Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

Published: August 10, 2015 doi: 10.3791/53271
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4, 1,2, 1,2, 5, 6, 7,8, 1,2,3,4,8,9
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

ERRATUM NOTICE

Abstract

פרוטוקול זה מפרט את הדור של acellular, עדיין פיגומי biofunctional, כליות מטריצה ​​תאית (ECM), כי הם שימושיים כמו מצעי דגם בקנה מידה קטנה לפיתוח רקמות איבר בקנה מידה. כליות עכברוש ספראג Dawley הם cannulated ידי החדרת צנתר לעורק הכליה וperfused עם סדרה של חומרי ניקוי נמוך ריכוז (Triton X-100 וסולפט dodecyl נתרן (SDS)) מעל 26 שעות כדי להפיק פיגומים עם שלם ללא פגע, כל-הכליה כלי דם perfusable, glomeruli, וtubules כליות. בעקבות decellularization, פיגום הכליות ממוקם בתוך כלי bioreactor זלוף אישית מעוצב, ועורק הכליה צינתור מחובר למעגל זלוף הכולל: משאבת peristaltic; צינורות; ובדיקות אופציונליות עבור pH, חמצן מומס, ולחץ. לאחר חיטוי הפיגום עם חומצת peracetic ואתנול, ואיזון רמת החומציות (7.4), פיגום הכליה מוכן לזריעה באמצעות טפטוף של מדיום התרבות בתוך largחממת דואר קיבולת נשמרה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ארבעים מיליון אפיתל צינורי קליפת המוח תאי כליה (RCTE) מוזרקים דרך עורק הכליה, ומהירות perfused דרך הפיגום תחת זרימה גבוהה (25 מיליליטר / דקה) ולחץ (~ 230 מ"מ כספית) במשך 15 דקות לפני הפחתת הזרימה לשיעור פיסיולוגי (4 מיליליטר / דקה). תאי RCTE בעיקר לאכלס את הנישה ECM צינור בתוך קליפת הכליה, להתרבות, וליצור מבני אפיתל צינורי בשבעה ימים של תרבות זלוף. פתרון resazurin 44 מיקרומטר במדיום תרבות perfused דרך הכליות עבור שעה 1 בחילופים בינוניים לספק הערכת fluorometric, המבוסס על חיזור חילוף חומרים של כדאיות תא ושגשוג במהלך tubulogenesis. Bioreactor זלוף הכליות מאפשר דגימה לא פולשנית של מדיום להערכה ביוכימי, ויציאות כניסה מרובות לאפשר זריעת מדרדר חלופית דרך הווריד או השופכן כליות. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לrecellularize פיגומי כליות עםמגוון רחב של סוגי תאים, כולל אנדותל כלי דם, אפיתל צינורי, וfibroblasts סטרומה, להערכה מהירה בתוך מערכת זו.

Introduction

ככל שמספר חולים הסובלים מאי ספיקת כליות סופנית ממשיך להגדיל, יש מחסור חמור וגובר במספר כליות תורם זמינים להשתלה. חוסר היכולת לעמוד בביקוש של מספר עולה הרף של מועמדים ברשימת הממתינים להשתלת כליה גרמה מחקר בהנדסת איבר כליות עם המטרה הסופית של פיתוח מותאם אישית, שתלי כליה מושתלים בביקוש 1,2. בניית רקמות כליה מתפקדות מהתאים של חולה היה מבטלת את הצורך בדיכוי חיסוני לכל החיים, להקטין את כמות זמן חולים מוציאים על דיאליזה מחכים להשתלת כליה, ולהרחיב את ההשתלה להצלת חיים ליותר חולים עם מחלת כליות כרונית.

הצעד הראשון לקראת ביו-הנדסת רקמות כליה באמצעות תאים שמקורם בחולה הוא לפתח פיגום שמשמש כמצע תומך לparenchyma כליות (למשל epithe צינוריליאל), פיברובלסטים סטרומה, וצמיחת תאי כלי דם. יש לי פיגומים ביולוגי המופקים ממטריצות איבר טבעי תאיים (ECMS) כמה מאפיינים שהופכים אותם רצויים לשימוש בהנדסת רקמות, כולל ההרכב הביולוגי הטבעי שלהם; מאקרו ומייקרו המתאימים להעניק תפקוד פיסיולוגי; והתאמה ביולוגית סלולרית, קידום הידבקות תא, הגירה, ורקמה בונה שיפוץ 3. שיטה מבטיחה לייצר פיגומים לשחזור רקמות כליה היא באמצעות decellularization של כליות אלוגנאית או xenogeneic שלשמר הרבה של הרכב החלבון טבעי המורכב של ECM הכליות 4, לשמר את המורכבות אדריכליות הגלומות של האיבר, ולהתגבר על הקושי קשור לישבנים עד הנדסת רקמות cellularized העבות על ידי מתן אספקת דם לתאי פיתוח לאחר recellularization הפיגום 5.

decellularization זלוף הוא תהליך בחומרי ניקוי, אנזימים, או פתרונות הפוגעים בתאים אחרים שמועברים באופן אחיד דרך רשת כלי הדם של האיבר 6. אסטרטגיה זו כבר נקבעה כתהליך יעיל להפיק פיגומי ECM מבוסס איבר acellular כשלושה ממדים (3D), תבניות ביולוגיות להנדסה כל-איבר 6-8, כפי שמעיד על ההתפתחות של תבניות כליות acellular מכליות אדם מושלכות 9 וכליות xenogeneic התקבלו מבעלי החיים גדולים (למשל חזיר 10, עז 11) ומקורות 12 מכרסמים. בפרט, השימוש במודלים של בעלי חיים קטנים כגון מכרסמים דורשים פחות תאים ותקשורת ותרבות, שהוא מועיל במיוחד ללימודי recellularization האיבר שבו מספרים סלולריים מוגבלים בדרך כלל, כמו במקרה עם רקמות המופקים מתאי גזע. המטרה של פרוטוקול decellularization המתואר היא לייצר ECM כליות acellular שיכול לשמש כמערכת פיגומי 3D להתחדשות של structur הכליותes, כולל tubules נפרון שאוכלסו מחדש בדוגמא הנוכחית עם אפיתל צינורי קליפת המוח כליות אדם תאים (RCTE). אנחנו שתוארו קודם לכן ההערכה הקפדני שלנו של פרוטוקול אופטימלי, המבוסס על חומרי ניקוי decellularization כליות עכברוש 7, שהוא מהיר יותר (יום בערך) יותר מאשר בשיטות אחרות שדווחו בעבר (רוס ואח '.- 5 ימים 12, שיר ואח' .- 4.5 ימים 13), וחושף את האיבר לריכוז נמוך משמעותי (0.1%) של סולפט dodecyl נתרן denaturant (SDS) במהלך decellularization מדיווחים קודמים 12-15.

