A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
אנו מדגימים שיטת הקרנת תרופה חדשה לקביעת הזיקה המחייבת של מולקולות תרופה קטנות לחלבון מטרה על ידי יצירת nanoclusters ניאון זהב (Au NCS) בתוך החלבון טעון התרופה, המבוסס על אותות הקרינה הנפלטים על ידי ההפרש NCS Au. חלבונים כגון אלבומין אלבומין האנושי בסרום (HSA) ואלבומין בסרום השור (BSA) נבחרו כמודל החלבונים. ארבע תרופות מולקולריות קטנות (למשל, איבופרופן, קומדין, פניטואין, וsulfanilamide) של זיקות מחייבות שונות לחלבוני אלבומין נבדקות. נמצא כי השיעור של NCS Au ניאון בתוך חלבון אלבומין תרופה טעון היווצרות תנאי denaturing (כלומר, C 60 ° או בנוכחות של אוריאה) הוא איטי יותר מזה שנוצר בחלבון הטהור (ללא תרופות). יתר על כן, עוצמת הניאון של NCS בנוי כפי שנמצאה בקורלציה הפוכה לזיקות מחייבות של תרופות אלה לחלבוני אלבומין. במיוחד,גבוה יותר זיקה לתרופות חלבון מחייבת, איטי קצב היווצרות Au NCS, ובכך עוצמת הקרינה נמוכה של Au NCS התוצאה הוא ציין. עוצמת הקרינה של NCS Au התוצאה לכן מספקת מדד פשוט של הכוח המחייב היחסי של תרופות שונות שנבדקו. שיטה זו היא גם להארכה למדוד קבוע סמים חלבון מחייב הספציפי (K D) פשוט על ידי שינוי תוכן התרופה שנטען מראש בחלבון בריכוז חלבון קבוע. התוצאות שנמדדו להתאים היטב עם הערכים שהתקבלו תוך שימוש בשיטות יוקרה אבל יותר מסובכת אחרות.
albumins סרום כגון אלבומין בסרום אדם (HSA) ואלבומין בסרום שור (BSA) הוא החלבון הנפוץ ביותר בפלזמה ולשחק תפקיד חיוני בשמירה על הלחץ האוסמוטי של תא הדם. הם גם מוכרים כחלבונים מובילים למולקולות קטנות של מסיסות במים נמוכה, כגון סטרואידים, חומצות שומן, הורמוני בלוטת התריס, ועוד מגוון רחב של תרופות. הנכס המחייב (לדוגמא, אתרי קישור, מחייב זיקה או כוח) של מולקולות אלה לסרום albumins מהווה נושא חשוב בהפרמקוקינטיקה. 1-4 שיטות אנליטיות כמה פותחו כדי ללמוד את המאפיינים המחייבים של תרופות שונות לסרום albumins, כגון קריסטלוגרפיה רנטגן, 5,6 תהודה מגנטית גרעינית (NMR), 7-11 והתהודה plasmon פני השטח (SPR), 12,13 וכו ' עם זאת, שיטות אלה מוגבלים על ידי שני תהליך ניתוח מייגע וגוזל זמן (למשל, צמיחה של גביש יחיד לcrystallo רנטגןמחקר גרפי), דרישה של ציוד מיוחד ויקר (SPR), או בצורך של תיוג היקר איזוטופ (NMR) לצורך זיהוי. לכן רצוי מאוד לפתח דרכים חלופיות להקרנת סמים מולקולרית קטנה באופן מהיר, ישר קדימה, ועלות-יעילה.
nanoclusters זהב (Au NCS) הוא סוג מיוחד של nanomaterial, שכולל מספר לעשרות אטומי מתכת בגדלים קטנים יותר מ 2 ננומטר. 14-17 הם משכו תחומי מחקר נרחבים בשל המבנה שלהם הבדיד וגודל תלוי האלקטרוני, 18, 19 וכמו-מולקולריים קליטה ופליטה. 20-23 תכונות חומרים ייחודיים כגון, בפרט הקרינה החזקה, מצאו יישומים מגוונים כגון חישה והדמיה במערכות ביולוגיות. 24-32 ניאון ultrasmall Au NCS יכול להיות מסונתז באמצעות חלבונים פונקציונליים, כגון albumins סרום, כתבנית. 33 בסינתזת חלבון-בתבניות אופיינית של NCS Au, כמות מסוימת של מלחי Au כמוסות ראשונה בתוך החלבון ומופחת לאחר מכן על ידי החלבון עצמו. יכולת הפחתה של החלבון מיוחסת למרכיב פונקציונלי שאריות חומצת אמינו (לדוגמא, טירוזין) שיכול להיות מופעלות על ידי הגדלת ה- pH הפתרון לבסיסי. התגלגלות של מבנה חלבון נחשבת כצעד קריטי להיווצרות של NCS Au. סיבה לכך הוא בחלבון מקופל, יכולות להיחשף קבוצות פונקציונליות הפחתה יותר למלחי Au במארז. חלבון התפרשותו יכול להיות מושגת על ידי טיפול בחום או חשיפה לחומרי denaturing. מבוא של תרופות מולקולריות קטנות יכול להשפיע גם על תהליך התגלגלות, כלומר שינוי טמפרטורת denaturation האמצע ואנתלפיה של התגלגלות. 34,35 ההשפעה של כל הגורמים הללו, בתורו יכולים לבוא לידי ביטוי על ידי קינטיקה ההיווצרות של ניאון Au NCS ובא לידי ביטוי ב עוצמת הקרינה של NCS Au תוצאה. 36
e_content "> וידאו זה מדגים את השיטה של הקרנת סמים על ידי סינתזת Au NCS בחלבוני אלבומין טעון תרופה בטמפרטורה גבוהה (60 מעלות צלזיוס) או בנוכחות של סוכני denaturing (למשל, אוריאה). עוצמת הקרינה של תוצאת Au NCS הוא את הודעת האות. ראשית, NCS Au מסונתז בתבניות HSA וBSA טופלו ב 60 ° C או בנוכחות של אוריאה להראות כיצד חלבון התפרשותו (הנגרם על ידי טיפול בחום או denaturants) משפיע על קינטיקה היווצרות Au NCS. שנית, NCS Au מסונתז בתבניות חלבון מראש עם תרופות שונות, והשפעת טעינת סמים בעוצמות הקרינה היחסית של התוצאה Au NCS היא למדה, המספקים מדד לכוח מחייב יחסית. לבסוף, פרוטוקול הקרנת Au NC-התרופה שונה ל מדידת כמותית של מתמיד מחייב תרופה-חלבון (K D) על ידי שינוי תוכן התרופה שנטען מראש בחלבון של ריכוז קבוע.ישנם מספר צעדים קריטיים שצריך להיות מודגשים בשיטה זו. בפרוטוקול של הקרנת הזיקה מחייבת היחסית של תרופות מולקולריות קטנות שונות, שלבי 3.1.2, 3.1.3, ו3.1.4 הם קריטיים כדי להשיג תוצאות טובות מראה מגמה עקבית לכוח המחייב ביחס. בשלבים הבאים, הפעולות של הוספת כימיקלים וציור פתרונות …
The authors have nothing to disclose.
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
384-well plate | Corning | ||
5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
5000 mL Eppendorf tips | |||
1000 mL Eppendorf tips | |||
100 mL Eppendorf tips | |||
1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
20 mL glass vial with screw cap | |||
4 mL glass vial with screw cap |