Introduction
β-varil OMP sadece mitokondri, kloroplast dış zarlarında bulunan ve Gram-negatif bakteriler 1-3 edilebilir. bunlar α-helikal proteinleri olarak benzer rolleri hizmet ederken, her şerit içten iki komşu şeritlerin bağlı olmak üzere 8-26 adet anti-paralel β-ip kolları arasında değişen bir merkezi doku, gömülü β-barrel alanından oluşan çok farklı kıvrım (Şekil 1 ve 2). β-barrel alan ilk ve son şeritler daha sonra yakın ve çevresindeki membrandan β-barrel alan mühür (mitokondriyal SSVD hariç), bir anti-paralel bir şekilde hemen hemen tamamen birbiriyle etkileşime girer. Tüm β-barrel OMPlerdir Bu döngüler bazen Neisseria transferrin bulunan Pro bağlayıcı 75 kalıntı, kadar büyük olması ile, ligand etkileşimleri ve / veya protein-protein temasları önemli bir rol oynar farklı sekanslarda ve uzunluklarda hücre dışı ilmiklitein A (TbpA) 4. β-varil OMP da proteinin fonksiyonel bir amaç için ek etki hizmet N-terminal ya da C-terminal periplazmik uzantılarına sahip (örneğin, Bama 5-7, Fadl 10 8,9, FimD). Β-varil OMPlerin birçok çeşit 11 bulunmakla birlikte, daha yaygın türlerinden iki alanda, (1) TonB bağımlı nakliyeciler ve (2) autotransporters daha az aşina olanlar için örnekler olarak aşağıda açıklanmıştır.
TonB bağımlı taşıyıcılar (örneğin, FEPA, TbpA, BtuB, Cir, vs.) besin alma için gerekli olan ve bir C-ucu β- 22 bükümlü içinde sıkışmış bulunmuş ~ 150 kalıntısından oluşan bir N-terminal fiş alanı içermektedir varil alanı dış zar 12 (Şekil 3) içine gömülü. Bu fiş alanı serbest kovan alanı üzerinden geçen substratın engellerken, alt-tabaka bağlanma fiş etki th içinde yapısal bir değişikliği indüklerpotansiyel olarak (fiş düzenlenmesi veya fişin kısmi / tam fırlatma yoluyla) daha sonra periplazmaya dış zarından substrat taşımacılığının kolaylaştırılması için oluşumunu gözenek. TonB bağımlı taşıyıcıları örneğin insan konak proteinler 4,13,14 şirketinden demir gibi besin kaçırmak özel taşıyıcılar geliştiğini Neisseria meningitidis gibi gram-negatif bakterilere, bazı patojen soylarının hayatta kalmak için özellikle önemlidir.
Autotransporters olarak salgılanan veya sunulmuştur ya β-barrel alan (ESTA ve EspP gibi, tipik olarak 12-ip kolları) oluşmaktadır olan B-bloğu OMPlerdir ve bir yolcu alan Gram-negatif bakteri türü V salgılama sistemine ait olan olan hücre 15,16 (Şekil 3) yüzeyi. Bu β-barrel OMPlerdir genellikle hizmet yolcu etki hücre hayatta kalma ve virülans önemli roller hizmet ya proteaz adezin, ve / veya diğer EFfector bu patogenezi aracılık eder.
X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopi ve elektron mikroskobu (EM) bize sırayla onlar dış zarının içinde işlev tam olarak nasıl deşifre etmek için kullanılabilir atomik çözünürlükte OMPlerin modelleri belirlemek için izin olarak yapısal yöntemler. Bu paha biçilmez bilgiler daha sonra varsa ilaç ve aşı geliştirilmesi için kullanılabilir. Örneğin, transferin bağlanma proteini A (TbpA) Neisseria yüzeyi üzerinde bulunan ve doğrudan insan transferin bağlanır ve daha sonra özü ve kendi hayatta kalma demir alır, çünkü patogenezi için gereklidir. TbpA olmadan, Neisseria, insan ev sahibi demir temizlemek edemez ve patojenik olmayan bir hale getirilmektedir. TbpA 4 bağlı insan transferin kristal yapısı çözüldü sonra, iki protein ilişkili ne kadar net oldu TbpA ne bölgeleri etkileşimini aracılık, TbpA demir çıkarılması için önemli ne vardı artıkları venasıl bir TbpA hedefleyen Neisseria karşı ilaçlar geliştirebilmek olabilir. Bu nedenle, hayatta kalma ve patogenezinde Gram-negatif bakterilerde β-barrel OMPlerin önemi göz önüne alındığında, aynı zamanda mitokondri ve kloroplast fonksiyonu ve ek yapısal zar proteinlerinin bu eşsiz sınıfı hakkında bilgi ve bunların işlevi de sistemleri için ihtiyaç genel protokoller ifade ve yapısal yöntemlerle karakterizasyonu için yüksek seviyelerde hedef OMPS saflaştırılması genel amacı ile sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonlama ve Ekspresyon
Not: Yapısal çalışmalar etkinleştirmek için, oldukça yüksek oranda saflaştırılmış proteinin yeterli miktarda hazırlanmış olmalıdır ve bu, genel olarak, E. hedef β namlu dış zar proteininin klonlanması ve fazla-ekspresyonu (OMP) ile başlar E. coli (Şekil 4). Bugüne kadar, mitokondriyal SSVD için olanlar dahil bütün β namlu OMP yapılar, bakteriyel olarak salgılanan protein 11 elde edilmiştir. Burada, genel protokoller, in vitro 17 yeniden katlama için kapanım bedenlerine klonlama ve bakteri membranların doğrudan (1) yerli ifadesi için β-varil OMPS ifade ve (2) ifadesi için sunulmuştur.
- Bir tanım yapısı Tasarımı
- Elde veya kodon optimize hedef OMP geni satın alabilirsiniz.
- Satın alma veya T7 ekspresyon vektörü (i) periplazmik lokalizasyon sinyali dizisini ihtiva eden elde, bir N-terminal 6 x-Histidin etiketive membran ya da (ii) 'in vitro tekrar katlanma için dahil organlarına ekspresyonu için bir periplazmik lokalizasyon sinyali dizisi olmadan in vivo ifadesi için bir TEV proteaz Alanı 4,18,19.