מספר מצומצם של מחקרים שתיארו את השימוש בכליות מכרסמי decellularization והשימוש הבא כפיגום 3D לאכלוס סלולארי (ביקורת במקומות אחרים 1) 12-16. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של האסטרטגיה שלנו הוקמה בעבר, האופטימלית decellularization לייצור פיגומי כליות acellularמכליות עכברוש ספראג Dawley 7. באמצעות bioreactors זלוף אישית מעוצבת מסוגל תרבות זלוף הכפולה זריעה ותחזוקת 17, אנחנו recellularize פיגומי כליות acellular עם תאי RCTE אנושיים, אשר באופן עקבי לאכלס מחדש את רכיב צינורי במטריצות decellularized אלה, להתרבות, ולשרוד בתרבות זלוף במשך יותר משבוע. בנוסף, אנו מראים השימוש של assay זלוף resazurin - שאינן רעילה לתאים זולים, וההערכה מטבולית לא פולשנית שימש בעבר לרעיל לומד 17 - כדי לספק אינדיקציה לכדאיויות תא ושגשוג בתוך כליות recellularized לאורך זמן 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מסר של אתיקה: כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.

Decellularization 1. הכליות

  1. הכן את פתרונות decellularization. הכינו את הכרכים של ריאגנטים הבאים עבור כל כליה שdecellularized, בתוספת נפח אחד נוסף (למשל, עבור 4 כליות, להכין 5,000 מיליליטר Triton X-100 לצעד 1.1.3.):
    1. הכן 500 מיליליטר המים אוסמוזה הפוכה (ROH 2 O). הערה: לחלופין, מים ללא יונים ניתן להשתמש בשלבים שבי ROH 2 O מצויינים.
    2. הכן 1,000 מיליליטר Triton X-100, 1% (V / V) בROH 2 O. לאט לאט להוסיף 10 מיליליטר טריטון X-100-990 מיליליטר מים בכוס גדולה תחת ערבוב מהיר על צלחת ומערבבים. לאפשר מגיב לפזר לגמרי לפני השימוש (לפחות 10 דקות).
    3. הכן 1,000 מיליליטר Triton X-100, 1% (V / V) בROH 2 O (ספטמברarate נפח).
    4. הכן 1,000 סולפט מיליליטר נתרן dodecyl (SDS), 0.1% (V / V) בROH 2 O. לאט לאט להוסיף 5 מיליליטר SDS (20% מניות פתרון) למיליליטר מים 995 בכוס גדולה תחת ערבוב מהיר על צלחת ומערבבים. לאפשר מגיב לערבב אחיד לפני השימוש (לפחות 10 דקות).
    5. הכן 500 מיליליטר ROH 2 O (נפח נפרד).
  2. הכן כליות לdecellularization.
    1. לשחזר כליות מעכברוש ספראג Dawley זכר (ז 250-300) כפי שתואר קודם לכן 7.
      1. להרדים את העכברוש בזריקת intraperitoneal של pentobarbital (50 מ"ג / קילוגרם משקל גוף). לעתים קרובות לבדוק את עומק ההרדמה (כל 10-15 דקות) על ידי ניטור תפקוד נשימה, קצב לב, ותגובת קמצוץ הבוהן במהלך ניתוח. אם בעל החיים יש קצב נשימה מוגבר או רפלקס דוושה חיובי, לנהל מינון משלים (עם 1/3 ל1/4 של המינון הראשוני) של pentobarbital.
      2. בצע abdomina קו האמצע אורךחתך l לחשוף את הכליות, אב העורקים בבטן, ווריד הנבוב הנחות.
      3. הזרק 2,000 יחידות הפרין USP / קילוגרם משקל גוף לוריד הפין.
      4. לגייס שתי הכליות על ידי נתיחה עדינה. זהירות להפריד הכליות משומן perirenal, תוך שמירה על הקפסולה הכליות המקיפה את הכליה בשלמותה. Perfuse הכליות עם מי מלח קר (10 מיליליטר) דרך אב העורקים בבטן אינפרא כליות.
    2. הכנס קטטר 24 מד לתוך עורק הכליה, בחוזקה ולקשור את הקטטר לעורק, ו( באמצעות מזרק) בעדינות perfuse הכליות עם 10 מיליליטר פוספט שנאגרו מלוח קר (PBS) לברור לחלוטין האיבר של דם.
    3. לטבול את הכליות ב 25 מיליליטר PBS בתוך צלחת פטרי ומקום במקפיא C -20 ° להקפיא בהדרגה את האיבר (ובכך גרימת תמוגה תא) לאחסון עד decellularization.
      הערה: אם רוצה, וריד שופכן ו / או כליות יכול להיות גם cannulated לזריעה מדרדר, אם כי לא תאר בתיפרוטוקול של.
    4. לגמרי להפשיר את הכליות הקפואות (equilibriate בטמפרטורת חדר (RT)), ובעדינות perfuse עם 10 מיליליטר של PBS כדי לבדוק את עורק הכליה ligated להדלפות. אם הדלפות או התנגדות משמעותית הם נצפו, מחדש קטטר עורק הכליה.
  3. הכן ציוד לdecellularization. להרכיב את מערכת זלוף decellularization כמתואר באיור 1.
    1. חבר "אורכו של צינור משאבת peristaltic (איור 1D, ו) לשני אורכים מספיק (> 36" אחד 8 מומלצים) של 1/16 "צינורות פנימיים בקוטר (ID) גומי סיליקון (1D איור, ח). השתמש בשני מנעול Luer זכר ל1/8 "מתאמי תיל הצטרפו נקבה אחת Luer x מתאם Luer נקבה להצטרף מגזרים של צינורות (איור 1D, י). הכנס מנעול Luer זכר נוסף ל1/8 "מתאם תיל (1D איור, ג) לסוף במורד הזרם של קו זלוף לקובץ מצורף לכליותצנתר עורקים.
    2. חבר כל מגזר צינורות משאבת peristaltic לראש משאבת 4 רולר-שימוש במחסנית משאבה גדולה.
    3. לאחר שהניח את הסוף במעלה הזרם של צינור גומי סיליקון במאגר הפתרון הראשון (ROH 2 O), החזק את לחצן "ראש" לראש מלא כל מעגל זלוף עם פתרון. קריטי: ודא שאין בועות תישארנה בפח בצינור, וכי בסופו במעלה הזרם (משמאל הפתוח לצייר נוזל) של צינור גומי סיליקון מאובטח מתחת לממשק נוזל האוויר של המאגר מגיב, כמתואר באיור 1.
  4. בצע את פרוטוקול decellularization בשעה 7 RT.
    1. חבר את הקטטר עורק הכליה של כל כליה מופשר לסוף צינור מעגל זלוף במורד הזרם מהמשאבה, להבטיח כי אין בועות אוויר כלואות בקטטר. לאפשר לכליות להיות מושעים לאורך הקיר הפנימי של כוס 5 L (מאגר אוסף perfusate ריק, ראה איור1B יור), כך שעורק הכליה אינו מפותל או מפותל.
    2. התאם את כונן המשאבה עד 5 מיליליטר / דקה, ולחץ על הכפתור "התחל". ודא שכל כליה היא מרוססת על ידי התבוננות בטפטוף פתרונות מהחלק התחתון של האיבר.
    3. Perfuse כל כליה עם ריאגנטים הבאים כמתואר באיור 1 א
      1. Perfuse עם 500 מיליליטר ROH 2 O ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 1, 40 דקות.
      2. Perfuse עם 1,000 מיליליטר 1% Triton X-100 ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 3, 20 דק '.
      3. Perfuse עם 1,000 מיליליטר 1% Triton X-100 ב 1 מיליליטר / דקה במשך 16 שעות, 40 דקות.
      4. Perfuse עם 1,000 מיליליטר 0.1% SDS ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 3, 20 דק '.
      5. Perfuse עם 500 מיליליטר ROH 2 O ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 1, 40 דקות.
        הערה: כל כליות decellularized עשויות להיות מאוחסנים בPBS (ללא תוספים) בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 4 מעלות צלזיוס עד למקסימום של שבועיים לפני השימוש.

