प्रोटीन को टारगेट कर छोटे अणु दवा स्क्रीनिंग के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक fluorimetric विधि
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
हम Au एनसीएस द्वारा उत्सर्जित अंतर प्रतिदीप्ति संकेत के आधार पर दवा भरी हुई प्रोटीन के भीतर फ्लोरोसेंट सोने nanoclusters (एयू NCS), के गठन से एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए छोटे दवा अणुओं के बंधन आत्मीयता का निर्धारण करने के लिए एक नई दवा स्क्रीनिंग विधि का प्रदर्शन। इस तरह के मानव सीरम albumin (एचएसए) और गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के रूप में एल्बुमिन प्रोटीन मॉडल प्रोटीन के रूप में चुने गए हैं। चार छोटे आणविक दवाओं एल्बुमिन प्रोटीन के लिए अलग बंधन समानताएं के (जैसे, इबुप्रोफेन, warfarin, फ़िनाइटोइन, और sulfanilamide) का परीक्षण कर रहे हैं। यह denaturing शर्तों (यानी, 60 डिग्री सेल्सियस या यूरिया की उपस्थिति में) के तहत दवा भरी हुई एल्बुमिन प्रोटीन अंदर फ्लोरोसेंट Au एनसीएस के गठन की दर (दवाओं के बिना) प्राचीन प्रोटीन में है कि गठन की तुलना में धीमी है कि पाया गया था। इसके अलावा, के रूप में गठित एनसीएस के फ्लोरोसेंट तीव्रता व्युत्क्रमानुपाती एल्बुमिन प्रोटीन के लिए इन दवाओं के बंधन समानताएं के लिए सहसंबद्ध हो पाया है। विशेष रूप से,Au एनसीएस गठन की दर धीमी, दवा प्रोटीन बाध्यकारी आत्मीयता अधिक है, और इस प्रकार परिणामी Au एनसीएस की एक निचली प्रतिदीप्ति तीव्रता मनाया जाता है। परिणामी Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता इसलिए परीक्षण किया विभिन्न दवाओं के रिश्तेदार बाध्यकारी शक्ति का एक सरल उपाय प्रदान करता है। इस विधि को भी बस एक निश्चित प्रोटीन एकाग्रता में प्रोटीन में पहले से लोड दवा सामग्री को अलग से विशिष्ट दवा प्रोटीन बाध्यकारी लगातार (कश्मीर डी) को मापने के लिए बढ़ाई है। मापा परिणामों अन्य प्रतिष्ठा लेकिन और अधिक जटिल तरीकों का उपयोग कर प्राप्त मूल्यों के साथ अच्छी तरह से मेल खाते हैं।
Introduction
इस तरह के मानव सीरम albumin (एचएसए) और गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के रूप में सीरम albumins प्लाज्मा में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन होते हैं और रक्त डिब्बे के आसमाटिक दबाव बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे भी ऐसे स्टेरॉयड के रूप में कम पानी घुलनशीलता के छोटे अणुओं, फैटी एसिड, थायराइड हार्मोन, और दवाओं की एक विस्तृत विविधता के लिए वाहक प्रोटीन के रूप में पहचाने जाते हैं। बाइंडिंग गुण albumins सीरम इन अणुओं के (जैसे, संबंध या ताकत बंधन, बाध्यकारी साइटों) फार्माकोकाइनेटिक्स में एक महत्वपूर्ण विषय रूपों। 1-4 कई विश्लेषणात्मक तरीकों जैसे, albumins सीरम विभिन्न दवाओं के बंधन गुणों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, 5,6 परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), 7-11 और सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), 12,13 आदि हालांकि, इन तरीकों एक कठिन और समय लेने वाली प्रक्रिया का विश्लेषण (या तो द्वारा विवश कर रहे हैं जैसे, एक्स-रे crystallo के लिए एकल क्रिस्टल का विकासग्राफिक अध्ययन), विशिष्ट और महंगे उपकरण की आवश्यकता (एसपीआर), या पता लगाने के लिए महंगा आइसोटोप लेबलिंग (एनएमआर) की जरूरत होती है। यह एक तेज, सीधे आगे है, और लागत प्रभावी ढंग से छोटे आणविक दवा स्क्रीनिंग के लिए वैकल्पिक तरीकों को विकसित करने के लिए इसलिए अति आवश्यक है।
सोने nanoclusters (एयू NCS), के कारण उनके असतत और आकार पर निर्भर इलेक्ट्रॉनिक संरचना, 18 के लिए वे व्यापक अनुसंधान के हितों को आकर्षित किया है 2 एनएम। 14-17 की तुलना में छोटे आकार के साथ धातु परमाणुओं के दसियों के लिए कई होते हैं जो nanomaterial की एक विशेष प्रकार हैं 20-23 ऐसी अनूठी सामग्री गुण, विशेष रूप से मजबूत प्रतिदीप्ति, इस तरह के जैविक प्रणालियों में संवेदन और इमेजिंग। 24-32 ultrasmall फ्लोरोसेंट Au NCS कार्यात्मक प्रोटीन का उपयोग संश्लेषित किया जा सकता के रूप में विविध आवेदन मिल गया है। 19 और आणविक-तरह अवशोषण और उत्सर्जन, ऐसे टेम्पलेट के रूप में सीरम albumins, के रूप में। 33 के एक विशिष्ट प्रोटीन templated संश्लेषण में Au एनसीएस, Au लवण की एक निश्चित राशि पहले प्रोटीन अंदर समझाया और बाद में प्रोटीन से ही कम हो रहे हैं। प्रोटीन को कम करने की क्षमता क्षारीय समाधान पीएच में वृद्धि से सक्रिय किया जा सकता है कि कार्यात्मक अमीनो एसिड के अवशेष (जैसे, टाइरोसीन) संविधान को जिम्मेदार ठहराया है। प्रोटीन संरचना का खुलासा Au एनसीएस के गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में माना जाता है। एक सामने आया प्रोटीन में है, और अधिक कम करने के कार्य समूहों समझाया Au लवण से अवगत कराया जा सकता है क्योंकि यह है। प्रोटीन denaturing एजेंटों को गर्मी उपचार या जोखिम से प्राप्त किया जा सकता खुलासा। छोटे आणविक दवाओं का परिचय भी मध्यबिंदु विकृतीकरण तापमान और खुलासा के तापीय धारिता संशोधित यानी खुलासा प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। 34,35 इन सभी कारकों के प्रभाव, बारी में फ्लोरोसेंट Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स से परिलक्षित किया जा सकता है और में प्रकट परिणामी Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता। 36
e_content "> यह वीडियो एक उच्च तापमान (60 डिग्री सेल्सियस) पर दवा भरी हुई एल्बुमिन प्रोटीन में एयू एनसीएस synthesizing द्वारा या denaturing एजेंट (जैसे, यूरिया) परिणामी Au एनसीएस की। प्रतिदीप्ति तीव्रता की उपस्थिति में दवा स्क्रीनिंग की विधि दर्शाता संकेत readout है। सबसे पहले, Au एनसीएस Au एनसीएस। दूसरा के गठन कैनेटीक्स को प्रभावित करता है प्रोटीन (गर्मी उपचार या denaturants से प्रेरित) खुलासा कैसे दिखाने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर या यूरिया की उपस्थिति में इलाज एचएसए और बीएसए टेम्पलेट्स में संश्लेषित कर रहे हैं, Au एनसीएस विभिन्न दवाओं के साथ पहले से लोड प्रोटीन टेम्पलेट्स में संश्लेषित कर रहे हैं, और उसके एवज में एयू एनसीएस के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता पर दवा लोडिंग प्रभाव रिश्तेदार बाध्यकारी शक्ति के उपाय प्रदान करते हैं, जो अध्ययन किया है। अंत में, Au नेकां दवा स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के लिए संशोधित किया गया है एक निश्चित एकाग्रता के प्रोटीन में पहले से लोड दवा सामग्री को अलग से दवा प्रोटीन बाध्यकारी लगातार (कश्मीर डी) के मात्रात्मक माप।Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि में प्रकाश डाला करने की जरूरत है कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। , विभिन्न छोटे आणविक दवाओं के रिश्तेदार बंधन आत्मीयता स्क्रीनिंग के प्रोटोकॉल चरणों में 3.1.2, 3.1.3, और 3.1.4 रिश्तेदार बाध्यकारी शक्ति के…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
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