Not: Bir N-terminal proteaz klivaj 6x veya 10x-histidin etiketi saflaştırma için kolay bir yöntem sağlayacaktır. Çözünür proteinler gibi, daha sonra etiketi çıkarılması için afinite etiketi (histidin, Strep, GST, vs.), afinite etiketinin pozisyonunda ve bir proteaz bölgesi dahil (TEV, enterokinaz, trombin, vs.) seçimi değişir . - PCR ifade vektörü içine uygun primerler ve alt klon ile bir hedef diziyi çoğaltmak. Ligasyon bağımsız klonlama (KDK) alt klonlama için 20,21 veya geleneksel klonlama teknikleri (restriksiyon enzimleri / ligasyonu) kullanın. Ancak, LIC paralel klonlanmış üzere çeşitli yapıların (kesikler, etiketlerin çeşitli yararlanıcı, çeşitli) büyük bir sayı sağlayan yüksek verim kolaylaştırabilir dahakolayca.
- Vivo Membran-hedeflı dışa
- Bir sinyal sekansı ile hedef OMP aşağı klonlanmış β-varil ve çerçeve içinde doğrulamak için sıralama analizi kullanın (örneğin, pelB, OmpA) ifade yapısında.
Not: sinyal sekansı dış membran içine periplazma ve sonraki meclise salgılanması için Sec translokon için doğmakta zinciri yönlendirir. - BL21 (DE3) 'e kimyasal yetkin hücre 50 ul halinde plazmid 1.0 ul pipetleme ekspresyon için bakterilerin bir ekspresyon suşu içine inşa dönüştürme ve aşağı yukarı pipetleme yavaşça karıştırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- 30 sn su banyosu kullanılarak ve daha sonra 1 dakika boyunca geri buz üzerinde yer için 42 ° C'de ısı darbe.
- önceden ısıtılmış SOC ortamı 1 ml ilave edilir ve bir tezgah üstü çalkalamalı bir inkübatör kullanılarak 1000 rpm'de 1 saat süre ile 37 ° C 'de çalkalanır.
- Uygun bir Antibiot içeren LB agar plakaları üzerine hücreleri plaka 100 ulic gece boyunca 37 ºC ters inkübe ve.
- tek bir koloni ile 5 ml LB + antibiyotik kültürünü aşılayarak küçük ölçekli ifadesi testleri gerçekleştirin. 5-10 koloniler için tekrarlayın.
Not: Çünkü β-varil OMP potansiyel toksisitesi ve bazal ifade düzeyleri üzerine güven, koloni-to-kolonisi değişkenlik bazen görülmektedir. Bu nedenle, birden koloniler tarama her yapı denenmektedir için tavsiye edilir. Erlenmeyer şişelerine bölmeli 125 ml, 25 ml, kültür üretmek küçük ölçekli ekspresyon testleri yerine, geleneksel 5 mi kültürleri için önerilmektedir. Bu durumlar genellikle daha iyi bir büyük ölçekli büyüme ne olacağını yansıtmaktadır. Buna ek olarak, çeşitli başarı seviyeleri, hedef proteine bağlı olarak rapor edilmiştir, çünkü kültür ortamı (TB, LB, 2xYT, M9, vs.) çeşitli türleri de taranması için iyi bir fikirdir.- 0.6 ~ bir OD 600 çalkalanarak 37 ºC'de büyütün.
- reklamın hedef OMP ekspresyonunu indüklerDing her kültür tüpüne 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) 5 ul ve ek 1-2 saat büyümeye olanak sağlar.
- Bir mikro santrifüj kullanılarak 15,000 xg'de 1 dakika boyunca, her kültür, 1 ml (~ 0.6 OD 600) santrifüj tüm koloniler için ekspresyon düzeyleri karşılaştır.
- Süpernatantı ve 1 x SDS-PAGE yükleme tampon maddesinin 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. 5 dakika boyunca 100 ° C'de ısı ve sonra santrifüj tekrar 5 dakika boyunca 15.000 xg'de.
- % 10 jel her oyuğuna 20 ul pipetleme SDS-PAGE kullanarak örnekleri analiz edin. Sabit 200 V'de 35 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı
Not: protein hedefi uygun bir şekilde katlanmış ya da altında olduğunu tespit edebilmek için, bu noktada yararlı olacaktır. Bu, genellikle küçük çaplı saflaştırma yaparak ya da ısı Değiştirilebilirlik için tahlil ile gerçekleştirilebilir.
- En iyi ifadesini gösteren koloni seçin ve orta 12-24 L kullanılarak büyük ölçekli ifadesini gerçekleştirmek.
Not: geleneksel yöntemler, tipik olarak, 0.6 ~ bir OD 600 çalkalanarak 37 ° C'de kültürlerin büyümesini ve daha sonra, uygun bir uyarıcı ile teşvik (örneğin, 0.1-1 IPTG için mM veya p arabinoz% 0.2) ilave bir 2-4 saat boyunca . Arzu edildiği takdirde, indüksiyon öncesinde, düşük ila 20 ° olarak C sıcaklığını düşürmek ve indüksiyon süresi uzatılabilir.- sızan sentezleme yöntemi için, 25 ml'lik bir 37 ° bir kültürü inoküle büyümeye ° C LB ortamında OD 600 ~ 0.6 ulaşana kadar, uygun bir antibiyotik (ler) ihtiva etmektedir. Daha sonra, TBC ortamı artı antibiyotik (ler) in on 1 L şişelere inoküle 1 ml ilave edilir ve (3 gün ~) Satürasyon 20 ° C'de büyütülmüştür.
- 10 dakika için 6000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreleri.
- saflaştırma adımı Bölüm 2.1 geçin veya -80 ° C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak.
- Bir sinyal sekansı ile hedef OMP aşağı klonlanmış β-varil ve çerçeve içinde doğrulamak için sıralama analizi kullanın (örneğin, pelB, OmpA) ifade yapısında.
- İn Vitro REFOL için katma kütlelerinin Expressionding
- bir sinyal sekansı içermeyen sentezleme konstruktunu doğrulamak için sıralama analizi kullanın. Bir sinyal dizisinin olmaması inklüzyon gövdeleri olarak sitoplazmada birikmesine hedef proteini yönlendirir.
- İfade için bakteri bir ifade suşu içine ifade yapısı Transform. Cisimcik ifadesi için, mümkün zehirlenme etkileri en aza indirmek için indüksiyon (örneğin IPTG, arabinoz, vs.) ile ifadesini kontrol etmek için uygundur.
- Levha 100, uygun bir antibiyotik içeren LB agar plakaları üzerine dönüştürülmüş hücrelerin ul ° C, ters bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- tek bir koloni ile 5 ml LB + antibiyotik kültürünü aşılayarak küçük ölçekli ifadesi testleri gerçekleştirin.
- 2-4 ek koloniler için yineleyin 1.3.4.
- 0.6 ~ bir OD 600 çalkalanarak 37 ºC'de büyütün.
- 1-2 saat süreyle uygun bir uyarıcı ile neden olur.
- Tüm T ekspresyon seviyelerini karşılaştırO SDS-PAGE kullanılarak analizi ile kolonilerinin (Adım 1.2.6 bakınız). En iyi ifadesini gösteren koloni seçin ve orta 12-24 L kullanılarak büyük ölçekli ifadesini gerçekleştirin.
- 0.6-0.8 OD 600-37 ° C 'de hücrelerin büyümesine ve 3-5 saat boyunca 37 ° C' de neden olur. inklüzyon gövdelerinin sentezleme Bütün protein sentezleme deneylerinde olduğu gibi, diğer ifade türlerine göre daha güçlü olmasına rağmen, sentezleme büyüme ortamını, indüksiyon süresi, indüksiyon sıcaklığı ve verici ajan konsantrasyonunun değiştirilmesiyle iyileştirilebilir.
- 10 dakika için 6000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreleri.
- saflaştırma adımı Bölüm 2.2 geçin veya -80 ° C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak.
2. Arıtma
- Membran fraksiyonlarından izole
Not: çözünebilir proteinlerin aksine, yekpare zar proteinleri, lipid ikili katmanı içine gömülü ve dolayısıyladaha fazla arıtılmadan ve analiz (Şekil 5) bunları çıkarmak için deterjan gerektirir. ifade eden bir β-barrel OMP Saflaştırmadaki birinci aşama, zar fraksiyonu elde edilen ekstrelerdir.- 5 mL / g hücre pastası bir oranda lisiz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 10 mM MgCI2, 50 ug / ml AEBSF'in, 5 ug / ml DNase I) içinde süspanse hücreleri.
- Lyse bir Fransız basını veya hücre homojenleştirici kullanılarak hücreler. Lizinlerle parçalanmayan hücreler ve hücre artıkları çıkarmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,000 xg'de lize hücreleri dönerler.
- 4 ° C'de 1 saat boyunca yüksek hızda (200,000 x g) yeniden temiz bir tüpe ve santrifüj süpernatant aktarın. Elde edilen pelet, ilgili proteini içeren membran fraksiyonu olup.
- Membran fraksiyonu, ilk membranlar aktarılması, bir Dounce homojenleştirici tekrar süspansiyon kullanılarak ve daha sonra çözücü tampon (50 mM KH 2 PO 4 pH 7.5, 200 mM NaCl eklenerek, 20 mM imidazol, PH 8.0) içinde (deterjansız 2x konsantrasyonda 20 g hücre başına 50 mi).
- Deterjan (yani, N-dodesil-β-D-maltozit (DCM), laurildimetilamin-N-oksit (LDAO), n-oktil-β-D-glukopiranosid, Triton (KK), küçük bir cam bardak içine yeniden süspansiyona alınan zarlar dökün ve ekleme yavaş 10x kritik misel konsantrasyonu (CMC) ~ bir son konsantrasyona kadar X-100, vb.)
- 1x çözücü tampon nihai bir konsantrasyona kadar su ile doldurun. hedef protein membran elde edilir ne kadar kolay bağlı olarak 4 ° C 'de 0.5-16 saat karıştırın.
Not: Deterjan yavaş hedef protein elde etmek için membranlar çözünür kullanılır. İyonik (SDS, deoksikolik asit), iyonik olmayan (Elugent, ara, Triton X-100, RG, DCM) ve zitteriyonik (LDAO, CHAPS): burada kullanılabilir deterjan 3 tipi vardır. saflaştırma aşaması esnasında sabit ve tek dağılımlı olan bir protein bir deterjan kompleksi büyük zar proteini krista başarısı yardımcı olacakiyon. deterjanlar, bunların özellikleri, CMC bilgi ve membran proteinleri ve diğer uygulamaların saflaştırılması bunların kullanımı hakkında daha fazla bilgi ticari tedarikçisi web sitelerinde bulunabilir. - 4 ° C'de 1 saat 300.000 xg'de çözünmüş örnek santrifüj. Süpernatan artık deterjan çözündürülmüş hedef β-barrel OMP içerir.
- aşağıda belirtilen Bölüm 2.3 ile devam edin.
- Katma kütlelerinin arasından refolding
Not: In vitro refolding için, hedef β-varil OMP cisimcikler doğrudan ifade edilir. Burada bir avantajı, bu proteinlerin yüksek düzeyde elde edilebilir olmasıdır. Ancak dezavantajı, tekrar katlama, genellikle verimsiz ve sonraki bir yeniden katlama deney değişmesidir. Yine de, başarılı bir yapısal çalışmalar için refolded olan proteinlerin birçok örnek vardır. cisimcikler içine ifadesini takiben, bir anda deneyi yeniden katlanması için inklüzyon cisimcikleri izole gerekirs.- Her liziz tamponunda yeniden süspanse hücreleri (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 10 mM MgCI2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I, 4 mM 2-merkaptoetanol (BME)) (5 mi g hücre macunu). Lyse bir Fransız basını, sonication veya hücre homojenleştirici kullanarak.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de düşük hızlı bir dönüş ile inklüzyonlar Pelet.
- bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 1.0 M üre, 25 ml içinde yeniden süspanse edilerek Dahil etme gövdelerini yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de düşük hızlı bir dönüş tekrar pelet.
- Adımı tekrarlayın gerekli 2.2.3.
- 10 mg nihai bir konsantrasyona kadar yıkanmış inklüzyon gövdeleri yeniden süspanse / ml 8.0 M üre ihtiva eden bir tampon (veya 6.0 M guanidinyum hidroklorür (GdCl)) 2x CMC ya da daha yüksek bir artı deterjan (yani, DCM veya LDAO).
Not: Histidin etiketi içeren zar proteini hedefler için, arzu edilirse, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) saflaştırma denatüre CO kullanılarak gerçekleştirilebilirBölüm 2.3 aşağıda açıklanana benzer bir ilk adım olarak (8.0 M üre ya da 6.0 M GdCl olarak) şulları. - denatüre eksik tamponunda diyaliz ile denatüre çıkarmadan yavaş yavaş (gece) tarafından refolding reaksiyonu gerçekleştirin.
Not: Bunu gerçekleştirmek için diyaliz tampon çeşitli değişiklikler alabilir. cisimcikler önce bir IMAC kolona bağlı olup olmadığını hala yavaş denatüre kaldırmak için tamponlar alışverişinde sütuna bağlı iken Alternatif olarak, bir yeniden katlama reaksiyonu yapabilirsiniz. Her iki durumda da, bu nedenle, deterjan hedef stabilize mevcut olması gerekir, bir zar proteini olduğunu hatırlayın. Kullanılan deterjan diyaliz ise de, bu da diyaliz tampon maddesi (ler) e ilave edilmesi gerekmektedir. - 4 ° C'de 1 saat 200.000 xg'de tekrar katlanmış örnekleri Spin. Süpernatan yeniden katlanmış deterjan çözündürülmüş hedef β-barrel OMP içerir.
- aşağıda belirtilen Bölüm 2.3 ile devam edin.
- I kullanılarak yapılan saflaştırma işlemiMAC, İyon Değişim ve Jel Filtrasyon
Not: doğal olarak, in vitro yöntemler kullanılarak açık veya tekrar katlanmış olup protein varsayarak, bir histidin etiketi ile işlenmiş olan, daha sonra, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) Deterjan tutulmalıdır hariç Histidin çözünür etiketli proteinlerin çoğu için gibi saflaştırma için gerçekleştirilir Tüm takip eden tampon çözülmüş ve sabit hedef β-barrel OMP tutmak.- 1-5 ml IMAC sütunu hazırlayın ya da bir prepacked sütununu kullanın. 4 ° C'de sonraki kromatografi adımları uygulayın. suyla yıkayın koruyucu herhangi izlerini kaldırmak için. otomatik bir arıtma sistemi kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak sütun gerekmektedir.
- IMAC Tampon A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl,% 0.1 DCM) ve IMAC Tampon B 250 ml (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl,% 0.1 500 ml hazırlanması DCM, ve 1.0 M imidazol).
Not: Kullanılabilecek diğer deterjanlardışmda şimal-6 (% 0.05), Triton X-100 (% 0,03) ve LDAO (% 0.05). - IMAC A tamponu 10 kolon hacmi ile IMAC sütunu dengeye
- 25 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar bir protein örnek imidazol ilave et ve karıştır. 2 mL / dakika dengelenen IMAC kolonu üzerine örnek yükleyin. akışı toplayın.
- 5 kolon hacmi tampon B ile imidazol artan konsantrasyonlarının her biri IMAC sütunu yıkayın (örneğin, 25 mM, 50 mM, 100 mM). 2 ml fraksiyonlar halinde yıkama toplayın.
- 5 kolon hacmi 250 mM'lik bir son konsantrasyon elde numune yıkayın. 2 ml'lik fraksiyonlar içinde elüt örnek toplamak.
- akışı analiz yıkama fraksiyonları ve SDS-PAGE analizi kullanılarak elüsyon fraksiyonları 280 nm'de absorbans göre (Adım 1.2.6 bakınız). SDS-PAGE analizi ile belirlenmiş hedef β-varil OMP ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın.
- Havuza alınan numuneye TEV proteaz ekleyerek 6x-Histidin etiketi kaldırmak (göreüreticinin protokolü) ve hafif hafif sallanarak 4 ° C'de gece boyunca kuluçka için.
- bölünmüş etiketleri ve herhangi bir bölünmemiş örnekten (akmasına) hedef β-varil OMP ayırmak için tekrar bir IMAC kolona örnek / proteaz çözüm yükleyin. Akış yoluyla etiketi eksik bölünmüş numuneyi içerecek.
Not: Bu aynı zamanda gibi herhangi bir proteaz kaldırmak TEV-His, aynı zamanda bir parçalanamayan 6x-Histidin etiketi kendisi vardır. Aksi takdirde, diğer yöntemler sindirimden sonra proteazı kaldırmak için gerekli olacaktır. - İsteğe bağlı olarak, daha da örnek saflaştırmak için iyon değişimi kromatografisi gerçekleştirin. Sütun kullanılmak üzere tüm tamponlarda deterjan içerdiğinden emin olarak, üreticinin talimatlarına uyun.
- Kristalizasyon için hazırlık deterjan ihtiva eden bir tampon maddesi içinde bir jel filtrasyon kolonu üzerine örnek yüklemek için, kristalleştirme için kullanılan, örneğin 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI,% 1 RG olarak.
- 1 ml'lik kesirler toplayın ve USI analizng, SDS-PAGE analizi (bkz Adım 1.2.6) 280 nm'de kendi absorbans dayalı. 280 nm'de absorbans ile Havuz fraksiyonları, hedef protein içerir olarak. ~ 10 mg / ml için konsantre edilir.
Not: İstenirse, uygun bir bölme, aşağıda belirtildiği gibi, bir ısı değiştirilebilirliğini analizi kullanılarak değerlendirilebilir.
- Isı Değiştirilebilirlik Deneyi
Not: Bir yöntem OMPlerdir yarı ana SDS-PAGE 22 kullanan ısı değiştirilebilirliğini testleri gerçekleştirmek için, saflaştırılmış β-varil doğru katlanmasına izlemek için. Burada, düzgün katlanmış olan ısıtılmayan numuneler genellikle farklı ısı denatüre olanlar göç edecektir. Bu özellik OMPS-varil ß benzersiz ve geniş membran proteinlerinin bu aileye incelemek için kullanılır.- Önceki örnekleri hazırlamak için, jel aparat monte edin. Başlamak için, bir buz kovası içine tampon tankı yerleştirin ve buz ile tamamen kuşatır. tutucunun içine bir in-house döküm veya ticari yerli degrade jel yerleştirin ve tanka yerleştirin. t doldurunÇalışma buffer soğuk 1 x MES tamamen o tankı (50 mM 2- [N-morfolino] etansülfonik asit, 50 mM Tris baz, 1 mM EDTA,% 0.1 SDS, pH 7.3).
- Pipet, iki bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine örnek (10 mg / ml), 0.25 ul. 'Haşlanmış' ve 'RT' gibi diğer olarak bir etiketleyin.
- Her numune tamponu 9.75 ul ekleyin ve pipetleme karıştırın. Her iki numune için, 2 x SDS yükleme tamponu (100 mM Tris-HCI, pH 6.8,% 2 SDS,% 0.2 mavi bromofenol ve% 20 gliserol) 10 ul ekle ve pipetleme hafifçe karıştırın.
- Oda sıcaklığında 'RT' örnek çıkarken 5 dakika boyunca 95 ° C'de 'Haşlanmış' örnek kaynatın. 'Haşlanmış' örnek kısaca Spin.
- Yük önceden birleştirilmiş yerli jeli üzerinde her iki numune de 20 ul. sabit 150 V 60 dakika çalıştırın jel çıkarın ve sonuçları görselleştirmek için boyama çözeltisi içinde ıslatın.
3. Kristalizasyon
Not: her iki kristalizasyon içinÇözünür ve zar proteini hedefler, bu örnek saflığı ve stabilite (örneğin, iyi bir deterjan, ligandlar, kofaktörler, vb) üst düzeye çıkarmak için, standart bir protokoldür. (1) deterjan (2) bicelle, ve (3) lipit kübik faz (LCP) (Şekil 6) 23: Genel olarak membran protein hedeflerini kristalize etmek için halihazırda kullanılan yöntemlere iki tabakalı gömülmüş proteinlerin amfifilik gereksinimlerini karşılamak başlıca üç yol kapsamaktadır. Bir nanoliter kristalleşme robot kullanılması önemle tavsiye edilir mümkün yapı tayini (Şekil 7) yardım etmek amaçlı araçlar belirli bir örnek hacmi için elenebilir koşulları sayısını yanı sıra, kullanan son gelişmeleri artırmak amacıyla.
- Kristalizasyon kullanılarak deterjanlar
- ~ 10 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir. İsteğe bağlı olarak, deterg azaltmak için% 3'lük bir son konsantrasyon elde örnek doğrudan ilave 1,2,3-dimerkapto eklemeent misel boyutu.
- parçacık ve yağış kaldırmak için 0.22 mikron santrifüj filtre kullanarak örnek Filtre.
- Bir kristalleşme robot kullanarak, her iki asılı tarafından ticari olarak mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak veya ~ 200 nl protein örnek ve ~ 200 nl kristalleşme tampon oluşan damla damla buharlaşma yöntemi oturan tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
- ~ 21 ° C 'de kristalleşme inkübe edin. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
- sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).
- Bicelles kullanarak kristalleştirme
Not: bicelle tekniklerin daha ayrıntılı bir ispatı Ujwal ve Abramson 24 tarafından tarif edilmiştir.- Hazırlayın veya 3 satınCHAPSO 2.8 bir oranda: yayınlanmış protokollere 25 1 'e göre DMPC oluşan% 5 bicelle karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Diğer konsantrasyonları tahlil, hem de, diğer lipitler ve deterjanlar, gerektiğinde edilebilir.
- ~ 10 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir.
- 1 h / h 4: bir başlangıç oranında, buz üzerinde, bicelle karışımı ekleyin (protein: bicelle) (örneğin, protein 40 ul bicelle karışımı 10 ul ve pipetleme hızla karıştırıldı).
- Buz 30-60 dk inkübe edin.
Not: Protein: bicelle çözümü çoğunlukla açık kalmalıdır ancak genellikle hafif opak açabilirsiniz. Protein, ancak: bicelle Çözelti süt beyazı gösteren çökelmesini döner, daha sonra diğer değişkenler (örn, bir deterjan, tampon, vs.) test edilmelidir. yeni örneklerin yapıyor küçük ölçekli testler (8 ul protein ve 2 ul bicelles) için önce gereksiz örnek kaybını önlemek için ölçeklendirme istikrar doğrulamak için tavsiye edilir. - Bir kristalleşme robot kullanarak, her iki asılı tarafından ticari olarak mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak veya ~ 200 nl protein örnek ve ~ 200 nl kristalleşme tampon oluşan damla damla buharlaşma yöntemi oturan tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
- ~ 21 ° C 'de kristalleşme inkübe edin. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
- sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).
- Lipidik Kübik Faz kullanma kristalleşme (LCP)
Not: LCP tekniklerin daha ayrıntılı bir gösterim önce Liu ve Cherezov 26,27 tarafından tarif edilmiştir.- ~ 20 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir.
- Pre-sıcak monoolein için ~ 40 ° C. Yük60 ul bir gaz geçirmez 100 ul şırınga ve başka içine 40 ul protein örnek içine monoolein.
- Bir karıştırma coupler kullanarak, hava tanıtmak için dikkatli olmak, şırıngalar bağlayın.
- Numune saydam ve homojen hale tamamen kadar diğer bir şırınga karışımı iterek şırınga pistonları üzerinde alternatif basınç uygulayarak hafifçe karıştırın.
- LCP yöntemleri için tasarlanmış bir kristalleşme robot kullanarak, 100 nl protein örnek ve 750 nl kristalleşme tampon oluşan damla sandviç tarzı kristalleşme plakaları (0.1 mm kuyu kalınlığı) ile piyasada mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
Not: Gerekirse Bırak oranları ayarlanabilir. Ayrıca, katı kapaklar (yani, cam ya da kalın plastik) plakaları ele gibi damla hakkında da hareket etmesine izin eğilimindedir damla güzel ziyade ince filmler, destekleyen tavsiye edilir. - kristalleşme p inkübelat'lar ~ 21 ° C de. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
- sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
YiuR Yersinia pestis karşı olası bir aşı hedefi olan bir TonB bağımlı demir taşıyıcıdır. Bu orjinal mikro-dizi analizi kullanılarak belirlenmiştir. Burada, X-ışını kristalografisi kullanarak YiuR yapısını belirlemek için alınmıştır adımlar (Şekil 9) özetlenmiştir. Klonlama için YiuR DNA sekansı (eksi N-terminal sinyal sekansı) PCR genomik DNA'dan kuvvetlendirildi ve TEV proteaz sitesi ardından bir N-terminali pelB sinyal sekansı ve 10x-histidin afinite etiketi içeren bir vektör içine alt klonlandı. Ekspresyon için, YiuR içeren plazmid ~ 0.5 OD 600 BL21 (DE3), yetkili hücreler ve 5 ml'lik bir başlatıcı kültürünün yetiştirilmesi için kullanılan tek bir koloni dönüştürüldü. TB ortamının 750 ml'sini ihtiva Oniki Şişeler daha sonra başlatıcı kültürün 1 ml ile inoküle edildi ve (220 rpm'de çalkalama), 20 ° C 'de 3 gün boyunca büyümeye bırakılmıştır. Hücreler daha sonra yaklaşık 150-200 üreten toplandıFlaş olan toplam hücre pastası g, sıvı azot içinde soğutuldu ve kullanılana kadar -80 ° C'de saklandı.
YiuR saflaştırılması için, hücreler 20 g (1,8 mM KH 2 PO 4, 2.7 mM KCI, 137 mM NaCI, pH 7.4, 10 mM Na 2 HPO 4) DNase I ile oda sıcaklığında karıştırıldı 1x PBS 120 ml içinde tekrar süspanse edildi ve AEBSF eklenir. Liziz, bir homojenleştirici iki aşamada gerçekleştirildi. Lizat daha sonra 10 dakika boyunca 12.000 x g'de (kesiksiz hücreleri ve inklüzyon cisimciği yavaşlamalarını) santrifüjlenmiştir. Süpernatan membran fraksiyonu (YiuR) ihtiva eden pelet, 60 dakika boyunca 235,000 x g hızında tekrar santrifüj edildi. Membranlar daha sonra bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 1 x PBS, 100 ml içinde tekrar süspanse edildi. YiuR 4 ° C'de (16 saat kadar), gece boyunca karıştırıldıktan sonra,% 5 son konsantrasyonda Elugent kullanılarak zarlardan ekstre / çözündürülmüştür. çözündürülmüş Membranlar daha sonra su ile, 60 dakika boyunca 371.000 x g'de tekrar santrifüje tabi tutulduYiuR içeren çözünür fraksiyonu içeren pernatant. YiuR izole etmek için, IMAC Tampon A (1 x PBS,% 0.1 DCM) ve 30-50 mm arasında imidazol konsantrasyonları ile yıkandı ve 250-500 mM ile elüt tampon B (1 x PBS, 1 M imidazol,% 0.1 DCM) kullanılarak gerçekleştirilmiştir . N-terminal 10x-Histidin etiketi kaldırmak için, TEV ile inkübasyon HIS proteaz 1x PBS tamponunda diyaliz sırasında 4 ° C'de gece boyunca gerçekleştirildi. Numune daha sonra konsantre edildi, diyaliz yoluyla, yine bir IMAC kolonu üzerinde akışı geçirilir, ve daha sonra 50 mM Tris-HCI, pH 7.5 içinde bir iyon-değişim kolonu üzerinde 0-1.0 M NaCl gradyanı kullanılarak daha ayrıldı. YiuR ihtiva eden fraksiyonlar daha sonra konsantre edildi, bir araya getirilmiş ve 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI ve% 0.05 LDAO kullanılarak jel süzme sütunu üzerine ran edildi. YiuR içeren fraksiyonlar bir araya toplandı ve kristalizasyon için, 10 mg / ml olacak şekilde konsantre edildi.
Geniş matris taraması sonra gerçekleştirildi ve koşulları belirlenmişBazı başlangıç kırılma kristaller üretti. Bundan başka optimizasyon yerli X-ışını kırınım verileri toplamak için kullanılan daha büyük kristallere neden olmuştur. Şekil 8'de gösterilen Kristaller bir Burada yer alan yöntemler kullanılarak elde edilebilir kristaller temsil etmektedir. Deterjan tarama ve bicelles gelen kristaller genellikle çözünür proteinler için elde edilen kristaller olarak büyük olabilir; Ancak, LCP gelenler hemen hemen her zaman çok daha küçüktür. veri yeterince iyi 2.65 Å çözünürlüğe belirlenmesi yapı yol açan moleküler değiştirme için kullanılacak vardı.
Şekil 1. tam entegre membran proteinlerinin iki tür α-sarmal ve β-varil vardır. β2 adrenerjik reseptör (PDB kodu 2RH1, α-sarmal) ve TonB bağımlı taşıyıcı BtuB (PDB kodu 1NQE her örnekleri burada gösterilenß-varil). Alt satır membran görünümünü gösterirken üst sıra dışı görünümünü göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. β-varil OMP birçok farklı işlevlere hizmet ve farklı yapılara sahip olabilir. α-helikal membran proteinleri, bir ya da daha çok zar geçiş sahası ihtiva de, β-barrel OMPlerdir 8-26 şeritlerin arasında değişir ve her bir şerit yakından komşu şeritler ile etkileşime girer. çözücü ile etkileşim, iç artıkları, tipik olarak polar ve hidrofilik ise membran etkileşim dış kalıntıları, tipik olarak hidrofobiktir. Üst sıra dışı bir görünüşünü göstermektedir, orta sıra membran görünüşünü göstermektedir, ve alt sıra periplasmi gösterirc görünümü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ortak β-varil OMPlerin iki tip 3. Örnekler Şekil. Sol, TonB bağımlı transporter FEPA (PDB kodu 1FEP) yapısı, hücre dışı (üst) gösteren, membran (orta) ve periplazmik (alt) bakıldı. Fiş etki macenta iken β-varil etki yeşil gösterilir. Doğru, Autotransporter ESTA (PDB kodu 3KVN) yapısı, hücre dışı (üst) gösteren, membran (orta) ve periplazmik (alt) bakıldı. Yolcu etki mavi iken β-varil etki altın belirtilir. Daha büyük bir versi görmek için buraya tıklayınızbu rakamın üzerinde.
Şematik β-varil OMPlerin üretimi için klonlama ve ifade boru hattının Şekil 4.. Klonlamak ve (solda) ya yerli zar ifadesi ile bir hedef OMP ifade etmek için kullanılan boru hattının şematik ya da (sağda) yeniden katlama dahil edilme bedenlerine ifade ile. Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil β-barrel OMPlerin izolasyonu için saflaştırma boru hattının 5. şematik. OM doğrudan ifade edilmiştir OMPlerin çıkarılması için kullanılan boru hattının şematik. Burada hedef OMP özü olmak zorundaUygun bir deterjan ile çözünürleştirme ile membrandan ed ve sonra IMAC ile saflaştırılmış, iyon değişim kromatografisi ve jel filtrasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Β-barrel OMPlerin kristalleri büyütmek için kristalleştirme boru hattının Şekil 6. şematik. Üç yöntem β-barrel OMPlerin kristalleştirme için de kullanılabilir Deterjan tarama, bicelles ve lipidik kübik faz (LCP) da dahil olmak üzere. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil anlamlı β-varil OMPlerin belirlenmesi yapılandırmak için katkıda bulunmuştur kristalografide 7. Yeni araçlar. Örnekler kristalleşme robotlar / LCP robotlar (A), UV mikroskopları (B), Kiral Kristallerin İkinci Sipariş Doğrusal Olmayan Görüntüleme (SONICC) görselleştirme (C), robotik diskler / robotlar (D), rasterleme / vektör / sarmal veri toplama yöntemleri (E içerir ), ve Mikrofokus kirişler (F). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protokol Elde edilen kristallerin Şekil 8. Örnek görüntüsü. Deterjan tarama ve bicelles gelen kristallerin kadar büyük olabilirtipik olarak çözünür proteinler için elde edilen; Ancak, LCP gelenler hemen hemen her zaman çok daha küçüktür. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kristaller yapıları itibaren Şekil 9., ifade, arındırmak, klon için atılan adımları gösteren, Yersinia pestis. YiuR yapı tayini için kullanılan genel hattından varsayılan aşı hedefe YiuR için kararlılık yapısını kristalize ve yapısını çözmek için. Tıklayınız burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β-varil OMP bakteri, mitokondri ve kloroplastların Gram-negatif temel rolleri hizmet ve bu ilgili organellerin dış zarlarında da temel moleküler mekanizmaları hakkında bilgi hazinesi sunan yapısal analiz için önemli hedeflerdir. Ancak, yapısal analiz için yeterli örnek üreten her zaman kolay değildir ve bu nedenle, genel bir boru hattı detaylı kristallerine yapılardan sürecini anlatan, yapı tayini için hedef β-varil OMPlerin yeterli miktarda üretimi için sunulmuştur. Bu protokoller, test edilmiş ve gram-negatif bakterilere en OMPlerin çalışmaya bulunmasına rağmen, bu sınırlamalar ifadesi ve saflaştırılması için başka yöntemler gerektirebilir, özellikle mitokondrilerde bazı hedefler vardır vardır. Bu nedenle, burada yöntemleri çoğu Gram-negatif bakteri OMPlerdir içeren projeler, ancak ekspresyon düzeyi için geçerli olmalıdırsaflaştırılmış numunenin s ve miktarı hedef OMP bağlı olarak değişecektir.