2. להיתוך bioreactor העצרת, עיקור כליות, והכנה לRecellularization

  1. הכן כלי bioreactor.
    1. שטוף את מאגרי bioreactor הזכוכית (רכיב גוף) וראשי bioreactor עם חם, לדלל פתרונות מנה חומרי ניקוי (למשל. 1% פתרון נוזל לניקוי כלים במים ברז) ולשטוף היטב במים ברז ולאחר מכן ROH 2 O. לאפשר רכיבים להתייבש לחלוטין.
    2. החל נפח קטן (~ 5 מיליליטר) של siliconizing מגיב לחלק התחתון של כל מאגר. ודא שמגיב מרטיב את כל המשטח התחתון לכמה שניות, ואז לנקז את נוזלים עודפים.
    3. לאפשר המאגרים לייבוש במנדף ב RT O / N. לחלופין, מאגרים עשויים להיות מיובשים בתנור על 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לזרז ייבוש ולשפר את העמידות של הציפוי, אשר נועד למנוע התקשרות של תאים לחלק התחתון של מאגר bioreactor הזכוכית.
  2. הכן רכיבי מעגל זלוף לעיקור (איור1D).
    1. חותך את האורכים הבאים של צינורות (עבור כל bioreactor):
      1. חותך שני 25 "באורכים של 1/16" צינור גומי סיליקון ID (1D איור, ח).
      2. לחתוך באורך אחד 8 "של צינורות משאבת peristaltic (איור 1D, ו).
      3. לחתוך "אורך 1/16" 4.25 אחד צינורות גומי סיליקון ID.
      4. חותך שני 1 "אורכים של 1/16-מוקף חומה עבה" צינור גומי סיליקון ID (1D איור, ז).
      5. לחתוך באורך 2 "אחד" מזהה x 0.5 "1/4 צינור חיצוני קוטר (OD) גומי סיליקון (איור 1D, ה).
    2. הכן את מתאמי Luer הבאים (לכל bioreactor):
      1. הכן מנעול Luer 10 זכר ל1/8 מתאמים דוקרני '(איור 1D, ג)
      2. הכן 2 זכר Luer מתחבר (1D איור,)
      3. הכן 2 כמוסות Luer נקבה (1D איור, ב)
      4. הכן 5 נשי Luerx מתאמי Luer נקבה (X5; איור 1D, ד)
    3. לשטוף את כל מתאמי צינורות וLuer עם חם, לדלל פתרונות נוזל לניקוי כלים, לשטוף היטב במים ברז ולאחר מכן ROH 2 O, ולאפשר להם להתייבש.
  3. להרכיב מעגלי זלוף.
    1. סליפ 1 "אורכו של צינור גומי סיליקון ID 1/16 '-מוקף חומה עבה על acceptor Luer כניסה צמוד לראש של bioreactor. הנח זכר מנעול Luer ל1/8 "מתאם עקיצה מזהה לקצה פתוח של צינור. חזור לacceptor Luer הכניסה האחר, ולהתחבר כובע Luer נקבה לאטום את היציאה (מיועד לטכניקות זריעה בשופכן או ורידים אינם מתוארות בפרוטוקול זה).
    2. חבר "קטע של 1/16" כל 25 צינורות גומי סיליקון ID למגזר 8 "של צינורות משאבת peristaltic באמצעות מנעול Luer זכר ל1/8" עקיצה זיהוי ומתאמי נקבת Luer x הנשיים Luer (1D איור, י).
    3. חבר קצה אחד פתוח טובין גומי סיליקוןז לשקע perfusate התקשורת בצד החיצוני של ראש bioreactor. חבר את "האורך של 1/16" 4.25 צינורות מזהה לצד השני (הפנימי) של שקע perfusate תקשורת בחלק הפנימי של ראש bioreactor.
    4. חבר מנעול Luer זכר ל1/8 "מתאם תיל מזהה לקצה הפתוח הנותר של צינורות מעגל זלוף. חבר נשי Luer x מתאם Luer נקבה לזכר Luer הנעילה. חבר את נקבת Luer x מתאם Luer נשי לנעילת Luer הפתוחה הגברית המובילה לacceptor Luer הכניסה על bioreactor. זה ישמש ככניסת perfusate התקשורת המובילה ישירות לתוך עורק הכליה צינתור.
    5. ודא שאין יציאות על מכסה bioreactor נותרות פתוחות או חשופות. חוזקה לסגור את שסתום הוואקום בגוף bioreactor.
    6. התאם את ראש bioreactor על גוף המאגר, עם טבעת O דחוקה בין החריצים הזהים מרפדים כל רכיב. הנח מהדק מתכתי על הממשק להחזיק שני המרכיבים יחד.
    7. התאם את יציאת האוורור בראש bioreactor עם מסנן אוורור 0.2 מיקרון, המחבר את שני מרכיבים באמצעות אורך 2 "של" זהות x 0.5 "1/4 צינור גומי סיליקון OD (איור 1D, ה). פתח את שסתום האוורור.
    8. מעט לשחרר את כובע הבורג האדום על ראש bioreactor.
    9. מניחים את מתאמי Luer שנותרו ו -6 מלקחיים דגימה משוננים "בכיס וחותם autoclavable.
  4. החיטוי bioreactors התאסף והתקעים Luer גבריים.
  5. הכן את חומרים כימיים לעיקור פיגום וזלוף הבינוני הבאים לפני זריעה (כרכים מפורטים לכליות decellularized):
    1. בתוך מנדף, להכין 50 מיליליטר 0.1% חומצת peracetic, 4% אתנול פתרון על ידי הוספת 2.56 מיליליטר פתרון peracetic חומצה (39% ריכוז מניות) ו -40 מיליליטר 200 אתנול הוכחה ל~ 957 מיליליטר ROH 2 O בבקבוק 1 ליטר. מערבבים היטב על ידי בקבוק היפוך שוב ושוב, ומניח בארון בטיחות ביולוגי.
    2. הכן150 מיליליטר 1x פתרון PBS, מראש מעוקר-ידי מעוקר.
    3. הכן 50 מיליליטר מדיום DMEM / F12 בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (עט-דלקת).
  6. לאסוף את הפריטים שנותרו להרכבת bioreactor זלוף. מניחים את כל הפריטים בארון בטיחות ביולוגי. קריטי: ודא שארון הבטיחות הביולוגי מצויד בעבודת שקעי חשמל לשלטון כונן המשאבה הדיגיטלית. לחלופין, להשתמש בכבל מאריך לחיבור כונן המשאבה לשקעי חשמל חיצוניים מחוץ לארון.
    1. לאסוף כליות decellularized.
    2. לאסוף bioreactors autoclaved עם מעגלי זלוף מצורפים.
    3. לאסוף כיס autoclaved המכיל מתאמי Luer ומלקחיים.
    4. לאסוף כונן דיגיטלי משאבה עם ראש 4 רולר-מצורף, ומחסניות משאבה גדולות (1 למעגל זלוף).
  7. להשלים את מעגל זלוף כמתואר בתרשים 1C תחת ג סטריליסובל ממצבים בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
    1. חבר ברזלים 3-דרך (איור 1D, i) בין מנעול Luer זכר ל1/8 מתאם "זיהוי עקיצה ליד כניסת perfusate התקשורת ומתאם Luer נקבה נקבת Luer x. להשאיר את כל שלוש יציאות בפתוחות ברזלים.
    2. הסר את מכסה הבורג האדום על ראש bioreactor ופיפטה 50 מיליליטר של 0.1% חומצת peracetic, 4% אתנול פתרון למאגר הבינוני דרך הפתח.
    3. חבר את קטע צינור משאבת peristaltic לראש המשאבה באמצעות מחסנית משאבה גדולה. התאם את קצב הזרימה עד 5 מיליליטר / דקה, "התחל" עיתונות, ולאפשר למעגל ראש.
      1. כאשר הנוזל ממלא את קו זלוף ומגיע לנמל הפתוח הנותר של הסתום המשולש, חבר את היציאה באמצעות Luer זכר התקע (1D איור,).
      2. לאפשר למעגל ראש באופן מלא עד שלא אוויר הוא ציין בצינור מעגל זלוף או בחלק הפנימי של acceptor Luer הכניסה. אם necessaר"י, להגדיל את קצב הזרימה באופן זמני לגרש בועות מקו זלוף. כאשר דרוך באופן מלא, לעצור את כונן המשאבה.
    4. תקע בזהירות את סוף Luer הנשי של הצנתר לתוך עורק הכליה acceptor Luer זכר מפרצון על פני השטח הפנימיים של ראש bioreactor באמצעות 6 המלקחיים המעוקרים ". ודא שהחיבור הוא חזק ושאין אוויר שנשאר בקטטר. לאפשר הכליות לתלות בעדינות מקטטר עורק הכליה, כך שעורק הכליה לא לסובב או שריטה.
    5. הדק את המהדק המתכתי המחזיק ביחד ראש bioreactor וגוף, כך שמאגר bioreactor הוא סגור היטב. סגור את כובע הבורג האדום על ראש bioreactor.
  8. לעקר כליות ב RT על ידי זלוף עם peracetic 0.1%, 4% אתנול בפתרון 5 מיליליטר / דקה לשעה 1, ולאחר מכן שלושה זילופים 1-שעה ברצף של RT עם 50 מיליליטר PBS ב 5 מיליליטר / דקה.
    1. שינוי פתרונות:
      1. אחרי שעה 1, לעצור את המשאבה ולפתוח כובע בורג אדום. באמצעות STEלהרגיז פיפטה פסטר (autoclaved), לשאוב בזהירות כל הפתרון ממאגר bioreactor. השאר את מעגל זלוף דרוך באופן מלא.
      2. פיפטה 50 מיליליטר של תמיסה טריות לתוך מאגר bioreactor, לסגור את כובע הבורג, ולהתחיל את המשאבה.
  9. לאחר השטיפה הסופית PBS, לשאוב PBS מהמאגר ופיפטה 50 מיליליטר במדיום DMEM / F12 בתוספת 10% FBS ו -1% פן-דלקת. סגור את כובע הבורג, ולהעביר את bioreactor עם מעגל זלוף המצורף לחממת קיבולת גדולה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  10. במידת צורך, להעביר את כונן המשאבה לחממה. חבר במעגל זלוף bioreactor למשאבה, ותנקבו בכליות 4 מיליליטר / דקה לשעה לפחות 1 לפני הזריעה.

