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Bioengineering

上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製

Published: August 10, 2015 doi: 10.3791/53271
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4, 1,2, 1,2, 5, 6, 7,8, 1,2,3,4,8,9
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

ERRATUM NOTICE

Abstract

このプロトコルは、無細胞の生成を詳述、まだ臓器規模な組織開発のための小規模なモデル基質として有用である生体機能、腎細胞外マトリックス（ECM）足場。スプラーグドーリーラットの腎臓がインタクト無傷、全腎臓足場を導出するために26時間かけて腎動脈にカテーテルを挿入することによりカニューレを挿入し、低濃度の界面活性剤（トリトンX-100、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS））のシリーズで灌流されています灌流血管系、糸球体および尿細管。脱細胞化の後、腎足場は、カスタム設計された灌流バイオリアクター容器の内部に配置され、カテーテルは、腎動脈からなる灌流回路に接続されている：蠕動ポンプ。チューブ;そしてpH、溶存酸素、および圧力のためのオプションのプローブ。過酢酸、エタノール、及びpH（7.4）で平衡と足場を滅菌した後、腎臓足場はラーグ内の培地の灌流を介して、播種のために準備されます電子容量、37℃インキュベーターで維持し、5％CO 2。四十万人の腎皮質尿細管上皮（RCTE）細胞は、腎動脈を介して注入し、急速に生理的なレートに流れを減少させる前に、15分間、高流量（25 ml /分）と圧力（〜230 mmHgの）下足場に灌流されています（4 ml /分）。 RCTE細胞は、主に、腎皮質内の管状のECMニッチを移入増殖し、灌流培養の7日間で尿細管上皮構造を形成します。培養液中の44μMレサズリン溶液は細管形成の間の細胞の生存率および増殖の蛍光、レドックス系の代謝評価を提供するために、培地交換の際に1時間の腎臓を介して灌流されます。腎臓灌流バイオリアクターは、生化学的評価のための媒体の非侵襲的なサンプリングを可能にし、複数の入口ポートは、腎静脈または尿管を介して代替の逆行性播種を可能にします。これらのプロトコルは、腎臓での足場を再細胞化するために使用することができこのシステム内の迅速な評価のための血管内皮、尿細管上皮および間質線維芽細胞を含む、様々な細胞型、。

Introduction

末期腎不全に罹患している患者の数が増加し続けるように、移植のために利用可能なドナーの腎臓の多数の深刻な、成長不足しています。腎臓移植を待つ-リストされた候補者の継続的上昇数は需要1,2にカスタマイズされた、移植可能な腎臓移植の開発を究極の目標と腎臓臓器工学の研究を促してきた。の需要を満たすことができないこと患者自身の細胞から機能する腎臓組織を構築することは、生涯免疫抑制の必要性を排除する患者が腎臓移植を待っている透析に費やす時間の量を減少させ、慢性腎疾患を有するより多くの患者に救命移植を延長します。

患者由来の細胞を用いて、腎臓組織を生物工学に向けた最初のステップは、腎実質のための支援基質となる足場を開発することである（ 例えば、管状epitheLIAL）、間質線維芽細胞、および血管細胞増殖。自然の臓器の細胞外マトリックス（ECMの）由来の生体材料足場は、それらの天然の生物学的組成物を含む、組織工学での使用に望ましいものにいくつかの特徴を持っています。生理的機能を付与するための適切なマクロとミクロ構造;および細胞の生体適合性、細胞接着、遊走、および3を改造建設組織を促進します。腎組織再生のための足場を製造するための有望な方法は、腎ECM 4の複雑な天然のタンパク質組成物の多くを保存する臓器の固有のアーキテクチャの複雑さを保持し、ボトムに伴う困難を克服する同種異系または異種腎臓の脱細胞化によるものです足場再細胞化5の後に発展する細胞への血管供給を提供することによって、厚い細胞化組織のエンジニアリングまで。

灌流脱細胞化は、プロセスでありますこれは界面活性剤、酵素、または他の細胞破壊するソリューションを均一臓器6の血管網を介して配信されます。この戦略は破棄ヒト腎臓9から無細胞腎テンプレートの開発によって証明されるように、全体の臓器工学6-8のための生物学的テンプレートが、3次元（3D）のように無細胞器官系ECM足場を導出するために効率的な方法として確立されています大動物（ 例えば、ブタ 10、ヤギ11）および齧歯類源12から得られた異種腎臓。特に、げっ歯類などの小型動物モデルの使用は、より少数の細胞および幹細胞由来の組織と同様に、細胞数は、通常、限定された臓器の再細胞化の研究のために特に有用である培養培地を必要とします。説明脱細胞化プロトコルの目的は、腎臓の再生のための三次元足場システムとして使用することができる無細胞腎ECMを生成することであるstructurヒト腎臓皮質細管上皮（RCTE）細胞と、本実施例では再増殖しているネフロン細管を含め、ES。我々は以前、以前に報告されている他の方法よりも迅速で最適な、界面活性剤ベースのラット腎臓脱細胞化プロトコル7、（約1日）の当社の厳格な評価（ロスら .- 5日12、Song ら .- 4.5日を記載しました13）、前の報告12~15より脱細胞化中に変性剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のかなり低い濃度（0.1％）の臓器を露出させます。

研究の限られた数は、（他の場所で1レビュー）細胞の再増殖12-16ための3D足場として脱細胞化およびその後の使用のためにげっ歯類の腎臓の使用を記載しています。このプロトコルでは、無細胞腎臓足場を製造するために私たちの前に確立、最適な脱細胞化戦略の詳細な説明を提供しますスプラーグドーリーラットの腎臓7から。デュアル播種とメンテナンス灌流培養17が可能なカスタムデザインの灌流バイオリアクターを使用して、我々は一貫して、これらの脱細胞化マトリックス中の管状部品を再増殖増殖し、一週間以上のための灌流培養で生存したヒトRCTE細胞と無細胞腎臓足場を再細胞化。 17研究以前に細胞毒性のために使用される安価な、非細胞傷害性、および非侵襲性の代謝性評価- -時間7にわたって再細胞化腎臓内の細胞の生存度および増殖の指標を提供するために、我々はさらにレサズリン灌流アッセイの私たちの使用を示します。

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Protocol

倫理声明：動物に関わるすべての手順は、ノースウェスタン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認ガイドラインに従って行いました。

1.腎臓の脱細胞化

  1. 脱細胞化ソリューションを準備します。脱細胞化される各腎臓のための試薬 ​​の次のボリュームを用意し、プラスつの追加のボリューム（ 例えば 、4腎臓のために、ステップ1.1.3のために5000ミリリットルトリトンX-100を準備します。）：
    1. 500は浸透水（ROH 2 O）を逆ミリリットル準備します。注：また、脱イオン水がROH 2 Oが示されている手順に使用してもよいです。
    2. ROH 2 Oで千ミリリットルトリトンX-100、1％（v / v）の準備ゆっくりと撹拌プレート上で迅速撹拌下で大きなビーカーに10ミリリットルトリトンX-100〜990ミリリットルの水を追加します。試薬が完全に溶解し、使用前に（少なくとも10分）することができます。
    3. ROH 2千ミリリットルのTriton X-100、1％（v / v）のO（SEPの準備arate体積）。
    4. ROH 2 O中（v / v）の0.1％1,000 mLのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を準備ゆっくりと撹拌プレート上に高速攪拌下で大きなビーカーに995ミリリットルの水に5ミリリットルSDS（20％ストック溶液）を追加します。試薬は使用（少なくとも10分）前に均一に混合することができます。
    5. 500ミリリットルROH 2 O（別冊）を準備します。
  2. 脱細胞化のために腎臓を準備します。
    1. 以前7に記載されているようにオスのスプラーグドーリーラット（250〜300グラム）から腎臓を回復します。
      1. ペントバルビタール（50 mg / kg体重）の腹腔内注射によりラットを麻酔。しばしば、心拍数を呼吸機能を監視することによって麻酔の深さ（10〜15分毎に）調べ、​​手術中足指ピンチ応答。動物が上昇した呼吸速度または正ペダル反射を持っている場合は、ペントバルビタールの（1/3初回用量の1/4までで）補足用量を投与。
      2. 縦正中開腹を行いますL切開は、腎臓、腹部大動脈および下大静脈を露出させます。
      3. 陰茎静脈に2,000 USPヘパリン単位/ kg体重を注入します。
      4. 穏やかな切開によって両方の腎臓を動員。無傷の腎臓の周囲の腎皮膜を維持しながら慎重に、腎周囲脂肪から腎臓を分離します。赤外線腎腹部大動脈を通して冷生理食塩水（10ml）で腎臓を灌流。
    2. 腎動脈に24ゲージのカテーテルを挿入し、しっかりと（注射器を用いて）動脈にカテーテルを連結し、静かに完全に血液の臓器をクリアするために10mlの冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の腎臓を灌流。
    3. 徐々に脱細胞化するまで、保存のために（それによって細胞溶解を誘導する）臓器を凍結する-20℃の冷凍庫にペトリ皿と場所の中に25ミリリットルのPBSで腎臓を浸し。
      注：必要に応じて、THIに記載されていないが、尿管および/または腎静脈はまた、逆行性シードにカニューレを挿入することができますSプロトコル。
    4. 完全に凍結腎臓（室温（RT）でequilibriate）を解凍し、静かに漏れを連結した腎動脈を確認するために10mlのPBSで灌流。漏れや大きな抵抗が認められた場合、腎動脈を再カテーテルを挿入。
  3. 脱細胞化のための機器を準備します。 図1（b）に示すように、脱細胞化の灌流システムを組み立てます。
    1. 1/16「内径（ID）シリコーンゴム管（ 図1D、H）の「（推奨> 36）は、2つの十分な長さに蠕動ポンプチューブの長さ（ 図1D、f）は 「1 8を接続します。ルアーは、チューブのセグメント（ 図1D、j）を結合するために雌ルアーアダプタをxは1人の女性によって接合1/8 "とげのアダプタに2雄型ルアーロックを使用してください。 「とげのアダプター1/8に追加オスルアーロックを挿入した（ 図1D、c）の腎への取り付けのための灌流ラインの下流端に動脈カテーテル。
    2. 大型ポンプカートリッジを用いて、4 - ローラーポンプヘッドに各蠕動ポンプチューブ部を接続します。
    3. 最初の液溜め（ROH 2 O）にシリコーンゴム管の上流端を配置した後、溶液に完全にプライム各灌流回路に「プライム」ボタンを押し続けます。 CRITICAL：気泡がチューブ内に閉じ込められたままではなく、 図1（b）に示すように、シリコーンゴムチューブの上流端は、（流体を描画するために開いたまま）、試薬槽の液体-空気界面の下に固定されていることことを確認します。
  4. RT 7で脱細胞化プロトコルを実行します。
    1. 空気の泡がカテーテル内に捕捉されていないことを確認して、ポンプから下流の灌流回路チューブの端部にそれぞれ解凍し、腎臓の腎動脈カテーテルを接続します。腎臓が空5リットルのビーカー（灌流液収集容器の内壁に沿って一時停止されることを可能にし、参照図UREの1B）腎動脈がよじれたり、コイル状にならないように。
    2. 5ml /分のポンプ駆動を調整し、「スタート」ボタンを押してください。各腎臓は、臓器の底からソリューションの点滴を観察することによって灌流されていることを確認します。
    3. 図1（a）に記載されているように、次の試薬 ​​で各腎臓を灌流
      1. 1時間、40分間、5ml /分で500ミリリットルROH 2 Oで灌流。
      2. 3時間、20分間、5ml /分1,000 ML 1％トリトンX-100で灌流。
      3. 16時間、40分間、1ml /分1,000 ML 1％トリトンX-100で灌流。
      4. 3時間、20分間、5ml /分で千ミリリットル0.1％SDSで灌流。
      5. 1時間、40分間、5ml /分で500ミリリットルROH 2 Oで灌流。
        注：各脱細胞化腎臓は、使用前に2週間、最大4℃で50mlコニカルチューブ中で（添加剤なし）、PBS中で保存してもよいです。

2.当たり融合バイオリアクターアセンブリ、腎臓の滅菌、および再細胞化のための準備

  1. バイオリアクター容器を準備します。
    1. 食器用洗剤溶液（ 例えば、水道水で1％食器用洗剤液）希釈し、暖かいとガラスバイオリアクター貯水池（本体部品）とバイオリアクターヘッドを洗浄した後、水道水とROH 2 Oでよくすすぎますコンポーネントが完全に乾燥することができます。
    2. 各容器の底に試薬をシリコン処理の小容量（〜5ml）に適用します。その後、余分な水分を排出、数秒間底面全体を濡らすことの試薬を確認してください。
    3. 貯水池は、RT O / Nでドラフト内で乾燥することができます。あるいは、リザーバは、乾燥を促進し、ガラスバイオリアクター容器の底への細胞の付着を防止することが意図されるコーティングの耐久性を向上させるために30分間、100℃のオーブンで乾燥させることができます。
  2. 殺菌のための灌流回路部品を準備します（ 図1D）。
    1. （各バイオリアクターのための）チューブの以下の長さをカット：
      1. IDシリコーンゴム管（ 図1D、H）2 25」1/16の長さを"カット。
      2. 蠕動ポンプチューブ（ 図1D、F）のいずれかの8」の長さをカットします。
      3. IDシリコーンゴムチューブ1 4.25「1/16の長さを "カット。
      4. IDシリコーンゴムチューブ（ 図1D、G）は、2つの1 "厚肉の1/16の長さを"カット。
      5. 1/4「ID×0.5 'の外径（OD）シリコーンゴム管（ 図1D、E）のいずれか2 "の長さをカットします。
    2. （各バイオリアクターのために）次のルアーアダプタを準備します。
      1. 1/8「とげのアダプタに10の雄ルアーロックを準備した（ 図1D、C）
      2. 2雄ルアープラグ（ 図1D、A）を調製
      3. 2雌ルアーキャップ（ 図1D、B）を準備
      4. 5匹の雌ルアーを準備Xメスルアーアダプター（×5、 図1D、D）
    3. 暖かいとすべてのチューブとルアーアダプタを洗い、食器用洗剤の希薄溶液を、水道水で十分に洗い流し、その後ROH 2 O、およびそれらを乾燥させます。
  3. 灌流回路を組み立てます。
    1. スリップ1 "バイオリアクターのヘッドに取り付けられ、入口ルアー受容にわたって厚肉1/16「IDシリコーンゴムチューブの長さ。チューブの開放端部に1/8 "IDのバーブアダプタにオスルアーロックを置きます。他の入口ルアー受容のために繰り返し、（このプロトコルで説明されていない尿管または静脈播種技術のために意図された）ポートを密封する雌ルアーキャップを接続します。
    2. 1/8「IDのバーブと雌ルアーXメスルアーアダプター（ 図1D、j）にオスルアーロックを使用して、蠕動ポンプチューブの8」のセグメントにIDシリコーンゴム管それぞれ25」1/16のセグメント」を接続します。
    3. シリコーンゴムtubinの一方の開口端を接続しますバイオリアクターヘッドの外側にメディア灌流液コンセントにG。バイオリアクターヘッドの内側にメディア灌流液出口の反対側（内側）側へのIDチューブ4.25」1/16の長さ」を接続します。
    4. 灌流回路チューブの残りの開放端に1/8 'IDとげのアダプタにオスルアーロックを接続します。雄型ルアーロックにメスルアーXメスルアーアダプターを接続します。雌ルアーは、バイオリアクターの入口ルアーアクセプターへの主要なオープン雄型ルアーロックに雌ルアーアダプタをxは接続します。これは、カテーテルを挿入し、腎動脈に直接大手メディア灌流液の入口として機能します。
    5. バイオリアクターの蓋にはポートが開いたままにしたり、露出していることを確認してください。しっかりとバイオリアクター本体に真空バルブを閉じます。
    6. 各コンポーネントの内側を覆う同一の溝の間に挟まれたOリングと、リザーバ本体の上にバイオリアクターヘッドを取り付けます。二つの成分を一緒に保持するためのインタフェースを介して金属製のクランプを配置します。
    7. 1/4「ID×0.5「ODシリコーンゴム管（ 図1D、E）の2 "の長さを使用して2つのコンポーネントを接続する場合は、0.2ミクロンのベントフィルターにバイオリアクターヘッド上の通気口を取り付けます。ベントバルブを開きます。
    8. わずかバイオリアクターヘッドの赤いスクリューキャップを緩めます。
    9. オートクレーブ袋とシールの残りのルアーアダプタと6「鋸歯状試料鉗子を置きます。
  4. 組み立てバイオリアクターと雄ルアープラグをオートクレーブ。
  5. （ボリュームが脱細胞化腎臓ごとに一覧表示されます）播種前に足場滅菌培地灌流のための以下の試薬を準備します。
    1. 換気フード内で、1リットルボトル中〜957ミリリットルROH 2 Oに2.56ミリリットル過酢酸溶液（39％ストック濃度）を、40mlの200プルーフのエタノールを添加することによって、50ミリリットルの0.1％過酢酸、4％エタノール溶液を調製します。繰り返しボトルを反転させることにより完全に混合し、生物学的安全キャビネット内に配置します。
    2. 準備しますPBS溶液1×150mlを、オートクレーブにより滅菌済み。
    3. 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した50ミリリットルDMEM / F12培地および1％ペニシリン - ストレプトマイシン（ペニシリン - ストレプトマイシン）を準備します。
  6. 灌流バイオリアクターアセンブリの残りの項目を収集します。生物学的安全キャビネット内のすべての項目を配置します。 CRITICAL：生物学的安全キャビネットがデジタルポンプ駆動に電力を供給するための電気ソケットの作業が装備されていることを確認してください。あるいは、筐体の外から外部の電気ソケットにポンプドライブを接続するために延長コードを使用します。
    1. 脱細胞化された腎臓を収集します。
    2. 添付灌流回路とのオートクレーブしたバイオリアクターを収集します。
    3. ルアーアダプタと鉗子を含むオートクレーブ滅菌袋を収集します。
    4. 添付4ローラーヘッドを備えたデジタルポンプ駆動を収集し、大きなポンプカートリッジ（灌流回路当たり1）。
  7. 無菌Cの下に、図1Cに記載されているように灌流回路を完成生物学的安全キャビネット内onditions。
    1. 1/8「メディア灌流液の入口付近IDバーブアダプタと雌ルアーXメスルアーアダプターにオスルアーロックの間に3方コック（ 図1D、i）を接続します。コックのオープンにすべての3つのポートのままにしておきます。
    2. バイオリアクターヘッドとピペット0.1％過酢酸の50ミリリットル、開口を介して媒体貯蔵中に4％のエタノール溶液の赤いスクリューキャップを外します。
    3. 大型ポンプカートリッジを使用して、ポンプヘッドに蠕動ポンプチューブ部を接続します。押して "スタート"、およびプライムに回路を許可し、5ml /分の流量を調整します。
      1. 液体が灌流ラインを充填し、三方活栓の残りの開いているポートに到達すると、雄型ルアーが（図1D）プラグイン使用してポートを接続します。
      2. 全く空気が灌流回路チューブまたは入口ルアー受容体の内側に観察されなくなるまで回路が完全にプライム許可します。もしnecessaRY、灌流ラインから気泡を排出するために一時的に流量を増加させます。完全にプライミングされた場合には、ポンプ駆動を停止します。
    4. 慎重に滅菌6「ピンセットを用いてバイオリアクターヘッドの内側面に雄入口ルアーアクセプタに腎動脈カテーテルの雌ルアーの端を差し込みます。接続がタイトで、何の空気がカテーテル内に残っていないことを確認します。腎動脈をねじったり、ねじれないように、腎臓は優しく、腎動脈カテーテルからハングアップすることができます。
    5. バイオリアクターのリザーバが密閉されるように、バイオリアクターの頭と体を一緒に保持する金属製のクランプを締めます。バイオリアクターヘッドの赤いスクリューキャップを閉じます。
  8. 5ml /分で50 mlのPBSと室温で0.1％の過酢酸、1時間、5ml /分で4％のエタノール溶液を、次いで、3つの連続1時間の灌流で灌流によりRTで腎臓を滅菌します。
    1. ソリューションを変更します：
      1. 1時間後、ポンプを停止し、赤のスクリューキャップを開きます。 STEを使用します波立たせる（オートクレーブ処理）パスツールピペット、慎重にバイオリアクター容器から溶液のすべてを吸引します。完全にプライミングされた灌流回路のままにしておきます。
      2. ピペットバイオリアクターのリザーバに新鮮な溶液50ml、スクリューキャップを閉じて、ポンプを起動します。
  9. 最後のPBSリンスした後、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した50ミリリットルDMEM / F12培地リザーバおよびピペットから吸引PBS。スクリューキャップを閉め、37℃、5％CO 2で維持し、大容量のインキュベーターに取り付けられた灌流回路とのバイオリアクターを転送します。
  10. 必要に応じて、インキュベーターにポンプ駆動を転送します。バイオリアクター灌流回路は、ポンプに接続し、播種前に少なくとも1時間、4 ml /分で腎臓を灌流。

腎皮質尿細管上皮細胞との3腎臓再細胞化

  1. DMEM / F12（10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）及びcの暖かい十分なボリュームエル37℃に細胞リフティングのための酵素を解離。提案されたボリュームは、次のとおりです。
    1. 昇降用の175cm 2の培養フラスコあたり酵素、10mlのDMEM / F12を解離10ミリリットルの細胞を準備します。
    2. 5〜10ミリリットル播種する腎臓あたりDMEM / F12を準備します。
  2. 目的の播種濃度のための培養フラスコの十分な数を収集し（4×10 7は、この播種戦略を使用してRCTE細胞の最大の移植で腎臓結果ごとに18人のRCTE細胞不死化）。
  3. 細胞解離酵素を用いてフラスコから細胞を持ち上げ。フラスコから培地を吸引し、フラスコ内に酵素を解離10ミリリットルの細胞をピペット。解離を促進する37℃のインキュベーターにフラスコを置きます。
  4. フラスコ表面から細胞を完全に解離が観察されるまで、位相差顕微鏡で2分ごとにフラスコを確認してください。注：インキュベーション時間は細胞の合流点のレベルに応じて変化するが、RCTE細胞rは意志完全に解離するequire約15分。
  5. ペレット化する前にカウントするために解離細胞懸濁液のサンプルを取ります。予め温めておいたDMEM / F12培地、5分間、232×gでの相対遠心力（RCF）での遠心分離の等量の細胞懸濁液を希釈します。
  6. 遠心分離の間に細胞をカウントします。カウント用血球計の両端に均等トリパンブルーの量、およびピペット10μLで得られた試​​料を希釈します。所望の播種濃度（2×10 7細胞/ ml）を得るために必要なペレット希釈量を計算します。
  7. 遠心分離後、2×10 7細胞/ mlの最終濃度を得るために、培地の適切な容量のペレットを希釈します。無菌の5ml注射器に播種サスペンションの2ミリリットルを描画します。
  8. 生物学的安全キャビネットに灌流バイオリアクターを転送します。播種ポートにフローを閉じるためにストップコックバルブを回します。からの雄型ルアースリッププラグを取り外しコック、および播種サスペンションを搭載した注射器を接続します。
  9. すぐに戻ってインキュベーターに灌流回路を転送し、ポンプヘッドに蠕動ポンプチューブ部を確保するために大規模なポンプカートリッジを使用します。
  10. 細胞播種：ポンプに向いコックバルブポートを閉じます。ゆっくりと全体の懸濁液をコックと灌流ラインに注射器から転送されたことを確認して、腎臓に細胞懸濁液を注入します。シリンジからの流れを閉じ、15分間、25 ml /分でポンプを起動するためにストップコックバルブを回します。
  11. 15分後4 ml /分のポンプ流量を下げます。交換媒体（その後の変更のための100ミリリットルの容量）次の日、その後2日ごと。

レサズリン灌流アッセイを使用して、4。細胞生存度の評価および増殖

  1. レサズリン試薬を準備します。撹拌しながらPBS 100ml中の110.5 mgのレサズリンのナトリウム塩を溶解し、そして5mlのを添加することによって1:10に希釈原液をレサズリン440μMを作成するために45ミリリットルの新鮮なPBSの溶液を生じました。 （0.2μmのシリンジフィルターを用いて）濾過滅菌し、4℃で光保護された50mlコニカルチューブ内の原液を格納します。
  2. レサズリン添加培地コントロールを準備します。 （ 例えば、5mlのレザズリン原液+ 45ミリリットルの培地）培地にレサズリン試薬の10％溶液を調製しレサズリン作業溶液を作成します。光保護された容器内のレサズリン作業溶液10ml容積をオートクレーブ。注：これは完全にレゾルフィンするレサズリン化合物を減少させる、およびパーセントレサズリンの減少を計算するためのポジティブコントロールとして機能します。
  3. アリコート1ミリリットルレサズリンのそれぞれが独立した1.5​​ミリリットルのコレクションチューブにワーキング溶液（還元）レサズリンオートクレーブ処理溶液（酸化）、および培地のみ（ブランク）を作業。灌流バイオリアクターと同じインキュベータにオープンチューブを置きます。
  4. 腎臓灌流を転送生物学的安全キャビネットのインキュベーターから回路。バイオリアクターヘッドからスクリューキャップを外し、パスツールピペットを用いて、バイオリアクター容器から吸引培地。
  5. ピペットは、10リザーバにレサズリン作業溶液のミリリットル、近いスクリューキャップ、バックインキュベーターに腎臓灌流回路を転送します。
  6. 4ミリリットル/分でポンプを起動し、試薬が正確に1時間、腎臓を介して灌流することができます。
  7. 1時間後、ポンプを停止し、生物学的安全キャビネットに腎臓灌流回路を転送します。
  8. コンディショニング（部分還元）レサズリン溶液を収集し、バイオリアクター容器に100ミリリットルの培地を追加します。転送灌流回路をインキュベーター、および（4 ml /分）の流れを再開します。
  9. ピペット100μL（×3反復）は、ワーキング溶液レサズリン、ソリューションをレサズリンコンディショニング作業溶液オートクレーブ処理し、培養培地（不透明な）黒に空の96ウェルアッセイプレート。 （excitat蛍光強度を読みますイオン：35分の540;放射：20分の590）分光光度計を使用して。
  10. 酸化レサズリン媒体によって生成された蛍光強度（FI）により正規化蛍光強度の比としてパーセント減少を計算する（ORM、または細胞に曝露されていない作業溶液をレサズリン）または中レサズリン減少（RRM、または作業溶液をオートクレーブ処理）：％縮小= 100×{[FI（コンディショニングレサズリン溶液） - FI（ORM）] / [FI（RRM） - FI（ORM）]}。結果を正規化するために、インキュベーション時間（1時間）により容積（10ml）および除算を循環させることにより％の減少を掛けます。

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Representative Results

腎臓は、順次、水 ​​で灌流し、以前に確立された、最適な脱細胞化プロトコル（ 図1A、Bを参照してください）7、26時間かけて徐々に透明になるに従って洗剤溶液（1％トリトンX-100、0.1％SDS）を希釈し、として図2Aに示します。得られた無細胞腎臓足場は、細胞を欠いていると灌流プロトコルに従って破損していない無傷の腎被膜、でサポートされている粘着性腎ECMを保持します。最終的な洗剤灌流（SDS）、腎臓の血管網、特に葉間船により、顕著に（ネフロン細管の比較的薄い基底膜に対するこれらの血管の大きな厚さ​​のために、脱細胞化足場に表示されています図2A、B）を参照してください。臓器全体は糸球体、尿細管、およびCOLの無傷の基底膜のネットワークを残して、ネイティブの細胞のクリアされますダクト、皮質葉間動脈の内部と外部の弾性板を含む脱細胞化血管のECMをlecting（ 図2B、C参照）。より大きな血管に加えて、糸球体内の微小血管の基底膜は、（ 図2B、C参照 ）構造的完全性を維持します。

脱細胞化腎臓、腎ECMの自然加水分解劣化を制限するために、4℃でPBS中に格納され、脱細胞化の2週間以内に使用すべきです。我々は以前に詳細に両方の播種脱細胞化げっ歯類の腎臓足場のために使用されるカスタム灌流ベースの腎バイオリアクターの設計、およびフロー17の下で再細胞化臓器の長期培養を記載しています。再細胞化のために、小径のシリコーンゴムと耐疲労PharMedポンプチューブからなる灌流回路は、バイオリアクター容器から経路培地に使用され、蠕動ポンプ、およびバックカテーテルを挿入腎動脈がバイオリアクターヘッドの内面に接続された入口ルアーアクセプターへ（ 図1C参照 ）。過酢酸/エタノール混合物で灌流することにより脱細胞化腎臓を滅菌した後、灌流システムをインキュベーター内に足場を介して（細胞ECMの接着性を向上させるために、10％FBSを含有する）標準的な培養培地を循環させることにより、播種のために準備されます。

脱細胞化された腎臓は、今、私たちが以前に血行再建術7を誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞を用いて行われている再細胞化のような無細胞ECMテンプレートを、働くことができます。ここでは、ヒト由来の腎皮質尿細管上皮（RCTE）細胞を用いて、細管形成のためのこの足場と灌流バイオリアクターシステムの有用性を実証しています。 RCTE細胞は、以前に記載されている高圧灌流プロトコルの下で腎動脈を通って腎臓足場に播種された7主に彼らは優先的に糸球体周辺細管（ 図3A参照 ）を再作成、腎臓の皮質領域にこのようにして家に注入し、17 .RCTE細胞。少数の細胞は、1日目播種後に糸球体内に埋め込み、7日目までに、糸球体は、細胞の実質を欠いています。灌流培養の間、培地は、レサズリン灌流アッセイは同時に時間（ 図3B参照 ）を介して細胞の生存率の比較評価を提供するために実行される時点で2日ごとに変更されます。レサズリン削減結果によって支持されるように、RCTE細胞は、多くの順行性灌流培養の7日後に、これらの細胞の大部分が腎ECMの皮質領域を占有しているが7日目によってしっかりと組織化、特許の管状構造を形成する、3D ECM内で増殖しますRCTE内張り細管は、外側髄乳頭尿細管と集合管（ 図4参照）に存在しています。 RCTE細胞あたりの1週間で再増殖した後、融合文化は、透明性が脱細胞化が失われた後に観察され、再細胞化腎臓が不透明とその天然状態に外観が近い表示されます（ 図4を参照）。

図1
図1：げっ歯類の腎臓の脱細胞化のための試薬 ​​の腎臓脱細胞化システムおよびプロトコルと再細胞化灌流回路（A）潅流スケジュール。脱細胞化、体積流量、及び各段階の期間中に使用される試薬が示されています。 （B）灌流脱細胞化のセットアップ。ソリューションは、脱細胞化を受けて、各腎臓のための個々のフローラインを介して灌流液回収容器に試薬槽から一方向にポンピングされます。最大4つの腎臓を蠕動ポンプごとに脱細胞化することができます。 （C）灌流回路FOR播種および再細胞化腎臓足場の文化。細胞を、ルアー入口受容体の上流に直接接続された注射器を介してロードされます。監視圧力に対する任意のインラインセンサ、溶存酸素（DO 2）、及びpHは、バイオリアクターの上流に配置されてもよいです。デジタル蠕動ポンプは、コンピュータによって制御されてもよいし、負圧（部分真空）は、尿管の播種を促進するために適用することができます。 （D）成分は、脱細胞化（B）および再細胞化（C）のための灌流ラインを作成するために使用されます。 （a）は、雄型ルアープラグ、（b）は、雌ルアーキャップ、（c）はオスルアーロック1/8 "とげのアダプター、メスルアーアダプター、（E）〜（d）はメスルアー¼" IDのシリコンチューブ、（F）へ蠕動ポンプチューブ、G：厚肉1/16 "IDシリコーンゴムチューブ、（H）1/16" IDシリコーンゴムチューブ、（I）三方活栓、組み合わせることにより、チューブのセグメントを接続するために使用する（j）のカプラー使用した雄型ルアー·アダプタ（C）には、2つの1/8 "バーブ雌ルアーカプラ（d）の雌ルアー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
図2：腎臓の脱細胞化の代表的な結果代表肉眼および顕微鏡画像は前に腎臓の図示および脱細胞化以下の通りです 。脱細胞化を受けて、腎臓の（A）タイムラプスシリーズ。画像は、指定された各試薬で灌流直後に示されています。 0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の灌流の後、保存された血管網が見えます。 （B）切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色した天然または脱細胞化腎臓の代表的な画像。微細構造の特徴を含む、糸球体、集合管のECMアーキテクチャ、および血管、脱細胞化以下のよく保存されています。 （C）走査型電子顕微鏡写真は、糸球体と尿細管ネイティブ（一番上の行）および脱細胞化（下の行）の腎臓を比較します。細胞を除去した後、開いて細管が腎臓全体に蔓延している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
図3：脱細胞化ラットの腎臓のヒト腎皮質尿細管上皮再細胞化の代表的な結果腎臓は主に皮質の尿細管にRCTE細胞接着をもたらす高圧順行性動脈灌流技術によって再細胞化されています。ヘマトキシリンおよびエオシン染色histoloの（A）代表の高倍率画像（20X）再細胞化足場1、3、または7日播種後の外科用のセクション。一番上の行は、細胞が元腎ECMのニッチのために自分の好みを示し、動脈血管系を介して注入されているにもかかわらず糸球体周辺筒状空間を占有することを示しています。細胞を欠いているルーメンと輸入細動脈に黄色の矢印のポイント。下段はRCTE細胞が一週間にわたって細胞密度の増加に伴って、増殖し、そして密集細管上皮構造を形成する皮質細管を示しています。 （B）レサズリン補充培地の小（10ml）中のボリュームは、メディアの変更時に腎臓を介して再循環されます。灌流の60分の間、細胞は、腎臓内の細胞の数に比例して強い蛍光シグナルを生成する、（赤）をレゾルフィンに酸化レサズリン化合物（青）を減らします。組織学的画像内の見細胞密度で観察された増加、文化ティム％以上レサズリン還元増加と一致して細胞増殖とE、維持培養中の細胞の生存度および増殖の両方を非侵襲的指示を提供します。結果は、平均±標準偏差（n = 4の再細胞化腎臓）。として提示されている。この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4
図4：代表的な結果：ネイティブの比較、脱細胞化および再細胞化腎臓を低倍率の組織学的画像はDecell（脱細胞化、ネイティブ腎臓における皮質および髄質外層、及び髄乳頭領域の間の腎皮質、移行帯（一番上の行）を示し;。中段）、および7日間のRCTE-再細胞化（7日Recell、一番下の行）の足場。点線は、腎皮質（C）と外側髄質（M間のおおよその境界を示しています）。グロス画像が脱細胞化、および腎動脈を介してRCTE細胞の播種後の7日後に、調達後にその天然の状態で腎臓を示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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Discussion

記載の脱細胞化プロトコルは、一貫して血管内皮細胞7,17に加えて、（近位および遠位尿細管の両方由来の）ヒト腎皮質尿細管上皮細胞の培養のための3次元テンプレートとして機能する完全無細胞腎ECMを生成します。カニューレを挿入し、腎血管系は、このように灌流脱細胞化、細胞播種、長期灌流培養、およびレサズリン灌流プロトコルを有効にする、バイオリアクターのセットアップ内の足場全体に試薬および細胞の均一な送達のための重要な特徴となっています。このように、従来の臓器灌流の腎動脈の適切な挿管は重要であり、特別なケアは、腎動脈が閉塞または損傷し、カテーテルが固定されていることをされていないように注意する必要があります。血管内血栓をbができないように腎臓が回収されるのSDラットは、全身、臓器調達時の血管系内の凝固を避けるために、ヘパリン処理されなければなりませんEを除去し、腎臓の完全な脱細胞化を阻害することができます。

再細胞化腎臓の播種および灌流培養に使用される灌流バイオリアクターは、その場 17 内の複数の播種方法を可能にするように設計されています。ここに記載の動脈注入技術に加えて、細胞は、尿管カテーテルまたは腎静脈を介して逆行性注入することができます。尿管播種のため、;また、生物反応器本体が（ 図1Cを参照して部分真空）負圧の適用を可能にするバルブが取り付けられています。関係なく利用播種戦略の、腎動脈を通る培地順行性の灌流は、十分な栄養（ 例えば 、酸素、グルコース）播種した細胞への送達のために重要です。

記載再細胞化プロトコルは、具体的には、上皮管形成のためのテンプレートとして機能する脱細胞化腎臓行列の私たちの使用方法を示しています。しかし、我々は以前のshを持っています腎マトリックスはまた、保持血管網の再内皮化をサポートし、血栓を防止することにより、動物モデルにおける再細胞化腎臓の最終的な長期的な移植のための重要な観察であるヒトの人工多能性幹細胞由来の内皮細胞で裏打ちすることができることを自分腎血管系7の閉塞。大動物腎臓足場に腎臓再細胞化プロトコルの最終的なスケールアップへの現在の障害は、人間サイズの腎臓足場を再作成するために必要な細胞の実質的に大きい数です。例えば、上記高圧動脈注入法として効率的接種戦略は、決定的に脱細胞化されたECM内に生着細胞の数を最大化するために必要とされます。ネイティブ腎臓の不均一な細胞組成を考慮すると、複数の播種方法は、最終的には効果的collec多様な細胞型に種々の細胞外腎ニッチを再作成するために必要な場合がありますtivelyろ過、再吸収、尿の濃度、およびホルモン合成を含む腎臓の多数の機能を実行します。

最後に、この記事で実証レサズリン灌流アッセイは、長期培養7,17,18の間に細胞の生存率および増殖の非侵襲的、非毒性の評価を提供します。アッセイは、腎臓足場内で増殖する細胞の代謝状態に瞬時にフィードバックを提供し、定期的に定期的な培地交換の間で行われるときに、時間をかけて細胞増殖を特徴付けるために使用することができます。レサズリン試薬が安価であり、アッセイは、（1時間）を行うには少し時間が必要で、それが再細胞化スカフォールドの端子の犠牲を必要とする組織学的評価と比較した細胞増殖または代謝の傾向を特徴付けるために、より保守的な分析方法です。レサズリン灌流アッセイはまた、他のRECE内に成長中の細胞集団の評価のために適合させることができます臓器や組織をllularized。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

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References

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Tags

バイオエンジニアリング、問題102、バイオリアクター、細胞播種、脱細胞化、細胞外マトリックス、上皮、腎臓、灌流、再細胞化、腎、レサズリン、足場、組織工学

Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製
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Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y.,… More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

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