Yapısal çalışmalar için β-barrel OMPlerin ekspresyonu için iki genel yaklaşım vardır: (1) doğrudan, in vitro doğallaştırılması için inklüzyon cisimcikleri dış membran (2) ifadesi in vivo ifade. In vivo ekspresyon yaklaşım için, β namlulu OMPlerdir E. dış zar hedeflenir Onlar doğal katlanmış ve membranların doğrudan izole edilmiştir coli. hedefler uygun bir şekilde katlanmış olması muhtemeldir, çünkü membran ifade tercih edilen bir yaklaşım değildir. Bu yaklaşım, tipik olarak toplam proteinin daha düşük seviyelerde elde edilir iken, bazen in vitro tekrar katlanma ilişkili komplikasyonlara yol. Birçok β-varil OMP başarıyla yapı tayini 4,5,11 için bu şekilde ifade edilmiştir. Başarı genellikle T7 teşvik gelen düşük seviyeli yapısal ifadesi dayanan bir sistemi kullanılarak elde edilirR, indüksiyon kullanan ancak diğer sistemler (örneğin, IPTG, arabinoz) ifadesi için de rutin olarak başarı ile kullanılmaktadır.
şirketinden dış zar içine ekspresyon periplazmaya olgunlaşmamış β-barrel OMP salgılanması için, Sec translokon ribozom-olgunlaşmamış zinciri kompleksi yönlendiren bir N-terminal sinyal dizisine sahip olan hedef protein gerektirir. Sinyal sekansı, iç zarı periplazmik tarafında parçalanır, bu nedenle herhangi bir sinyal sekansı, N-terminal etiketler hedefine kadar ilave önce önemlidir. Doğmakta olan β-varil OMP sonra dış membranın 2,3 yerleştirilmek üzere BAM karmaşık periplazmasma yoluyla chaperones eşlik edilir.
Zarına aşırı ifade edilemez hedefler için, alternatif bir yaklaşım, in vitro 28-30 yeniden katlanması için kullanılan gövdelerde ifadesidir. Bu yaklaşım genellikle yüksek düzeyde ve sağlam ifade o sonuçlanırHedef proteinin f. tekrar katlama verimsiz olabilir Ancak, koşulları tekrar katlama belirlemek zor olabilir. Buna ek olarak, hedef β-varil OMP doğru katlandığında tahlil etmek zor olabilir. Yine de, başarılı bir şekilde OMPA 31 Ail 19 OMPF 32 ve SSVD 33 olmak üzere yapısal çalışmalar için refolded olan proteinlerin birçok örnek vardır. (Doğal veya inklüzyon cisimciklerinin içine) hiç ifade veya ifade fakat membran (doğal) doğru şekilde monte edilmez olmayan klonlar, bir daha yakından E. benzemeye β-varil mutasyona deneyebilirsiniz E. coli 34,35. Namlu alanının β-sinyal amino asit sekansı belirgin hedef β-varil OMP 11,34 hem uygun oluşum ve ekspresyon seviyelerini etkileyen β-sinyal sekansı BAM kompleksi ve varyasyonlar ile tanınması ve montaj için önemlidir 35. Hedef Uygun entegrasyon p-BarrEl OMP ısı değiştirilebilirliğini deneyleri takiben membran parçalama ve deterjan ekstrakte taranması ile izlenebilir.
deterjan miseller mevcudiyetinde membran proteinlerinin kristalleştirilmesi en eski teknik ve geleneksel çözünebilir protein kristalizasyon ekipman ve stratejiler kolay uyum sağlar. Membrana deterjan molekülleri ile gömülü bölgeleri maskeleyerek, protein (örn kristalleştirme ana likör ile karıştırılır ve bir protein damla yavaş dehidrasyon neden olan bir su buharı difüzyon aparatı içinde) çözünür proteinler benzer bir şekilde tedavi edilebilir konsantre edildi. kavramı basit olmakla birlikte, deterjan karakteristikleri ve özellikleri, normal kristalleşme zorlukların üstüne karmaşıklığı önemli bir katman ekleyin. Spesifik olarak, bir deterjan molekül karakteri deneysel misel boyutu, kafa grubu polarite (anyonik, katyonik, iyonik olmayan ya da dahil olmak üzere, belirli bir hedef proteine göre belirlenmelidirmelez iyonlu) ve hidrokarbon zinciri uzunluğu, bunların her biri, çözelti halindeki hedef membran proteini stabilitesini etkiledikleri. Bu yaklaşımın dezavantajları yerli olmayan kimyasal ortamı, kristal kişileri ve deterjan konsantrasyonu sorunları oluşturabilir yüzey bölgelerinin potansiyel örtücü içerir.
Bicelles hücreleri 36,37 bulunan membran benzer bir iki tabakalı yapısını taklit eden ayrı ayrı parçacıklar halinde bir araya lipidler ve amfifillerin (örneğin, deterjan ya da kısa zincirli lipid) 'in bir karışımıdır. amfifil maskeleri deterjan kristalizasyonda miseller için benzer bir şekilde kenarlarından maruz Bu iki tabakalı hidrofobik merkez. Bu hedef proteinleri istikrara kavuşturmak için bir daha anadili gibi bir ortam sağlar.
Membran protein hedefleri, aynı zamanda lipidik kübik faz, (LCP) yöntemleri ile 38 kristalleştirilebilir. LCP olarak, lipid ve su karıştırılarak oluşturulan bir mezofaz olansürekli bir iki tabakalı solvent kanalların olmayan iki kesişen ağlar tarafından nüfuz edilir. Üç boyutlu yapı, büyük ölçüde doğal gibi bir ortamda lipid gömülü zar proteinlerinin difüzyonunu sağlar ve kristal iletişim proteinlerin hidrofobik ve hidrofilik yüzeyler arasında meydana olanak sağlar ve sipariş yükselten kristallerin genel çözücü içeriğini azaltır. 1990'larda piyasaya sunulmasından bu yana, LCP teknikleri 39,40 ve GPCRs 41-43 rhodopsins gibi birçok zor zar proteini hedefleri yapılarını belirlemede kritik olmuştur. Yüksek kapasiteli ekranlarında LCP kullanılması geleneksel nanoliter sıvı taşıma tarafından ele alınamaz yaygın LCP için kullanılan kalın monoolein olarak özel hükümler (yani, LCP özel robot, gaz geçirmez şırınga, LCP dağıtım aracı, sandviç kristalleşme plakaları, vb) gerektirir robotlar.
Jel filtrasyon kromatografisi Bir çok önemli bir adımdırGenel olarak membran proteinlerinin kristalleştirme için seçilen deterjan stabilize kromatografisiyle görselleştirilebilir zar proteini hedefi için hakkında bilgi verir, çünkü. boşluk hacmi, tutma süreleri ve zirvelerin şekillerde örnek miktarı karşılaştırılarak, örneğin genel stabilitesi ve bir tekli dağılırlık erişilebilir. İdeal numune boşluk hacminde kayıp hiçbir örneğe çok az olurdu ve bir Gauss dağılımı ile tek bir simetrik elüsyon pik olurdu. Deterjanlar C 8 E 4 (% 0.8), OG (% 1.0) ve LDAO (% 0.05) rutin olarak başarı ile β-varil OMPlerin kristalizasyon için kullanılan ve başlamak iyi olanlar vardır. İdeal olarak, küçük ölçekli deneyler kristalleşme için en uygun olduğunu belirlemek için deterjan birkaç deterjan veya karışımları karşılaştırarak gerçekleştirilir edilmektedir. bulunan olanların en sonra hedef β-ba, büyük ölçekli preparasyon için kullanılan stabilizasyon içinrrel OMP ve kristalleşme denemeleri için.
Kristaller, hedef β-varil OMP, kurşun optimizasyon oluşturulduktan sonra (yani, katkı maddesi taraması, kriyo-eleme, deterjan katkı eleme, vb) ve çözünür protein hedefleri benzer şekilde, diğer teknikler bazı farklılıklar ile takip edilebilir. Ancak, membran proteinleri ile çalışırken son derece yararlı olan bazı son gelişmeler vardır. Özellikle, membran proteini kristalleri genellikle çeşitli nedenlerle için kendi ana likör içinde tespit etmek zor olabilir. Membran proteinleri genellikle nispeten küçük kristaller oluştururlar ve yanlış pozitif kristal optimizasyonu yanıltabilir edebilirsiniz. LCP özellikle teknikleri, bu ek zorluklar, kristaller yetiştirilen oldukça yapışkan, genellikle, opak ortamlar verilen. Stratejiler bu konularda doğal floresan protein kristalleri f ayırt edilmesi için izin ışık mikroskopları ile birlikte ultraviyole mikroskoplar (UV) kullanımını içerir elerom olmayan floresan tuz ve deterjan kristalleri (Şekil 7). Sorunlar çökeltici alanları içinde meydana protein kristalleri olumlu kimlik Ancak kalır. Femtosaniye tarama lazer darbeleri ile görüntülendi zaman SONICC teknolojisi 44 tarafından yürütülen kristalleri de, en kiral kristallerin frekans iki katına etkisi sömürü ile tespit edilebilir. Bu yüksek çözünürlüklü, yüksek kontrastlı tekniği engellemeyecek şartlarından mikron altı kristalleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Hasat zar proteinleri, özellikle deterjan ve bicelle kristalleştirme gibi standart kristalografi teknikler kullanılarak yapılır. Döngü düşük bir büyütme mikroskop ve kristal montaj döngü (yani, naylon elyaf, tel veya polimer) kullanılarak elle gerçekleştirilir. Fazla çözücü ve cryo koruma esneklik önce β-varil OMP kristalleri hasat sırasında da kriyojenik sıvı içinde standart prosedürleri vardır donma atılmak için. Bununla birlikte, hasatLCP Büyüyen kristallerin ing kristalleri erişmek zor olabilir, sandviç plakaları doğrudan hasat ve kolayca mikroskop aracılığıyla görülebilir olmayabilir, özellikle bir problem sunar. LCP karışımı kolayca döngü içinde ayrılamaz çünkü Ayrıca, LCP yetiştirilen kristaller bazen toplu olarak hasat edilmelidir.
β-barrel OMPlerin için veri toplama, sadece birkaç ek değerlendirmeler çözünür protein kristalleri gibi gerçekleştirilebilir. Deterjan ve bicelle yöntemlerle Büyüyen kristallerin boyutu genellikle çözünür proteinler ile yetiştirilen karşılaştırılabilir iken, LCP yöntemiyle geliştirilmişlerdir kristaller hemen hemen her zaman önemli ölçüde daha küçüktür. Numuneler LCP matrisinden hasat çünkü ek olarak, sık sık bir diffra dayalı sistematik kristallerin konumlarını bulmak için tüm döngü tarayabilir mini kiriş ve döngü rasterleme yeteneklere sahip sinkrotron kaynakları kullanmak gerekir, gözlemlemek zor olan çok sayıda kristalleri ihtivaction (Şekil 7). LCP kristallerinin küçük boyutu da radyasyon hasarı onları özellikle duyarlı hale getirir. Bu nedenle birden fazla kristallerden veriler genellikle tam bir veri seti toplamak için birleştirilir.
Bir kez de kırılma kristaller elde edilir ve tam bir veri seti toplanmış, β-barrel OMPlerin yapı tayini zar proteini kristalleri genellikle daha yüksek bir çözücü içeriğine sahip olduklarını göz önünde tutarak, çözünür proteinler ile aynı prosedürler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Tüm kristalografi hedefleri olduğu gibi, çözünebilir protein ya da membran proteini olup, her biri kendi zorlukları sunan ve bu nedenle tek bir boru hattı doğrudan tüm hedeflere için geçerli olabilir. Bu nedenle, onun / onu projenin başarılı olmasını sağlamak için buna göre bu genel protokolleri uyarlamak için birincil araştırmacı (lar) işidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S.
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al.
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