3. כליות Recellularization עם תאים בקליפת המוח כליות Tubular אפיתל

  1. כמויות מספיקות חמות של DMEM / F12 (בתוספת 10% FBS ו -1% פן-דלקת) וגell מתנער אנזים להרמת תא 37 ° C. כרכים הציעו מפורטים להלן:
    1. הכן אנזים מתנער 10 מיליליטר תא ו -10 מיליליטר DMEM / F12 לבקבוק 175 סנטימטר 2 תרבות להרמה.
    2. הכן 5-10 מיליליטר DMEM / F12 לכליות לזרע.
  2. לאסוף מספר מספיק של צלוחיות תרבות לריכוז הזריעה הרצויה (4 x 10 7 הנציחו תאי RCTE אנושיים 18 לתוצאות כליות בקליטתם מקסימלי של תאי RCTE באמצעות אסטרטגית זריעה זה).
  3. תאי מעלית מהצלוחיות באמצעות אנזים מתנער תא. בינוני לשאוב מבקבוק, אז פיפטה 10 מיליליטר אנזים תא dissociating לתוך בקבוק. בקבוק מקום בחממת 37 ° C כדי לזרז ניתוק.
  4. בדקו בקבוק במיקרוסקופ לעומת שלב כל 2 דקות עד ניתוק מלא של תאים ממשטח בקבוק הוא ציין. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לרמה של מפגש של התאים, אבל תאי RCTE יהיה require כ 15 דקות כדי לנתק באופן מלא.
  5. קח דוגמא של השעיה תא ניתק לספירה לפני pelleting. לדלל את ההשעיה התא עם נפח שווה של מדיום DMEM / F12 מראש חימם, וצנטריפוגות ב 232 XG כוח צנטריפוגלי יחסי (RCF) במשך 5 דקות.
  6. ספירת התאים בצנטריפוגה. לדלל את המדגם שהושג עם נפח שווה של Trypan הכחול, ופיפטה 10 μl לכל קצה של hemacytometer לספירה. לחשב צורך דילול גלולה נפח להשיג ריכוז הזריעה הרצוי (2 x 10 7 תאים / מיליליטר).
  7. לאחר צנטריפוגה, לדלל את הכדור עם נפח מתאים של מדיום התרבות להשיג ריכוז סופי של 2 x 10 7 תאים / מיליליטר. צייר את 2 מיליליטר של ההשעיה הזריעה לתוך מזרק 5 מיליליטר סטרילי.
  8. העבר את bioreactor זלוף לארון בטיחות ביולוגי. הפעל את שסתום ברזלים כדי לסגור זרימה לנמל הזריעה. הסר את התקע להחליק זכר Luer מברזלים, ולחבר את המזרק עמוס ההשעיה הזריעה.
  9. במהירות להעביר את מעגל זלוף בחזרה לחממה, ולהשתמש במחסנית המשאבה הגדולה כדי לאבטח את קטע צינור משאבת peristaltic לראש המשאבה.
  10. זריעת תאים: סגור את נמל שסתום ברזלים מצביע לכיוון משאבה. לאט לאט להזריק את ההשעיה התא לכליות, על מנת להבטיח כי כל ההשעיה מועברת מהמזרק לתוך קו ברזלים וזלוף. הפעל את שסתום ברזלים כדי לסגור זרימה מהמזרק, ולהתחיל את המשאבה במהירות של 25 מיליליטר / דקה במשך 15 דקות.
  11. אחרי 15 דקות, מוריד את קצב זרימת המשאבה עד 4 מיליליטר / דקה. בינוני בורסה ביום שלמחרת (100 מיליליטר נפח לשינויים שלאחר מכן) ולאחר מכן בכל יומיים.

