå for karakterisering av strukturelle metoder.
β-fat OMP tjene viktige roller i Gram-negative bakterier, mitokondrier og kloroplaster og er viktige mål for strukturell analyse som tilbyr et vell av informasjon om viktige molekylære mekanismene ved de ytre membranene av disse respektive organeller. Imidlertid produserer nok prøve for strukturell analyse er ikke alltid enkel og derfor en generell rørledning presentert for fremstilling av tilstrekkelige mengder av mål-β-barrel OMPer for strukturbestemmelse, forklarer i detalj fremgangsmåten fra konstruksjoner t…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
SS34 rotor | Sorvall | – | |
Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
Emulsiflex | Avestin | – | |
Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |