Epitelcelle repopulation og klargjøring av gnagere Ekstracellulær Matrix Stillas for Nedsatt Tissue Development
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Denne protokollen beskriver generasjon acellulær, ennå biofunksjonell, nyre ekstracellulære matrix (ECM) stillasene som er nyttige som småskala modell substrater for organ-skala vev utvikling. Sprague Dawley rotter nyrer kanylert ved å sette inn et kateter inn i nyrearterien og perfusert med en serie med lav konsentrasjon detergenter (Triton X-100 og natriumdodecylsulfat (SDS)) i løpet av 26 timer for å utlede intakte, hele nyre stillaser med intakte perfusable blodkar, glomeruli, og nyretubuli. Etter decellularization blir nedsatt stillaset plassert inne i et spesiallaget perfusjon bioreaktor fartøyet og kateterisert nyrearterien er forbundet med en perfusjon krets bestående av: en peristaltisk pumpe; rør; og valgfrie prober for pH, oppløst oksygen, og trykk. Etter sterilisering stillaset med pereddiksyre og etanol, og balansere pH (7,4), er nyrene stillaset forberedt for såing via perfusjon av kulturmedium i et large-kapasitet inkubator holdt ved 37 ° C og 5% CO2. Førti million renal cortical rørformet epiteliale (RCTE) celler blir injisert inn i nyrearterien, og hurtig perfusert gjennom stillaset under høyt strømning (25 ml / min) og trykk (~ 230 mm Hg) i 15 minutter før å redusere strømmen til et fysiologisk hastighet (4 ml / min). RCTE cellene primært fylle røret ECM nisje innenfor nyrebarken, spre seg, og danner rørformede epiteliale strukturer over syv dager perfusjon kultur. En 44 mM løsning resazurin i kulturmedium blir perfusert gjennom nyrene i 1 time under mellom utvekslinger for å tilveiebringe en fluorometrisk, redoks-baserte metabolsk vurdering av cellenes levedyktighet og proliferasjon i løpet av tubulogenesis. Nyrene perfusjon bioreaktor tillater ikke-invasiv prøvetaking av medium for biokjemisk vurdering, og flere innløpsporter tillate alternative retrograd seeding gjennom renal blodåre eller ureter. Disse protokoller kan anvendes for å recellularize nyre stillaser med enrekke celletyper, inkludert vaskulær endotelial, rørformet epitelial, stromal og fibroblaster, for rask evaluering i dette systemet.
Introduction
Ettersom antallet pasienter som lider av slutt nyresvikt fortsetter å øke, er det en alvorlig og økende mangel i antallet donornyrer tilgjengelig for transplantasjon. Manglende evne til å møte etterspørselen av et stadig økende antall kandidater vente-oppført for nyretransplantasjon har bedt om forskning i nyre organ teknikk med det endelige målet om å utvikle tilpassede, implanterbare nyre grafts on demand 1,2. Bygge fungerende nyre vev fra pasientens egne celler vil eliminere behovet for livslang immunsuppresjon, redusere mengden av tid pasienter bruker på dialyse venter på en nyretransplantasjon, og forlenge livreddende transplantasjon til flere pasienter med kronisk nyresykdom.
Det første skrittet mot bioteknologi en nyre vev ved hjelp av pasient avledet celler er å utvikle et stillas som fungerer som et støttende underlag for nyreparenchymet (f.eks tubulær epitheLIAL), stroma fibroblast, og vaskulær cellevekst. Biomateriale stillasene som stammer fra naturlige organ ekstracellulære matriser (ECM'er) har flere egenskaper som gjør dem attraktive for bruk i tissue engineering, inkludert deres naturlige biologiske sammensetning; hensiktsmessig makro- og mikro å gi gave til fysiologiske funksjon; og cellulær biokompatibilitet, fremme celle adhesjon, migrasjon, og konstruktiv vevsremodelleringen tre. En lovende metode for å produsere stillaser for nyre vev gjenfødelse er gjennom decellularization av allogene eller xenogene nyrer som bevare mye av den komplekse naturlige proteinsammensetningen i nyrene ECM 4, beholde den iboende arkitektoniske intricacy av orgelet, og overvinne vanskelighetene forbundet med bunn- opp prosjektering av tykke cellularized vev ved å tilby en vaskulær forsyning til utviklings celler etter stillas recellularization 5.
Perfusjon decellularization er en prosesssom vaskemidler, enzymer, eller andre celleforstyrrende løsninger er jevnt levert gjennom den vaskulære nettverk av organet 6. Denne strategien har blitt etablert som en effektiv prosess for å utlede acellulære orgelbasert ECM stillasene som tredimensjonale (3D), biologiske maler for hel-orgel ingeniør 6-8, noe som gjenspeiles av utviklingen av acellulære nyre maler fra kasserte menneskelige nyrer 9 og xenogene nyrer hentet fra store dyr (f.eks gris 10, geit 11) og gnager kilder 12. Særlig bruk av små dyremodeller slik som gnagere krever færre celler og kulturmedia, som er spesielt nyttig for organ recellularization studier hvor celletall er vanligvis begrenset, slik tilfellet er med stamcelle-avledet vev. Målet med den beskrevne decellularization protokollen er å frembringe en acellulær nedsatt ECM som kan brukes som et 3D stillassystem for regenerering av nyre Struktureringes, inkludert nevronet rørelementer som er skar i det foreliggende eksempel med human renal cortical rørformet epiteliale (RCTE) celler. Vi har tidligere beskrevet vår grundig evaluering av en optimal, vaskemiddel-baserte rottenyre decellularization protokoll 7, som er hurtigere (ca. en dag) enn andre metoder som tidligere er rapportert (Ross et al .- 5 dager 12, Song et al .- 4,5 dager 13), og eksponerer organ til en betydelig lavere konsentrasjon (0,1%) av denaturant natriumdodecylsulfat (SDS) under decellularization enn tidligere rapporter 12-15.
Et begrenset antall studier har beskrevet bruk av gnager nyrer for decellularization og påfølgende bruk som en 3D stillas for cellulær repopulation (gjennomgått andre steder 1) 12-16. I denne protokollen, gir vi en detaljert beskrivelse av vår tidligere etablert, optimal decellularization strategi for å produsere acellulære nyre stillaserfra Sprague Dawley rotte nyrer 7. Ved hjelp av spesialdesignede perfusjon bioreaktorer stand til dual seeding og vedlikehold perfusjon kultur 17, recellularize vi acellulære nyre stillasene med menneskelige RCTE celler, som konsekvent fylle den rørformede komponent i disse decellularized matriser, sprer, og overleve i perfusjon kultur i over en uke. Vi viser videre vår bruk av resazurin perfusjon assay – en billig, ikke-cytotoksiske og ikke-invasiv metabolsk vurderings tidligere ble brukt for cytotoksisitet studerer 17 – å tilveiebringe en indikasjon på cellelevedyktigheten og proliferasjon innenfor recellularized nyrene over tid 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne decellularization protokollen produserer konsekvent et helt acellulær nyre ECM som fungerer som en 3D-templat for dyrking av humane renale kortikale tubulære epitelceller (både proksimale og distale tubuli-avledet), i tillegg til vaskulære endotelceller 7,17. Den cannulated nedsatt blodkar fungerer som den viktigste funksjonen for jevn fordeling av reagenser og celler i hele stillaset i en bioreaktor set-up, og dermed gjør de perfusjon decellularization, celle seeding, langsiktig perfusjon …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