4. הערכה של כדאיויות תא והפצה באמצעות Resazurin זלוף Assay

  1. הכן מגיב resazurin. לפזר מלח נתרן resazurin 110.5 מ"ג בשל PBS 100 מיליליטר תחת ערבוב, ולדלל 01:10 על ידי הוספת 5 מיליליטר שלוכתוצאה מכך פתרון עד 45 מיליליטר PBS הטרי כדי ליצור פתרון מניות resazurin 440 מיקרומטר. מסנן לעקר (באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק), ולאחסן את פתרון המניות בצינור חרוטי 50 מיליליטר מוגן אור ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן פקדי מדיה בתוספת resazurin. הכן פתרון 10% של מגיב resazurin במדיום התרבות (למשל. 5 מיליליטר resazurin פתרון מניות בינוני תרבות + 45 מיליליטר) כדי ליצור resazurin עובד פתרון. החיטוי 10 מיליליטר נפח של הפתרון עובד resazurin במכל מוגן אור. הערה: זה יקטין לחלוטין מתחם resazurin לresorufin, וישמש כביקורת חיובית לחישוב הפחתת resazurin אחוזים.
  3. Aliquot 1 מיליליטר כל אחד מפתרון עובד resazurin (חמצון), autoclaved resazurin עובד פתרון (מופחת), ומדיום התרבות לבד (ריק) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר נפרדים אוסף. מניחים את הצינורות הפתוחים באותו החממה כbioreactors זלוף.
  4. העבר את זלוף הכליותמעגל מהחממה לארון בטיחות ביולוגי. הסר את מכסה בורג מהראש bioreactor, ומדיום תרבות לשאוב ממאגר bioreactor בעזרת פיפטה פסטר.
  5. פיפטה 10 מיליליטר של resazurin עובד פתרון למאגר, כובע בורג קרוב, ולהעביר את מעגל זלוף הכליות חזרה לחממה.
  6. התחל המשאבה ב 4 מיליליטר / דקה ולאפשר מגיב לperfuse דרך הכליות עבור שעה 1 בדיוק.
  7. אחרי שעה 1, לעצור את המשאבה, ולהעביר את מעגל זלוף הכליות לארון הבטיחות הביולוגי.
  8. לאסוף את פתרון resazurin המותנה (מופחת באופן חלקי), ולהוסיף בינוני תרבות 100 מיליליטר למאגר bioreactor. מעגל זלוף העברה לחממה, ולחדש את הזרימה (4 מיליליטר / דקה).
  9. פיפטה μl 100 (x 3 משכפל) התנה resazurin פתרון, resazurin עובד פתרון, autoclaved עובד פתרון, וריק תקשורת ותרבות לשחורה (אטום) 96-גם צלחת assay. קראו עוצמת הקרינה (excitatיון: 540/35; פליטה: 590/20) באמצעות ספקטרופוטומטר.
  10. חישוב הפחתת אחוזים כיחס של עוצמות הקרינה מנורמלות על ידי עוצמת הקרינה (FI) שנוצרו על ידי מדיום resazurin חמצון (ORM, או resazurin עובד פתרון אינו חשוף לתאים) או מופחת resazurin הבינוני (RRM, או autoclaved עובד פתרון):% ההפחתה = 100 x {[FI (פתרון resazurin מותנה) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. לנרמל תוצאות, להכפיל הפחתת% על ידי במחזור נפח (10 מיליליטר) ולחלק בזמן דגירה (1 שעה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כליות perfused ברצף עם מים ולדלל פתרונות חומר ניקוי (1% Triton X-100, 0.1% SDS) על פי פרוטוקול decellularization הוקם בעבר, אופטימלי (ראה איור 1 א ', ב') 7, הפכו יותר ויותר שקופים על פני תקופה 26 שעות, כ מוצג באיור 2 א. פיגום כליות acellular וכתוצאה מכך הוא נטול תאים ושומר על ECM כליות מלוכד נתמך על ידי כמוסת כליות שלמה, שלא ניזוק בעקבות פרוטוקול זלוף. על ידי זלוף חומר הניקוי הסופי (SDS), רשת כלי הדם של הכליות, ובפרט את כלי interlobar, מוצגים בהבלטה בפיגום decellularized, בשל העובי הגדול יותר של כלי דם אלה ביחס לקרום במרתף יחסית הדק של tubules נפרון ( ראה איור 2 א, ב). כל האיבר מנוקה של תאים מקומיים, משאיר מאחור את רשת קרום במרתף שלמה של glomeruli, tubules, וcollecting צינורות, וECM של כלי דם decellularized, כוללים רבדים אלסטיות פנימיים וחיצוניים של עורקי interlobular קליפת המוח (ראה איור 2, C). בנוסף לכלי הגדול יותר, קרומי מרתף כלי דם בתוך glomeruli גם לשמור על שלמות מבנית (ראה איור 2, C).

כליות decellularized מאוחסנות בPBS ב 4 ° C כדי להגביל את הידרדרות hydrolytic הטבעית של ECM הכליות, ויש להשתמש בתוך 2 שבועות של decellularization. שתארנו בעבר בפירוט את העיצוב של bioreactor מבוסס זלוף המותאם אישית כליות המשמש לשני פיגומי כליות מכרסמים זריעת decellularized, ותרבות לטווח הארוך של איברי recellularized תחת זרימת 17. לrecellularization, מעגל זלוף מורכב מגומי סיליקון בקוטר הקטן וצינורות משאבת PharMed עייפות עמידה משמש למדיום תרבות מסלול ממאגר bioreactor, למשאבת peristaltic, ובחזרה לacceptor Luer הכניסה אליו עורק הכליה צינתור מחובר בפרצוף הפנימי של ראש bioreactor (ראה איור 1 ג). לאחר חיטוי בכליות decellularized ידי זלוף עם תערובת חומצה / אתנול peracetic, מערכת זלוף הוא הכין לזריעה במחזור בינוני תרבות סטנדרטית (המכיל 10% FBS כדי לשפר את הידבקות התא-ECM) באמצעות הפיגום בתוך החממה.

כליות decellularized יכולות כעת לשמש כתבניות acellular ECM לrecellularization, שיש לנו שבוצעו בעבר באמצעות תאים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה אנדותל לrevascularization 7. הנה, אנחנו מדגימים את התועלת של מערכת bioreactor זה פיגום וזלוף לtubulogenesis באמצעות אפיתל צינורי תאי שמקורם בקליפת המוח אנושי כליות (RCTE). תאי RCTE הם זורעים לתוך פיגומי כליה דרך עורק הכליה תחת פרוטוקול זלוף בלחץ גבוה שתואר קודם לכן 7, 17 .RCTE תאים חדורים בזה אופן בית בעיקר לאזורים בקליפת המוח של הכליות, שבו הם מעדיפים לאכלס מחדש את tubules periglomerular (ראו איור 3 א). תאים כמה להטביע בתוך glomeruli ביום 1 לאחר הזריעה, וביום 7, glomeruli הן כמעט נטולות תאים. במהלך תרבות זלוף, בינוני משתנה כל 2 ימים, ובשלב זה assay זלוף resazurin מתבצע במקביל לספק הערכות השוואתיות של כדאיות תא לאורך זמן (ראה איור 3). כנתמך על ידי תוצאות הפחתת resazurin, תאים להתרבות בתוך RCTE ECM 3D, ויצרו מאורגנים היטב, מבנים צינוריים פטנט ביום 7. בעוד שרוב התאים אלה לכבוש את האזורים בקליפת המוח של ECM הכליות, לאחר 7 ימים של תרבות זלוף antegrade רב tubules המרופד RCTE נמצא בלשדי החיצוני וtubules פפילרי וצינורות איסוף (ראה איור 4). לאחר אכלוס עם תאי RCTE ושבוע של לאחדתרבות היתוך, השקיפות שמה לב, בעקבות decellularization הולך לאיבוד, וכליות recellularized נראית אטומות וקרובות יותר במראהו למדינה האם שלה (ראה איור 4).

איור 1
לוח זמנים מערכת Decellularization כליות ופרוטוקול ומעגל זלוף Recellularization זלוף () של חומרים כימיים לdecellularization של כליות מכרסמים: איור 1.. חומרים כימיים המשמשים לdecellularization, קצב זרימת נפחית, ומשך זמן של כל שלב מוצגים. (ב) הגדרת decellularization זלוף. פתרונות נשאבים בכיוון אחד ממאגר מגיב למכל איסוף perfusate דרך קווי זרימה בודדים עבור כל כליה שעברה decellularization. עד ארבע כליות ניתן decellularized למשאבת peristaltic. מעגל (C) זלוף FOזריעת r ותרבות של פיגומי כליות recellularized. נטענים תאים באמצעות מזרק מחובר ישירות במעלה הזרם של acceptor כניסת Luer. חיישנים ב- קו אופציונליים ללחץ ניטור, חמצן מומס (DO 2), ו- pH עשויים להיות ממוקמים במעלה הזרם של bioreactor. משאבת peristaltic הדיגיטלית עשויה להיות נשלטה על ידי מחשב, ולחץ שלילי (ואקום חלקי) ניתן להחיל כדי לסייע זריעה בשופכן. (ד) רכיבים המשמשים ליצירת קווי זלוף לdecellularization (B) וrecellularization (C). (א) תקע Luer זכר, (ב) כובע Luer נקבה, (ג) נעילת זכר Luer ל1/8 "מתאם תיל, (ד) Luer נקבה למתאם Luer נקבה, (ה) ¼" צינורות סיליקון ID, (ו) צינורות peristaltic משאבה, ז: בעלי קירות עבים 1/16 "צינור גומי סיליקון ID, (ח) 1/16" צינור גומי סיליקון ID, ברזלים שלוש-דרך (i), מצמד (י) המשמש לחיבור מקטעים של צינורות על ידי שילוב שתי 1/8 "עקיצה למתאמי זכר Luer (ג) שימוש בLuer נקבה לנקבת מצמד Luer (ד). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. נציגי תוצאות של Decellularization כליות ברוטו נציג ותמונות מיקרוסקופיות מוצגים בכליות לפני ואחרי decellularization. (א) בסדרת זמן לשגות של decellularization כליות עוברות. תמונות מוצגות מייד לאחר זלוף עם כל מגיב שצוין. בעקבות טפטוף של 0.1% SDS (סולפט dodecyl נתרן), רשת כלי דם נשמר גלויה. (ב) נציג תמונות של כליות ילידי decellularized או מחולקים ומוכתמות עם hematoxylin ו eosin (H & E). ארכיטקטורת ECM של תכונות microstructural, glomeruli כולל, צינורות איסוף, וכלי דם, נשמר היטב הבא decellularization. micrographs (C) סריקת האלקטרונים השוואת glomeruli וצינוריות ב( בשורה העליונה) יליד וכליות decellularized (בשורה התחתונה). בעקבות הסרת תאים, צינוריות פתוחות הן נפוצות בכל רחבי הכליות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. נציגי תוצאות של אדם הכליה בקליפת המוח Tubular אפיתל Recellularization של decellularized עכברוש כליות הכליות recellularized באמצעות טכניקת זלוף עורקי antegrade בלחץ גבוה שגורמת להידבקות תא RCTE בעיקר לtubules הכליות של קליפת המוח. (א) נציג תמונות הגדלה גבוהה (20X) של hematoxylin וhistolo מוכתם eosinסעיפי gical של פיגומי recellularized 1, 3, או 7 ימים לאחר זריעה. בשורה עליונה מראה כי התאים לכבוש את חלל צינורי periglomerular למרות שהוזרק דרך כלי דם העורקים, המצביעים על ההעדפה שלהם לנישת ECM כליות לשעבר. נקודות ראש חץ צהובות לעורקיק מביא עם לומן שהוא נטול תאים. שורה תחתונה מציגה tubules בקליפת המוח שבו תאי RCTE להתרבות, עם הגדלת צפיפות תאים בשבוע אחד, וליצור מבני אפיתל צינורי צפופים. נפח (10 מיליליטר) קטן של מדיום התרבות-בתוספת resazurin (ב) ממוחזר דרך כליות בזמן של שינויים בתקשורת. במהלך 60 דקות של זלוף, תאים להפחית את מתחם חמצון resazurin (הכחולה) לresorufin (אדום), אשר מייצר אות ניאון מאוד באופן יחסי למספר התאים בכליות. עולה בקנה אחד עם העלייה שנצפתה בצפיפות תאים ראו בתמונות היסטולוגית, עליות הפחתת resazurin אחוזים על התרבות טיםדואר עם צמיחת תאים, מתן אינדיקציה לא פולשנית של שתי כדאיות התא ושגשוג בתרבות תחזוקה. תוצאות מוצגות כממוצע סטיית תקן ± (n = 4 כליות recellularized). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
. איור 4: נציגי תוצאות: השוואה בין הילידים, decellularized, וRecellularized כליות תמונות היסטולוגית בהגדלה נמוכה להראות קליפת הכליה, אזור מעבר בין קורטקס ומדולה חיצונית, ואזורי papilla הלשדיים בכליות ילידים (בשורה העליונה), decellularized (Decell; בשורה אמצעית), ו- 7 ימים-recellularized RCTE (7 הימים Recell; פיגומים בשורה תחתונה). הקו המקווקו מציין את הגבול המשוער בין קליפת הכליה (C) ולשד חיצוני (M). תמונות גולמית להראות כליות במדינה האם שלה לאחר רכש, הבאים decellularization, ו -7 ימים הבאים זריעה של תאי RCTE דרך עורק הכליה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול decellularization תאר מייצר באופן עקבי ECM כליות acellular לחלוטין המשמש כתבנית 3D לתרבות של תאים אנושיים כליה קליפת המוח צינורי אפיתל (שני הפרוקסימלי ודיסטלי נגזר אבובית), בנוסף לתאי האנדותל של כלי דם 7,17. כלי דם כליות cannulated משמש כתכונה המרכזית למסירה אחידה של חומרים כימיים ותאים בפיגום בתוך הגדרת bioreactor, ובכך לאפשר decellularization זלוף, פרוטוקולי זלוף זריעת תאים, תרבות זלוף לטווח ארוך, וresazurin. כcannulation כזה, תקין של עורק הכליה לפני זלוף איבר הוא קריטי, ויש לנקוט זהירות מיוחדת כדי להבטיח שעורק הכליה אינו חסום או פגום, וכי הקטטר הוא מאובטח. חולדות ספראג Dawley ממנו הכליות הם התאוששו יש heparinized מערכתי כדי למנוע קרישה בתוך כלי הדם באיבר רכש, כקרישים תוך-לא יכולים בהדואר הוסר, ועלול לעכב decellularization של הכליה מוחלטת.

Bioreactor זלוף המשמש לתרבות זריעה וטפטוף של כליות recellularized נועד לאפשר שיטות זריעה מרובות באתר 17. בנוסף לטכניקת הזרקת עורקים המתוארות כאן, תאים ניתן להזריק מדרדר דרך השופכן צינתור או וריד כליה. יתר על כן, גוף bioreactor מצויד בשסתום המאפשר יישום של לחץ שלילי (ואקום חלקי, ראה איור 1 ג '), לזריעה בשופכן. ללא קשר לאסטרטגית הזריעה מנוצלת, טפטוף של antegrade מדיום התרבות דרך עורק הכליה הוא קריטי עבור תזונתי נאות (חמצן למשל, גלוקוז) משלוח לתאי זרע.

פרוטוקול recellularization המתואר מדגים השימוש במטריצות כליות decellularized לשרת כתבניות במיוחד עבור tubulogenesis אפיתל. עם זאת, יש לנו בעבר shשלו שמטריצת הכליות תומכת גם מחדש endothelialization של רשת כלי הדם נשמרת ועשויה להיות בשורה עם תאי שמקורם בתאי גזע אנושי pluripotent מושרה אנדותל, אשר היא תצפית חשובה להשתלה לטווח ארוך סופו של דבר כליות recellularized במודלים של בעלי חיים על ידי מניעת יצירת קרישים חסימה של כלי דם כליות 7. מכשול נוכחי בהיקף של עד סופו של דבר פרוטוקולי recellularization כליות לפיגומי כליות גדולים של בעלי חיים הוא המספר משמעותי יותר של תאים הנדרשים לאכלוס מחדש של פיגומי כליה אנושיים בגודל. אסטרטגיות זריעה יעילה, כגון טכניקת הזרקת עורקים בלחץ הגבוה שתוארה לעיל, יש צורך קריטי כדי למקסם את מספר התאים שנקלטים בתוך ECM decellularized. בהתחשב בהרכב הסלולרי הטרוגניים של הכליה הילידים, שיטות זריעה מרובות עלולים סופו של דבר תידרש לאכלס מחדש ביעילות נישות כליות תאית השונות עם סוגי תאים שונים שאוסףבקנייה לבצע פונקציות הרבות של הכליות, כוללים סינון, ספיגה, ריכוז של שתן, וסינתזת הורמון.

לבסוף, assay זלוף resazurin הפגין במאמר זה מספק הערכה בלתי פולשני, שאינו רעילה של כדאיות תא ושגשוג בתרבות לטווח ארוך 7,17,18. Assay מספק משוב מיידי על המצב המטבולי של תאים גדלו בתוך פיגומי כליות, וכאשר היא מבוצעת באופן קבוע בין חילופים בינוניים התקופתיים, ניתן להשתמש כדי לאפיין התפשטות תאים לאורך זמן. מגיב resazurin הוא זול, assay דורש מעט זמן כדי לבצע (1 שעה), והיא שיטה אנליטית שמרנית יותר לאפיין מגמות התפשטות תאים או חילוף חומרים בהשוואה להערכה היסטולוגית, שדורשת הקרבה מסוף של פיגום recellularized. Assay זלוף resazurin גם יכול להיות מותאם להערכה של אוכלוסיות תאים במהלך צמיחה בתוך rece האחראיברים או רקמות llularized.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 102 bioreactor זריעת תאים decellularization מטריקס אפיתל כליות זלוף recellularization כליות resazurin פיגום הנדסת רקמות

Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y.,… More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter