Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

Published: August 10, 2015 doi: 10.3791/53271
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4, 1,2, 1,2, 5, 6, 7,8, 1,2,3,4,8,9
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

ERRATUM NOTICE

Abstract

Bu protokol aselüler, organ ölçekli doku gelişimi için küçük ölçekli modeli yüzeyler olarak yararlıdır henüz Biyofonksiyonel, böbrek hücre dışı matriks (ECM) iskelelerinin üretimi göstermektedir. Sprague Dawley sıçan böbrek bozulmamış sağlam, tüm böbrek iskeleleri elde etmek için 26 saat boyunca renal arter içine bir kateter sokulmasıyla kanül vasıtasıyla sokuldu ve düşük konsantrasyonlu deterjan (Triton X-100 ve sodyum dodesil sülfat (SDS)), bir dizi ile perfüze edilmiştir perfusable damar, glomerüller ve böbrek tübülleri. Decellularization takiben renal skafold özel tasarlanmış bir perfüzyon biyoreaktör kap içine yerleştirilir, ve buraya kateter sokulur renal arter oluşan bir perfüzyon devresine bağlanır: bir peristaltik pompa; boru; pH, çözünmüş oksijen ve basınç için isteğe problar. Perasetik asit ve etanol ve pH (7.4) balans iskele sterilizasyon işleminden sonra, böbrek skafold larg içinde kültür ortamının perfüzyon yoluyla tohumlama için hazırlanırE kapasiteli kuluçka CO2 37 ° C'de muhafaza edildi ve% 5. Kırk milyon renal kortikal tübüler epitel (RCTE) hücreler fizyolojik bir orana akışını azaltarak önce 15 dakika için yüksek akış altında iskele (25 ml / dakika) ve basınçta (~ 230 mmHg) arasında renal arter yoluyla enjekte edilir ve hızlı bir şekilde perfüze edilir (4 mL / dakika). RCTE hücreler öncelikle, renal korteks içinde tübüler ECM niş doldurmak çoğalırlar ve perfüzyon kültür yedi gün boyunca tübüler epitel yapıları oluşturmak. Kültür ortamı içinde bir 44 uM resazurin çözeltisi tubulogenesis esnasında hücre canlılığı ve proliferasyonu, bir florometrik, redoks-kaynaklı metabolik bir değerlendirme sağlamak için orta değişimleri sırasında 1 saat böbrek içinden perfüze edilmiştir. Böbrek perfüzyon biyoreaktör biyokimyasal değerlendirme için ortamın non-invaziv örnekleme izin verir ve birden fazla giriş portları renal ven ya da üreter yoluyla alternatif retrograd tohumlama izin verir. Bu protokoller, bir böbrek iskeleleri recellularize için kullanılabilirBu sistem içinde hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için, vasküler endotelyum, tübüler epitel, stromal fibroblastlar, de dahil olmak üzere hücre tiplerinin çeşitliliği.

Introduction

Son dönem böbrek yetmezliği olan hasta sayısı artmaya devam ettikçe, transplantasyon için uygun donör böbreklerin sayısında ciddi ve büyüyen sıkıntısı yoktur. adayların sürekli artan sayıda talebi karşılamak için yetersizlik böbrek nakli için bekleme listesine talep üzerine 1,2, implante böbrek greft özelleştirilmiş gelişmekte nihai hedefi ile böbrek, organ mühendisliği araştırma yol açtı. Bir hastanın kendi hücrelerinden işleyen böbrek dokusunu Bina, yaşam boyu immünosüpresyon ihtiyacını ortadan kaldırmak hastaların böbrek nakli için bekleyen diyaliz harcadıkları zamanı miktarını azaltmak ve kronik böbrek hastalığı olan hastalara daha fazla hayat kurtaran nakli genişletmek istiyorum.

Hasta türetilmiş hücreler kullanılarak böbrek dokusunu biyomühendislik doğru ilk adım böbrek parankimi için destekleyici substrat olarak hizmet veren bir iskele geliştirmektir (örneğin boru şeklindeki epitheLIAL), stroma fibroblast ve vasküler hücre büyümesi. Doğal bir organ, hücre dışı matrislerin (ECM) elde edilen biyomalzeme iskelelerde doğal biyolojik bileşim içeren doku mühendisliği, içinde kullanım için arzu edilir hale getiren çeşitli özelliklere sahiptir; Uygun makro ve mikro fizyolojik fonksiyonu bağışlamak için; ve hücresel biyouyumluluk, hücre yapışmasını, göç, ve 3 biçimlenme yapıcı doku teşvik. Renal doku rejenerasyonu için iskeleler üretmek için bir umut verici bir yöntem, böbrek ECM 4 kompleks doğal protein bileşiminin çok korumak organın doğal mimari karışıklık korumak ve fleklinden ile ilişkili zorluğun üstesinden allojenik veya ksenogeneik böbreklerin decellularization geçer iskele recellularization 5 sonra gelişen hücrelere vasküler kaynağı sağlayarak kalın cellularized dokuların mühendislik kadar.

Perfüzyon decellularization bir işlem olupki deterjanlar, enzim ya da diğer hücre bozucu çözeltiler homojen organı 6 vasküler ağ üzerinden teslim edilir. Bu strateji atılan insan böbrekler 9'dan asellüler böbrek şablonlar gelişimi ile kanıtlandığı gibi, tüm organ mühendisliği 6-8 biyolojik şablonlar, (3D) üç boyutlu olarak asellüler organa tabanlı ECM ​​iskeleleri türetmek için verimli bir süreç olarak kurulmuştur ve büyük hayvan (örneğin, domuz 10, keçi 11) ve kemirgen kaynakları 12 elde ksenogeneik böbrekler. Özellikle, kemirgenler gibi küçük hayvan modellerin kullanımı daha az hücreleri ve kök hücre türevli dokuları ile olduğu gibi, hücre sayısı genellikle sınırlı olan organ Recellularization çalışmalar için özellikle yararlı olan kültür ortamı, gerektirir. tarif edilen decellularization protokolünün amacı, böbrek structur rejenerasyonu için 3 boyutlu bir iskele sistemi olarak kullanılan bir hücresel olmayan böbrek ECM üretmektirİnsan renal kortikal tübüler epitel (RCTE) hücreleri ile mevcut örnekte yeniden doldurulur nefron tübüller dahil es. Daha önce daha hızlı olan bir optimum, deterjan bazlı sıçan böbrek decellularization protokolü 7, daha önce bildirilen diğer yöntemlere göre (yaklaşık bir gün) titiz değerlendirme tarif edildiği gibi (Ross ve ark .- 5 gün 12, Song ve ark .- 4.5 gün 13), ve daha önceki raporlarda 12-15 daha decellularization sırasında denatüran sodyum dodesil sülfat (SDS) oldukça düşük bir konsantrasyonda (% 0.1) organın ortaya koyar.

Bazı çalışmalar, sınırlı sayıda hücre yeniden popüle için 3 boyutlu bir iskele olarak decellularization ve daha sonraki kullanım için, kemirgen böbrek kullanımını tarif etmişlerdir 12-16 (başka yerde 1 incelenmiştir). Bu protokol, biz aselüler böbrek iskeleleri üretmek için bizim daha önce kurulmuş, optimum decellularization stratejisinin ayrıntılı bir açıklamasınıSprague Dawley sıçan böbreklerinde 7 den. Çift ekim ve bakım perfüzyon kültürünün 17 yetenekli özel tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörler kullanarak, sürekli bu decellularized matrislerdeki boru şeklindeki bileşeni yeniden doldurmanız çoğalırlar ve bir hafta boyunca perfüzyon kültüründe hayatta insan RCTE hücreleri ile asellüler böbrek iskeleleri recellularize. 17 çalışmaları önceden sitotoksisite için kullanılan ucuz, non-sitotoksik ve non-invaziv metabolik değerlendirilmesi - - zaman 7'nin üzerinde recellularized böbrekler içinde hücre canlılığı ve çoğalması bir gösterge sağlamak için Biz daha resazurin perfüzyon testinin bizim kullanımını göstermek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ETİK TABLOSU: hayvanlarla ilgili tüm işlemler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan kurallarına göre yapılmıştır.

1. Böbrek Decellularization

  1. Decellularization çözümleri hazırlayın. Her böbrek için ayıraç aşağıdaki hacimleri hazırlayın decellularized, artı bir ilave hacim için (örneğin, 4 böbrekler için, adım 1.1.3 için 5.000 ml Triton X-100 hazırlar.):
    1. 500 osmoz su (ROH 2 O) ters ml hazırlayın. Not: Alternatif olarak, iyondan arındırılmış su, ROH 2 O gösterilir adımda kullanılabilmektedir.
    2. ROH 2 O 1.000 ml Triton X-100,% 1 (h / h) hazırlanması Yavaş yavaş 10 ml Triton X-100, bir karıştırıcı plaka üzerinde hızlı bir şekilde karıştırılarak altında büyük bir beher içinde, su mi 990. Reaktif tamamen erimesi kullanımdan önce (en az 10 dakika) izin verir.
    3. 1000 ml Triton X-100,% 1 hazırlanması (h / h) ROH 2 O (Eylülarate hacmi).
    4. 1000 ml sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.1 (h / h) ROH 2 O. hazırlayın Yavaş yavaş bir karıştırma plakası üzerinde hızlı karıştırma altında büyük bir çanak içinde 995 ml suya, 5 ml SDS (% 20 stok çözeltisi) ekleyin. Reaktif kullanımı (en az 10 dakika) önce üniform karıştırmak için izin verin.
    5. 500 ml ROH 2 O (ayrı cilt) hazırlayın.
  2. Decellularization için böbreklerin hazırlayın.
    1. Daha önce 7 açıklandığı gibi bir erkek Sprague Dawley sıçan (250-300 gr) bir böbrek kurtarın.
      1. Pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu (50 mg / kg vücut ağırlığı) sıçan anestezisi. Sıkça ameliyat sırasında solunum fonksiyon, kalp hızı ve ayak tutam tepkisini izleyerek anestezi derinliği (her 10-15 dakika) inceleyin. Hayvan yükseltilmiş solunum hızını veya pozitif pedal refleks varsa, pentobarbital (başlangıç ​​dozunun 1/4 1/3) bir ek dozunu.
      2. Uzunlamasına bir orta hat ABDOMİNAL gerçekleştirmel kesi böbrekler, abdominal aorta ve inferior vena kava ortaya çıkarmak.
      3. 2.000 USP Heparin Birimleri / penil ven içine kg vücut ağırlığı enjekte edilir.
      4. Nazik diseksiyonu hem böbrekleri Seferber. Sağlam böbreği çevreleyen böbrek kapsülü tutarken dikkatli, perirenal yağ böbreği ayırın. Infra, renal abdominal aort boyunca soğuk tuzlu su (10 mi) ile böbrekler serpmek.
    2. Sıkı arter kateteri ligate ve yavaşça, 10 ml soğuk fosfat-tamponlu salin (PBS) ile kan tamamen berrak organına sahip böbrek serpmek (bir şırınga kullanılarak) renal arter içine, 24 birimlik bir sonda yerleştirin.
    3. Yavaş yavaş decellularization kadar depolama için (böylece hücre parçalama indükleyici) organı dondurmak için -20 ° C derin dondurucuda bir Petri kabı ve mekân içinde 25 ml PBS içinde böbrek daldırın.
      Not: istenirse thi tarif olmasa da, üreter ve / veya renal ven de, retrograd tohumlama için kanül olabilirs protokolü.
    4. Tamamen (oda sıcaklığında (RT) dengelemek) donmuş böbrek çözülme ve yavaşça sızdırmazlığını bağlanan renal arter kontrol etmek için 10 ml PBS ile serpmek. Sızıntı veya önemli direnç gözlenirse, renal arter yeniden kateterize.
  3. Decellularization için ekipman hazırlayın. Şekil 1B 'de gösterildiği üzere decellularization perfüzyon sistemine monte edin.
    1. 1/16 "iç çapı (ID) silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, h)" (önerilir> 36), iki yeterli uzunlukta peristaltik pompa boru uzunluğu (Şekil 1D, f) "Bir 8 bağlayın. Luer boru kesimleri (Şekil 1D, j) katılmak için dişi Luer adaptörü x tek kadın katıldı 1/8 "dikenli adaptörleri iki erkek Luer kilidi kullanın. "Dikenli adaptörü 1/8 ek erkek Luer kilidi takın (Şekil 1D, c) böbrek eki için perfüzyon hattının aşağı ucunaarter kateteri.
    2. Büyük pompa kartuş kullanılarak 4-silindir pompa kafası her peristaltik pompa hortumu segmenti bağlayın.
    3. Birinci çözüm haznesinde (ROH 2 O) silikon kauçuk tüp memba ucunu yerleştirdikten sonra, çözüm ile tamamen başbakan her perfüzyon devresi "Başbakan" düğmesini basılı tutun. Kritik: kabarcıklar tüpün içinde sıkışıp kalması emin olun ve yukarıdaki ucu Şekil 1B 'de gösterildiği gibi, reaktif rezervuarın sıvı-hava ara-yüzünün altına sabitlenir silikon kauçuk borudan (sol açık sıvı çekmek için) göstermektedir.
  4. RT 7 de decellularization protokolü gerçekleştirin.
    1. Hava kabarcığı kateter içinde sıkışıp kalan sağlamakla, pompadan aşağı perfüzyon devre tüpün sonuna kadar her çözülmüş böbrekte renal arter kateteri bağlayın. Böbrek boş 5 L'lik bir kap (perfüzat toplama haznesi iç duvarı boyunca süspansiyon haline izin ver, bakınız Şekilure 1B), böylece renal arter bükülmüş veya sarılır değildir.
    2. 5 ml / dak pompa sürücü ayarlayın ve "Başlat" düğmesine basın. Her böbrek organ altından çözümleri damla gözlemleyerek perfüze doğrulayın.
    3. Şekil 1A'da tarif edildiği gibi, aşağıdaki tepkin maddeler ile her bir böbrek serpmek
      1. 1 saat, 40 dakika / 5 ml, 500 ml ROH 2 O dakika serpmek.
      2. 3 saat, 20 dakika / 5 ml'de 1000 mi,% 1 Triton X-100 ile birlikte dakika serpmek.
      3. 16 saat, 40 dakika / 1 ml'de 1000 mi,% 1 Triton X-100 ile birlikte dakika serpmek.
      4. 3 saat, 20 dakika / 5 ml'de 1000 mi,% 0.1 SDS ile dk serpmek.
      5. 1 saat, 40 dakika / 5 ml, 500 ml ROH 2 O dakika serpmek.
        Not: her hücresizleştirilmiş böbrek kullanımdan önce iki haftalık bir süre için 4 ° C'de 50 ml konik bir tüp içinde (katkı maddeleri olmadan) PBS içinde depolanabilir.

2. OrtalamaRecellularization için füzyon Biyoreaktör Meclisi, Böbrek Sterilizasyon ve Hazırlık

  1. Biyoreaktör gemileri hazırlayın.
    1. Bulaşık deterjanı çözümleri (örn. Musluk suyunda% 1 bulaşık deterjanı çözelti) sulandırmak, sıcak cam biyoreaktör rezervuarları (vücut bileşeni) ve biyoreaktör başlarını yıkayın ve sonra musluk suyu ve ROH 2 O. ile iyice durulayın Bileşenleri tamamen kurumasını bekleyin.
    2. Her bir haznenin dibine reaktif silikonlama küçük bir hacmi (~ 5 mL) uygulanır. Daha sonra fazla sıvıyı boşaltmak, birkaç saniye, tüm alt yüzeyi ıslatır bu reaktif emin olun.
    3. Rezervuar RT O / N bir davlumbaz içinde kurumasını bekleyin. Seçenek olarak ise, rezervuar kurutma hızlandırmak ve cam biyoreaktör haznenin dibine hücrelerin bağlanmasını önlemek için kaplamanın, dayanıklılığını geliştirmek için, 30 dakika boyunca 100 ° C'de bir fırın içinde kurutulabilir.
  2. Sterilizasyon için perfüzyon devre elemanlarını hazırlayın (Şekil1D).
    1. (Her biri Bioreaktör olarak) boru aşağıdaki uzunlukları kesme:
      1. Kimlik silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, h) iki 25 "1/16 uzunlukları" kes.
      2. Peristaltik pompa hortumunun biri 8 "uzunluğunu kesin (Şekil 1D, f).
      3. Kimlik silikon kauçuk tüp, bir 4.25 "1/16 uzunluğunu" Kes.
      4. Kimlik silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, g) iki adet 1 "kalın duvarlı 1/16 uzunlukları" Kes.
      5. 1/4 'kimliği x 0,5' dış çap (OD) silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, e) biri 2 "uzunluğunu kesin.
    2. (Her bir biyoreaktör için) Aşağıdaki Luer adaptörü hazırlanması:
      1. 1/8 'dikenli adaptörleri 10 erkek Luer kilidi hazırlayın (Şekil 1D, c)
      2. 2 erkek Luer fişler hazırlayın (Şekil 1D, a)
      3. 2 dişi Luer kapaklar hazırlayın (Şekil 1D, b)
      4. 5 kadın Luer hazırlayınx dişi Luer adaptörleri (x5 Şekil 1D, d)
    3. Sıcak olan tüm boru ve Luer adaptörleri yıkayın bulaşık deterjanı çözümleri sulandırmak, musluk suyunda iyice durulayın ve ardından ROH 2 O ve kurumaya bırakın.
  3. Perfüzyon devrelerini birleştirin.
    1. Kayma 1 "biyoreaktör kafasına bağlı giriş Luer alıcısı üzerinde kalın duvarlı 1/16 'ID silikon kauçuk tüp uzunluğu. Hortumun açık ucunu 1/8 "ID diken adaptörü erkek Luer kilidi yerleştirin. Diğer giriş Luer alıcısı için tekrarlayın ve port (Bu protokol açıklanmayan üreter veya venöz tohumlama teknikleri yönelik) kapatmak için bir dişi Luer kapağı takın.
    2. 1/8 'Kimlik Diken ve dişi Luer x dişi Luer adaptörleri (Şekil 1D, j) erkek Luer kilidini kullanarak peristaltik pompa boru 8 "segmentine ID silikon kauçuk tüp her 25" 1/16 segmentinde "bağlayın.
    3. Silikon kauçuk Tubin bir açık ucunuBiyoreaktör kafasının dış ortam perfüzyon çıkışına örn. Biyoreaktör kafasının içindeki medya Perfüzat çıkışının karşısında (iç) tarafına kimliği boru 4.25 "1/16 uzunluğunu" bağlayın.
    4. Perfüzyon devre boru kalan açık ucuna 1/8 'kimliği dikenli adaptörü erkek Luer kilidi takın. Bir dişi Luer erkek Luer kilit dişi Luer adaptörü x bağlayın. Dişi Luer biyoreaktör üzerinde giriş Luer alıcısı giden açık erkek Luer kilit dişi Luer adaptörü x bağlayın. Bu Kateterize renal arter doğrudan önde gelen medya Perfüzat girişi olarak görev yapacak.
    5. Biyoreaktör kapağının üzerinde hiçbir bağlantı noktası açık bırakılır veya maruz emin olun. Sıkıca biyoreaktör vücut üzerinde vakum vanasını kapatın.
    6. Her bir bileşeni astar özdeş oluklar arasında sıkıştırılmış bir O-ring ile, rezervuar vücutta biyoreaktör kafasını takınız. Birlikte iki bileşeni tutmak için arayüzü üzerinden bir metalik kelepçe yerleştirin.
    7. 1/4 'kimliği x 0,5' OD silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, e) 2 "uzunluğu kullanarak iki bileşen bağlayan, 0.2 mikronluk havalandırma filtresi ile biyoreaktör kafasına havalandırma portu takın. Boşaltma valfini açın.
    8. Biraz biyoreaktör kafasına kırmızı vidalı kapağını gevşetin.
    9. Bir otoklav kese ve mühür kalan Luer adaptörleri ve 6 "tırtıklı numune forseps yerleştirin.
  4. Monte biyoreaktörler ve erkek Luer fişleri otoklavlayın.
  5. (Hacimleri Decellularized böbrek başına listelenmiştir) ekim önce iskele sterilizasyon ve orta perfüzyon için aşağıdaki reaktifler hazırlayın:
    1. Bir çeker ocak içinde, bir 1 L şişe içinde ~ 957 mi ROH 2 O 2.56 mi perasetik asit çözeltisi (% 39 hazır konsantrasyon) ve 40 mL 200 derece etanol ekleyerek 50 mi% 0.1 perasetik asit,% 4 etanol solüsyon hazırlanır. Defalarca tersini şişe iyice karıştırın ve biyolojik güvenlik kabini yerleştirin.
    2. HazırlamakPBS çözeltisi 1 x 150 mi, otoklav ile önceden sterilize edilmiştir.
    3. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 50 ml DMEM / F12 ortamı ve% 1 penisilin-streptomisin (LTR yükseltici) durumunda hazırlayın.
  6. Perfüzyon biyoreaktör montajı için kalan öğeleri toplayın. Biyolojik güvenlik kabini tüm öğeleri yerleştirin. KRİTİK: biyolojik güvenlik kabini, dijital pompa sürücü güç elektrik prizleri çalışma ile donatılmış olduğundan emin olun. Alternatif olarak, kabine dışında dış prizlere pompa sürücü bağlamak için bir uzatma kablosu kullanın.
    1. Decellularized böbrekler toplayın.
    2. Ekli perfüzyon devreleri ile Otoklavlanmış biyoreaktörler toplayın.
    3. Luer adaptörleri ve forseps içeren otoklavlanmış kese toplayın.
    4. Ekli 4-silindir kafası ile dijital pompa sürücü ve büyük pompa kartuşları (perfüzyon devresi başına 1) toplayın.
  7. Steril c Şekil 1C'de tarif edildiği gibi perfüzyon devresini tamamlamakbiyolojik güvenlik kabini içinde şartlarından.
    1. 1/8 'Medya Perfüzat girişinin yakınına kimlik tırnaklı adaptörü ve dişi Luer x dişi Luer adaptörü erkek Luer kilit arasındaki 3-yollu stopcock (Şekil 1D, i) bağlayın. Musluk açıkken üzerindeki her üç portları bırakın.
    2. Biyoreaktör baş ve pipet% 0.1 perasetik asit 50 mi, açıklık yoluyla orta rezervuar içine% 4 etanol çözeltisi kırmızı vidalı kapağı çıkarın.
    3. Büyük pompa kartuşu kullanarak pompa kafasına peristaltik pompa hortumu segmenti bağlayın. 5 ml / dk basın "Başlat" akış hızını ayarlayın ve başbakan için devre izin verir.
      1. Sıvı perfüzyon hattı doldurur ve üç yollu kalan açık liman ulaştığında, bir erkek Luer (Şekil 1D a) fiş kullanarak noktasını takın.
      2. Hava perfüzyon devresi tüp ya da giriş Luer alıcısı iç gözlenen kadar devre tamamen asal izin verin. Eğer necessary, perfüzyon hattından kabarcıklarını çıkarmak için geçici olarak akış hızını artırır. Tamamen astarlı, pompa sürücü dur.
    4. Dikkatle sterilize 6 "forseps kullanarak biyoreaktör kafasının iç yüzeyinde erkek giriş Luer alıcısı içine renal arter kateteri dişi Luer ucunu. Emin bağlantı sıkı ve hava kateter bırakılır emin olun. Renal arter bükmek veya kink kalmaması böbrek nazikçe, renal arter kateteri asmak için izin verin.
    5. Biyoreaktör rezervuar sıkıca kapatılmış böylece biyoreaktör kafası ve vücudu bir arada tutan metalik kelepçesini sıkın. Biyoreaktör kafasına kırmızı vidalı kapağını kapatın.
  8. 5 ml / dakika, 50 ml PBS ile oda sıcaklığında, 1 saat süre ile / 5 ml% 0.1, perasetik,% 4 etanol çözeltisi ile perfüzyon ile daha sonra üç sıralı 1 saatlik perfüzyonunu dakika oda sıcaklığında böbrekler sterilize edin.
    1. Çözüm değiştirme:
      1. 1 saat sonra, pompayı durdurun ve kırmızı vidalı kapağını açın. Bir ste kullanmarile (otoklav) Pasteur pipeti dikkatlice biyoreaktör hazneden çözümün tüm aspire. Tamamen astarlı perfüzyon devresini bırakın.
      2. Pipet biyoreaktör rezervuar içine taze bir çözelti, 50 ml vida kapağı kapatın ve pompayı çalıştırın.
  9. % 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile takviye edilmiş 50 ml DMEM / F12 ortamı içinde hazne ve pipet nihai PBS durulama, PBS aspire sonra. Vidalı kapağı kapatın ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde muhafaza eden geniş bir kapasiteli bir inkübatör bağlı perfüzyon devresi ile biyoreaktör aktarın.
  10. Gerekirse, inkübatör pompa sürücü aktarın. Pompaya biyoreaktör perfüzyon devresini bağlayın ve önceden tohumlama için en az 1 saat süreyle / dk 4 ml böbrekleri serpmek.

Renal Kortikal Tübüler Epitel Hücreleri 3. Böbrek Recellularization

  1. DMEM / F12 Sıcak yeterli miktarlar ve C (% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile takviye edilmiş)ell 37 ° C hücre kaldırma için enzim ayrışan. Önerilen hacimleri aşağıda listelenmiştir:
    1. 10 ml hücre dissociating enzim ve kaldırma için 175 cm 2 kültür şişelerinde başına 10 ml DMEM / F12 hazırlayın.
    2. Böbrek başına 5-10 ml DMEM / F12 hazırlayın numaralı seribaşı olan.
  2. Arzu edilen tohumlama konsantrasyonu kültür şişeleri yeterli sayıda kazan (4 x 10 7, bu tohum stratejisi kullanılarak RCTE hücrelerin maksimum engraftment böbrek sonuçlarına göre 18 insan RCTE hücreler immortalize).
  3. Hücre ayrıştıracak enzim kullanılarak şişelerinden asansör hücreleri. Şişeden orta aspire, sonra balona 10 ml hücre ayrışan enzim pipetle. 37 ° C inkübatör Yeri balon ayrışmasını hızlandırmak için.
  4. Şişe yüzeyinden hücrelerinin tam çözülme gözlemlenene kadar bir faz kontrast mikroskop üzerine her 2 dakikada bir balon kontrol edin. Not: İnkübasyon süresi hücrelerinin izdiham seviyesine bağlı olarak değişir, ancak RCTE hücreleri r olacakequire yaklaşık 15 dakika tamamen ayırmak.
  5. Peletleme öncesinde sayım için ayrışmış hücre süspansiyonu bir örnek alın. 5 dakika boyunca 232 x g nispi santrifüj kuvveti (RCF) eşit bir önceden ısıtılmış DMEM / F12 ortamı hacmi ve santrifüj ile bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir.
  6. Santrifüj sırasında hücreleri saymak. Sayımı bir hemasitometre her ucuna eşit bir tripan mavisi hacmine ve pipet 10 ul elde edilen örnek seyreltilir. İstenen tohumlama konsantrasyonu (2 x 10 7 hücre / ml) elde etmek için gerekli pelet seyreltme hacmi hesaplanır.
  7. Santrifüj işleminden sonra, 2 x 10 7 hücre / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için kültür ortamına uygun bir hacmi ile pelet seyreltin. 5 ml steril bir şırınga içine tohum süspansiyonu 2 ml hazırlayın.
  8. Biyolojik güvenlik kabini perfüzyon biyoreaktör aktarın. Tohumlama noktasına akışını kapatmak için musluk vana çevirin. Dan erkek Luer kayma fişini çıkarınmusluklar ve ekim süspansiyon yüklü şırınga bağlayın.
  9. Hızla geri inkübatör perfüzyon devresini transferi ve pompa kafasına peristaltik pompa hortumu segmenti sabitlemek için büyük pompa kartuşu kullanın.
  10. Hücre tohumlama: Pompanın doğru bakacak musluk vana bağlantı noktasını kapatın. Yavaş yavaş tüm süspansiyon musluk ve perfüzyon hattına şırınga aktarılır sağlanması, böbrek içine hücre süspansiyonu enjekte. Şırınga akışını kapatmak ve 15 dakika süreyle 25 mL / dakika ile pompayı çalıştırmak için musluk vanası getirin.
  11. 15 dakika sonra, / dakika 4 ml pompa akış hızını düşürmektedir. Değişim ortamı (100 mi sonraki değişiklikler hacim), ertesi gün ve bundan sonra her iki günde.

Resazurin Perfüzyon Testi kullanarak 4. Hücre Canlılığı Değerlendirilmesi ve Çoğalma

  1. Resazurin reaktifi hazırlayın. Karıştırma altında PBS, 100 ml 110.5 mg resazurin sodyum tuzu çözülür ve 5 ml ekleyerek 1:10 seyreltinTaze PBS 45 ml çözüm sonuçlanan 440 mcM resazurin stok çözümü oluşturmak için. (0.2 um şırınga filtresi kullanılarak) Filtre ile sterilize ve 4 ° C'de hafif bir korunan 50 ml konik bir tüp içinde stok çözeltisi saklayın.
  2. Resazurin-desteklenmiş medya kontrolleri hazırlayın. Kültür ortamı içinde resazurin reaktifi bir% 10 solüsyonu hazırlayın (örneğin. Stok çözeltisi + 45 ml kültür ortamı resazurin 5 mi) çalışma çözeltisi resazurin oluşturmak için kullanılır. Hafif bir korunan kapta resazurin çalışma çözeltisinin 10 ml'lik bir hacim otoklava. Not: Bu tamamen resorufine resazurin bileşik azaltacaktır ve yüzde resazurin azalma hesaplamak için bir pozitif kontrol olarak görev yapacak.
  3. Kısım 1 mi resazurin hazır çözelti (oksitlenmiş) her biri, ayrı ayrı 1.5 mi toplama tüpleri içine, tek başına (boşluk) çözeltisi (azaltılmış) ve kültür ortamını çalışma resazurin otoklavlanmıştır. Perfüzyon Biyoreaktörlerin aynı inkübatör açık tüpler yerleştirin.
  4. Böbrek perfüzyon aktarınbiyolojik güvenlik kabini için inkübatör devre. Pasteur pipeti kullanarak biyoreaktör hazneden biyoreaktör kafasından vidalı kapağı ve aspire kültür ortamı çıkarın.
  5. Pipet 10 rezervuar, yakın vidalı kapaklı içine çözümü çalışma resazurin ml ve geri inkübatör böbrek perfüzyon devresini aktarın.
  6. 4 mL / dakika Pompayı çalıştırın ve reaktif tam olarak 1 saat süre ile böbrekler yoluyla perfüze edilmesi için izin verir.
  7. 1 saat sonra, pompayı durdurun ve biyolojik güvenlik kabini için böbrek perfüzyon devresini aktarın.
  8. Klimalı (kısmen azaltılmış) resazurin çözümü toplayın ve biyoreaktör deposuna 100 ml kültür ortamı ekleyin. Aktarım perfüzyon devresi kuluçka ve (4 ml / dak) akışını devam ettirmek için.
  9. Pipet 100 ul (x 3 kopya), çalışma çözeltisi resazurin, çözelti resazurin durumunu çalışma çözeltisi otoklavlanmış ve kültür ortamı (opak) bir siyah içine boş bir 96 oyuklu bir deney plakası. (Excitat floresan yoğunluğu okuion: 540/35; emisyon: 590/20) bir spektrofotometre kullanılarak.
  10. Oksitlenmiş resazurin ortam tarafından üretilen floresan yoğunluğu (FI) ile normalleştirilmiş floresan yoğunlukları bir oranı olarak yüzde azalma hesaplayın (orm, ya da çözelti hücrelerine maruz kalmayan çalışma resazurin) veya orta resazurin indirgenmiş (RRM veya çalışma çözeltisi otoklav):% indirgeme = 100 x {[FI (klimalı resazurin çözümü) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. Sonuçları normalleştirmek inkübasyon süresi (1 saat) ile hacmi (10 ml) ve bölme dolaştırarak% azalma çarpmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Böbrekler, sırasıyla deterjan çözeltileri, su ile perfüze edilmiş ve seyreltilmiş, önceden belirlenmiş optimal decellularization protokolüne göre (Şekil 1A, bkz B) 7 gibi, bir 26 saatlik bir süre içinde kademeli olarak daha şeffaf hale (Triton X-100,% 0.1 SDS,% 1) Şekil 2A'da gösterilmiştir. Elde edilen hücresiz böbrek skafold hücrelerinden yoksun ve perfüzyon protokolü takip hasarsız sağlam bir böbrek kapsülü tarafından desteklenen bir yapışkan böbrek ECM korur. Nihai deterjan perfüzyon (SDS), böbreğin damar ağı ve özellikle loblar kaplar, belirgin nefron tübül nispeten ince bazal membran (göre bu kan damarlarının daha kalınlığına bağlı olarak, hücresizleştirilmiş iskele gösterildi Şekil 2A, B) bkz. Tüm organı glomerüller, tübüller ve col bozulmamış bazal membran ağı geride bırakarak, yerli hücreleri temizlenirkanalları ve kortikal interlobüler arterlerin iç ve dış elastik lamina içeren hücresizleştirilmiş kan damarları, ECM çildiğinde (Şekil 2B, C). Daha büyük gemilere ek olarak, glomerüllerde içinde mikrovasküler bazal membran da (Şekil 2B, C) ​​yapısal bütünlüğünü korur.

Hücresizleştirilmiş böbrek, renal ECM doğal hidrolitik bozulma sınırlamak için 4 ° C'de PBS içinde saklanır ve decellularization 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Daha önce akış 17 altında ayrıntılı olarak recellularized organların özel bir perfüzyon bazlı hem de tohumlama hücresizleştirilmiş kemirgen böbrek iskeleleri için kullanılan böbrek biyoreaktör ve uzun dönemli kültür tasarımını tarif edilmiştir. Recellularization, bir perfüzyon devresi küçük çaplı silikon kauçuk ve yorgunluk dirençli Pharmed pompa boru oluşan bir peristaltik pompa, biyoreaktör hazneden güzergah kültür ortamı için kullanılır, veLütfen kateterize renal arter biyoreaktör kafasının iç yüzüne bağlı olduğu giriş Luer alıcısına (Şekil 1C bakınız). Perasetik asit / etanol karışımı ile perfüzyon ile hücresizleştirilmiş böbrek sterilizasyon sonra perfüzyon sistemi, standart kültür ortamı inkübatör içinde iskele boyunca (hücre-ECM yapışmasını geliştirmek için% 10 FBS ihtiva eden) dolaştırarak tohumlama için hazırlanıyor edilir.

hücresizleştirilmiş böbrek şimdi, daha önce revaskülarizasyon 7 uyarılmış pluripotent kök hücre türevli endotel hücreleri kullanılarak da yerine adres recellularization gibi hücresiz ECM şablonları, hizmet edebilir. Burada, insan-türevi renal kortikal tübüler epitel (RCTE) hücreleri kullanılarak tubulogenesis bu iskele ve perfüzyon biyoreaktör sisteminin yarar göstermektedir. RCTE hücreleri daha önce 7 tarif edilmiştir yüksek basınçlı perfüzyon protokol çerçevesinde renal arter yoluyla böbrek iskelelerinin içine numaralı seribaşıÖncelikle onlar tercihen periglomerular tübüller yeniden doldurmanız böbrek, kortikal bölgelere bu şekilde evde infüzyon 17 .RCTE hücreleri (Şekil 3A bakınız). Birkaç hücre gün 1 sonrası tohumlama de glomeruluslarda içinde gömmek ve 7. günde, glomerül hücrelerin neredeyse yoksun bulunmaktadır. Perfüzyon kültür sırasında, orta resazurin perfüzyon tahlil eş zamanlı zaman (Şekil 3B) üzerinde hücre canlılığı karşılaştırmalı değerlendirmeler sağlamak için yapılır hangi noktada 2 günde, değiştirilir. Resazurin azaltma sonuçlarına tarafından desteklenen gibi, RCTE hücreleri, 3D ECM içinde çoğalırlar sıkıca organize şekillendirme, günde 7 patent tübüler yapılar bu hücrelerin çoğunluğu antegrad perfüzyon kültürünün birçok 7 gün sonra böbrek ECM kortikal bölgeleri, işgal ederken RCTE kaplı tübüller dış medüller ve papiller tübüller ve toplama kanalları (bakınız Şekil 4) mevcuttur. RCTE hücreleri ile yeniden popüle ve her bir hafta sonrafüzyon kültürü, şeffaflık decellularization kaybolur aşağıdaki gözlenen ve recellularized böbrek opak ve onun yerli durumuna görünüş olarak yakın görünmektedir (Şekil 4).

Figür 1
Şekil 1:. Kemirgen böbrekler decellularization için reaktiflerin Böbrek Decellularization Sistemi ve Protokol ve Recellularization Perfüzyon Devresi (A) Perfüzyon programı. decellularization, hacimsel akış hızı, ve her bir aşama süresince kullanılan reaktifler gösterilmektedir. (B) Perfüzyon decellularization set-up. Çözümler decellularization geçiren her böbrek için ayrı akış hatları aracılığıyla bir perfüzat toplama kabına bir reaktif depodan tek yönlü pompalanır. Kadar dört böbrek peristaltik pompa başına decellularized olabilir. (C) Perfüzyon devresi for tohumlama ve recellularized böbrek iskelelerinin kültürü. Hücreler Luer giriş alıcısı yukarı doğrudan bağlı bir şırınga aracılığıyla yüklenir. Izleme basıncı, çözünmüş oksijen (DO 2), ve pH için isteğe bağlı olarak çevrim-içi algılayıcılar biyoreaktör yukan yerleştirilebilir. Dijital peristaltik pompa, bilgisayar tarafından kontrol edilebilir ve negatif basınç (kısmi vakum) üreter tohumlama yardım etmek için tatbik edilebilir. (D) bileşenleri decellularization (B) ve Recellularization (C) perfüzyon hatları oluşturmak için kullanılır. 1/8 (a) erkek Luer fiş, (b) dişi Luer kapağı, (c) erkek Luer kilidi "dikenli adaptörü (d) dişi Luer dişi Luer adaptörü, (e) ¼" ID silikon tüp, (f) peristaltik pompa hortumu, g: Kalın duvarlı 1/16 "ID silikon kauçuk hortum, (h) 1/16" ID silikon kauçuk hortum, (i) üç yollu musluk, birleştirerek boru kesimleri bağlamak için kullanılan (j) elemanı Bir kullanarak erkek Luer adaptörleri (c) iki 1/8 "dikendişi Luer kuplörün (d) ile dişi Luer. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2:. Böbrek decellularization Temsilcisi Sonuçlar Temsilcisi brüt ve mikroskopik görüntüleri böbrekler öncesi ve decellularization aşağıdaki gösterilmiştir. Böbrek geçiren decellularization (A) Zaman atlamalı serileri. Görüntüler belirtilen her reaktif ile perfüzyon hemen sonra gösterilmektedir. % 0.1 SDS (sodyum dodesil sülfat), perfüzyon sonrasında, muhafaza damar ağı görülür. (B) kesitli ve hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyandı yerli veya decellularized böbreklerin Temsilcisi görüntüler. Mikro özellikler de dahil olmak üzere glomerüllerde, toplama kanallarının ECM mimarisiVe kan damarları, decellularization aşağıdaki iyi korunmuştur. (C) Taramalı elektron mikroskop glomerüller ve tübüller yerli (üst satırda) ve decellularized (alt sıra) böbrekleri karşılaştırılması. Hücre çıkarıldıktan sonra, açık tübüller böbrek boyunca yaygındır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Hücresizleştirilmiş sıçan böbreklerinin, İnsan Böbrek Kortikal tübüler epitel Recellularization temsili Sonuçlar böbrekler esas korteks renal tübüllere RCTE hücre adezyon ile sonuçlanan yüksek basınçlı antegrad arteryel perfüzyon tekniğiyle recellularized edilir. Hematoksilen ve eozin lekeli histolo (A) Temsilcisi yüksek büyütmeli görüntü (20X)recellularized iskeleler 1, 3, veya tohumlama sonra 7 gün jik bölümleri. Üst satır hücreleri, eski böbrek ECM niş için tercihlerini gösteren arteriyel damar sistemi aracılığıyla enjekte rağmen periglomerular tübüler yer işgal olduğunu göstermektedir. Hücrelerin yoksun bir lümen ile afferent arteriol Sarı ok ucu noktaları. Alt sıra RCTE hücreleri bir hafta boyunca hücre yoğunluğu artan, çoğalırlar ve sıkı bir şekilde istiflenmiş tübüler epitel yapıları oluşturmak kortikal tübül gösterir. (B) resazurin-takviyeli kültür ortamının bir küçük (10 mi) hacmi ortam değişiklikleri sırasında böbrekler yoluyla dolaştırılır. Perfüzyon 60 dakika boyunca hücreler böbrek içinde hücre sayısı ile orantılı bir yüksek flüoresan sinyal üretir oksitlenmiş resazurin bileşiği (mavi) resorufine (kırmızı), azaltır. Histolojik görüntülerin içinde görülen hücre yoğunluğu gözlenen artışın, kültür tim üzerinde yüzde resazurin azaltma artışları ile tutarlıhücre büyümesi E, bakım kültürü sırasında her iki hücre canlılığı ve proliferasyonu, bir invasif olmayan bir gösterge sağlar. Sonuçlar ortalama ± standart sapma (n = 4 recellularized böbrek). Olarak sunulmuştur bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
. Şekil 4: Temsilcilik Sonuçları: Native, decellularized ve Recellularized Böbrekler Karşılaştırılması Düşük büyütme histolojik görüntüleri böbrek korteks göstermek, decellularized yerli böbreklerde korteks ve dış medulla ve medüller papilla bölgelerinde (üst satır), (Decell arasındaki geçiş bölgesi; orta sıra) ve 7 günlük RCTE-recellularized (7 Gün Recell; alt sıra) iskeleler. kesikli çizgi (M böbrek korteks (C) ve dış medulla arasındaki yaklaşık sınırını gösterir). Brüt görüntüler decellularization aşağıdaki tedarik sonra yerli durumunda böbrek, ve renal arter yoluyla RCTE hücrelerinin tohumlama izleyen 7 gün gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

tarif edilen decellularization protokolü sürekli olarak vasküler endotel hücrelerinin 7,17 ilave olarak, (yakın ve uzak olan tübül-türetilmiş) insan renal kortikal tübüler epitel hücrelerin kültürü için 3 boyutlu bir şablon olarak hizmet veren bir tam hücresel olmayan böbrek ECM üretir. kanüle renal damar sistemi, böylece perfüzyon decellularization hücre ekim, uzun vadeli bir perfüzyon kültürü ve resazurin perfüzyon protokolleri sağlayan bir biyoreaktör kurulumu olan iskele boyunca reaktifler ve hücreler homojen dağılımı için önemli bir özellik olarak hizmet vermektedir. Önce Organ perfüzyon renal arter gibi, uygun kanülasyon kritik ve özel bakım renal arter tıkalı ya da hasarlı ve kateter güvenli olduğunu emin olmak için alınması gereken gibi. Damar içi pıhtı b olamaz böbrek geri kazanılır olan Sprague Dawley fareleri, sistemik, organ tedarik esnasında damar içinde pıhtılaşmayı önlemek için heparinize olmalıdıre çıkarılır ve böbrek tam decellularization inhibe edebilir.

recellularized böbreklerin tohumlama ve perfüzyon kültürü için kullanılan perfüzyon biyoreaktör in situ 17 birden fazla tohum yöntemleri izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Burada tarif edilen arteriyel enjeksiyon tekniği ek olarak, hücreler kateterize üreter ya da renal damar yoluyla geriye enjekte edilebilir. (Şekil 1C bkz kısmi vakum), üretral tohumlama Üstelik, biyoreaktör gövdesi negatif basınç uygulanmasını sağlayan bir valf ile donatılmıştır. Ne olursa olsun kullanılan tohum stratejisi, renal arter boyunca kültür ortamı antegrad perfüzyon yeterli besin tohumlandı hücrelere (örneğin, oksijen, glikoz) teslimat için kritik önem taşır.

açıklanan Recellularization protokolü epitel tubulogenesis için özel şablonlar olarak hizmet decellularized böbrek matrislerin bizim kullanımını gösterir. Ancak, biz daha önce var shBöbrek matris ayrıca trombotik önleyerek hayvan modellerinde recellularized böbreklerin olan uzun süreli nakli için önemli bir gözlemdir olan muhafaza damar ağının yeniden endotelizasyon gösterir ve insan uyarılmış pluripotent kök hücre türevli endotel hücreleri ile kaplı olabilir Bu, kendi Böbrek damarsal 7 tıkanması. Büyük hayvan böbrek iskeleleri böbrek Recellularization protokollerinin nihai ölçek-up güncel bir engel, insan ölçekli böbrek iskeleleri yeniden doldurmak için gerekli hücrelerin çok daha büyük bir sayıdır. Bu, yukarıda tarif edilen yüksek basınç arteriyel enjeksiyon tekniği kadar etkili tohumlama stratejileri, kritik hücresizleştirilmiş ECM içinde aşılanmakta hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için ihtiyaç vardır. Doğal böbrekte heterojen hücre bileşimi göz önüne alındığında, çok sayıda tohumlama yöntemleri sonuç olarak etkili bir Collec çeşitli hücre tipleri ile, çeşitli hücre dışı böbrek niş yeniden doldurmak için gerekli olabilirtif filtrasyon, geri emiliminin, idrar konsantrasyon ve hormon sentezi de dahil olmak üzere böbrek sayısız işlevleri gerçekleştirmek.

Son olarak, bu makale gösterilen resazurin perfüzyon deneyi uzun süreli kültür 7,17,18 sırasında hücre canlılığı ve çoğalması bir non-invaziv, toksik olmayan değerlendirme sağlar. Deney, böbrek iskeleler içinde büyüyen hücrelerin metabolik durum ile ilgili anlık geri besleme sağlar ve düzenli aralıklarla ortamı santralleri arasında gerçekleştirilen zaman, zaman içinde hücre çoğalmasını karakterize etmek için kullanılabilir. resazurin reaktif tahlil gerçekleştirmek için biraz zaman (1 saat) gerektirir, ucuzdur ve hücre çoğalmasını veya recellularized iskele, terminal fedakarlık gerektirir histolojik değerlendirme ile karşılaştırıldığında metabolik trendleri karakterize etmek daha muhafazakar bir analitik yöntemdir. resazurin perfüzyon deneyi, aynı zamanda, diğer Rece içinde büyüme sırasında hücre popülasyonlarının değerlendirilmesi için uyarlanabilirllularized organlar ve dokular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

Tags

Biyomühendislik Sayı 102 Biyoreaktör hücre tohumlama decellularization hücre dışı matriks epitel böbrek perfüzyon Recellularization böbrek resazurin iskele doku mühendisliği

Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y.,… More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter