A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Vi demonstrerer et nyt lægemiddel screeningsmetode til bestemmelse af bindingsaffiniteten af små lægemiddelmolekyler til et målprotein ved at danne fluorescerende guld nanoclusters (Au NCS) i medikamentfyldt protein, baseret på forskellen fluorescens udsendt med Au nationale kontrolsystem. Albumin proteiner, såsom humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er valgt som model proteiner. Fire små molekylære lægemidler (f.eks, ibuprofen, warfarin, phenytoin og sulfanilamid) med forskellige bindingsaffiniteter til albuminproteiner testes. Det konstateredes, at dannelseshastigheden af fluorescerende Au NCs inde i lastet stof albumin protein under denaturerende betingelser (dvs. 60 ° C eller i tilstedeværelse af urea) er langsommere end den, der er dannet i den uberørte protein (uden medicin). Desuden er fluorescensintensiteten af som dannede NCs sig at være omvendt korreleret til bindingsaffiniteterne af disse lægemidler til albuminproteiner. Isærjo højere den lægemiddel-protein bindingsaffinitet, jo langsommere hastigheden af Au NCs dannelse, og er således observeret en lavere fluorescensintensitet af den resulterende Au nationale kontrolsystem. Fluorescensintensiteten af de resulterende Au NCs tilvejebringer derfor et simpelt mål for den relative bindingsstyrke af forskellige testede lægemidler. Denne metode er også forlænges til at måle specifikke lægemiddel-proteinbinding konstant (K D) ved blot at variere indholdet stof indlæst i proteinet ved en fast koncentration protein. De målte resultater passer godt med de værdier, der opnås ved hjælp af andre prestige men mere komplicerede metoder.
Serumalbuminer, såsom humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er den mest rigelige protein i plasma og spiller en afgørende rolle i at opretholde det osmotiske tryk i blodet rum. De er også anerkendt som bærerproteiner for små molekyler med lav vandopløselighed, såsom steroider, fedtsyrer, skjoldbruskkirtelhormoner, og en lang række lægemidler. Bindingen egenskab (f.eks bindingssteder, bindingsaffinitet eller styrke) af disse molekyler til serumalbuminer danner et vigtigt emne i farmakokinetik. Der er blevet udviklet 1-4 Adskillige analysemetoder til at studere bindingsegenskaberne af forskellige lægemidler til serum albuminer, såsom røntgenkrystallografi, 5,6 kernemagnetisk resonans (NMR), 7-11 og overfladeplasmonresonans (SPR), 12,13 mm Imidlertid er disse metoder begrænset af enten en kedelig og tidskrævende proces analyse (f.eks væksten af enkeltkrystal for X-ray Crystallografisk undersøgelse), kravet om specialiseret og dyrt udstyr (SPR), eller har behov for kostbar isotop mærkning (NMR) til detektion. Det er derfor meget ønskeligt at udvikle alternative metoder til små molekylære lægemiddelscreening på en hurtig, straight-forward og omkostningseffektiv måde.
Guld nanoclusters (Au NCS) er en særlig type nanomateriale, som indeholder flere til snesevis af metal atomer med størrelser mindre end 2 nm. 14-17 De har tiltrukket omfattende forskning interesser på grund af deres diskrete og størrelse afhængig elektroniske struktur, 18, 19 og molekylær-lignende absorptioner og emissioner. 20-23 Sådanne unikke materialer egenskaber, især den stærke fluorescens, har fundet forskellige applikationer såsom registrering og billeddannelse i biologiske systemer. 24-32 ultrasmå fluorescerende Au nationale koordinatorer kan syntetiseres ved hjælp af funktionelle proteiner, såsom serumalbuminer, som template. 33 I en typisk protein-template syntese af Au NCS er en vis mængde Au-salte første indkapslet inde i proteinet og efterfølgende reduceres med selve proteinet. Den reducerende evne af proteinet tilskrives bestanddel funktionelle aminosyrerester (f.eks tyrosin), der kan aktiveres ved at øge opløsningens pH til alkalisk. Udfoldning af proteinstruktur betragtes som et afgørende skridt for dannelsen af Au nationale koordinatorer. Dette skyldes, at i en udfoldet protein, kan flere reducerende funktionelle grupper udsættes for de indkapslede Au-salte. Proteinudfoldning kan opnås ved varmebehandling eller udsættelse for denatureringsmidler. Indførelse af små molekylære medicin kan også påvirke udfoldelsen processen, dvs. modificering midtpunktet denatureringstemperatur og enthalpi udfoldelse. 34,35 Virkningen af alle disse faktorer, til gengæld kan afspejles ved dannelse kinetik fluorescerende Au nationale koordinatorer og manifesteret i fluorescensintensiteten af de resulterende Au NCs. 36
e_content "> Denne video viser fremgangsmåden til lægemiddelscreening ved syntese Au NCs i læqemiddelladede albuminproteiner ved en højere temperatur (60 ° C) eller i nærvær af denatureringsmidler (fx urinstof). fluorescensintensitet resulterende Au NCs er det signal udlæsning. Først Au NCs syntetiseret i HSA og BSA skabeloner behandlet ved 60 ° C eller i nærværelse af urinstof at vise, hvordan proteinudfoldning (induceret ved varmebehandling eller denatureringsmidler) påvirker dannelsen kinetik Au NCs. For det andet, Au NCs syntetiseres i protein skabeloner indlæst med forskellige lægemidler, og lægemiddelfyldning effekt på de relative intensiteter af de resulterende Au NCS undersøgt, hvilket giver et mål for relative bindingsstyrke. Endelig er Au NC-lægemiddel-screening protokol modificeret til kvantitativ måling af lægemiddel-proteinbinding konstant (K D) ved at variere lægemiddelindhold indlæst i proteinet af en fast koncentration.Der er flere kritiske trin, der skal fremhæves i denne metode. I protokollen for screening af den relative bindingsaffinitet af forskellige små molekylære lægemidler, trin 3.1.2, 3.1.3 og 3.1.4 er kritiske for at opnå gode resultater, der viser konsekvent tendens for den relative binding styrke. I disse trin, bør handlinger tilføje kemikalier og tegning reaktion løsninger til måling så hurtigt som muligt være at minimere timelag-effekt, og den samme sekvens af at tilføje kemikalier og tegning reaktionsopløs…
The authors have nothing to disclose.
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
384-well plate | Corning | ||
5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
5000 mL Eppendorf tips | |||
1000 mL Eppendorf tips | |||
100 mL Eppendorf tips | |||
1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
20 mL glass vial with screw cap | |||
4 mL glass vial with screw cap |