Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von azellulären, noch biofunktionellen, Nierenextrazellulären Matrix (ECM) Gerüste, die als kleine Modellsubstrate für Orgel angelegten Gewebeentwicklung sind. Sprague Dawley-Rattennieren werden durch Einführen eines Katheters in die Nierenarterie über 26 h kanüliert und mit einer Reihe von niedrigkonzentrierten Waschmitteln (Triton X-100 und Natriumdodecylsulfat (SDS)) perfundiert, um intakte, ganze Niere Gerüste mit intakten abzuleiten perfundierbaren Gefäßsystem, Glomeruli und Nierentubuli. Folgende Dezellularisierung wird das Nierengerüst in einem speziell entworfenen Perfusionsbioreaktor Gefäß platziert und der katheterisiert Nierenarterie an eine Perfusionskreislauf, bestehend aus miteinander verbunden sind: einer peristaltischen Pumpe; Schlauch; und wahlweise Sonden für pH, gelöster Sauerstoff und Druck. Nach Sterilisieren des Gerüsts mit Peressigsäure und Ethanol, sowie den Ausgleich der pH-Wert (7,4), der Niere Gerüst zum Impfen mittels Perfusion von Kulturmedium in einem larg zubereitetE-Kapazität bei 37 ° C gehalten und 5% CO 2. Vierzig Millionen Nierenrinden Tubulusepithelzellen (RCTE) Zellen durch die Nierenarterie durch das Gerüst unter Hochstrom (25 ml / min) und Druck (~ 230 mm Hg) für 15 min vor der Verringerung der Fließgeschwindigkeit auf einen physiologischen spritzt und rasch perfundierten (4 ml / min). RCTE Zellen besiedeln vor allem die Rohr ECM Nische in der Nierenrinde, vermehren sich und bilden Rohr Epithelstrukturen über sieben Tagen Perfusionskultur. A 44 uM Resazurinlösung in Kulturmedium wird durch die Niere für 1 h bei Medium tauscht perfundiert, um eine fluorometrische, redox-basierte metabolische Beurteilung der Zell-Lebensfähigkeit und Proliferation während Tubulogenese bereitzustellen. Die Niere Perfusionsbioreaktor ermöglicht nicht-invasive Entnahme von Medium für biochemische Bewertung, und mehrere Einlassöffnungen ermöglichen alternative Rück Aussaat durch die Nierenvene oder Harnleiter. Diese Protokolle können verwendet werden, um Nieren Gerüste mit einem recellularize werdenVielzahl von Zelltypen, einschließlich vaskulären Endothelzellen, Tubulusepithelzellen und stromalen Fibroblasten zur schnellen Auswertung innerhalb dieses Systems.
Introduction
Da die Zahl der Patienten mit end-stage Nierenversagen weiter zu erhöhen, gibt es eine starke und wachsende Knappheit in der Zahl der Spendernieren für die Transplantation zur Verfügung. Die Unfähigkeit, die Nachfrage einer stetig steigenden Zahl von Bewerbern zu treffen für Nierentransplantation Warteliste hat sich die Forschung in Niere Orgel Technik mit dem Ziel der Entwicklung von kundenspezifischen, implantierbare Nierentransplantate auf Anfrage 1,2 aufgefordert werden. Aufbau funktionierender Nierengewebe aus patienteneigenen Zellen würde die Notwendigkeit des lebenslangen Immunsuppression zu beseitigen, verringern die Menge der Zeit verbringen die Patienten an der Dialyse wartet auf eine Nierentransplantation und erstrecken sich lebensrettende Transplantation, mehr Patienten mit chronischer Nierenerkrankung.
Der erste Schritt zur Verwendung Bioengineering Patienten stammenden Zellen, die ein Nierengewebe ist es, ein Gerüst, das als Stützsubstrat für Nierenparenchym dient entwickeln (zB Rohr epitheLiAl), Stroma-Fibroblasten und Gefäßzellwachstum. Biomaterial Gerüste aus natürlichen extrazellulären Organ Matrices (ECM) abgeleitet haben mehrere Eigenschaften, die sie für den Einsatz im Tissue Engineering, einschließlich ihrer natürlichen biologischen Zusammensetzung wünschenswert machen; entsprechende Makro- und Mikrostruktur, um physiologische Funktion zu versehen; und zellulären Biokompatibilität Förderung der Zelladhäsion, Migration und Umbau 3 konstruktiven Gewebe. Eine vielversprechende Methode, um Gerüste für Nierengeweberegeneration zu erzeugen, ist durch Dezellularisierung von allogenen oder xenogenen Nieren, die einen Großteil der komplexen natürlichen Proteinzusammensetzung der Niere ECM 4 zu erhalten, behalten die inhärente Komplexität der Architektur der Orgel, und die Überwindung der Schwierigkeiten mit Bottom zugeordnet up-Engineering von dicken cellularized Gewebe durch die Bereitstellung einer Gefäßversorgung in Entwicklungs Zellen nach Gerüst Rezellularisierung 5.
Perfusion Dezellularisierung ist ein Verfahren inwelche Detergentien, Enzyme oder andere Zellstörende Lösungen werden gleichmäßig durch das Gefäßnetzwerk des Organs 6 geliefert. Diese Strategie hat sich als effizienter Prozess eingerichtet, um azellulären organ ECM-Gerüste als dreidimensionale (3D), biologische Schablonen für ganzen Organ Engineering 6-8, wie durch die Entwicklung von zellfreien Nieren Vorlagen von weggeworfenen menschlichen Nieren 9 belegt abzuleiten und xenogenen Nieren von Großtier (zB Schwein 10, Ziege 11) und Nagetierquellen 12 erhalten. Insbesondere die Verwendung von kleinen Tiermodellen wie Nagetiere erfordert weniger Zellen und Kulturmedien, die besonders nützlich für die Organ Rezellularisierung Studien, in denen Zellzahlen sind in der Regel begrenzt ist, wie es der Fall mit Stammzellen abgeleiteten Geweben. Das Ziel des beschriebenen Dezellularisierung Protokolls ist es, eine azelluläre Nieren ECM, die als 3D-Gerüst-System zur Regeneration von Nieren Structur verwendet werden können, zu erzeugenES, einschließlich Nephron Tubuli, die im vorliegenden Beispiel mit der menschlichen Nierenrinden Tubulusepithelzellen (RCTE) Zellen wieder besiedelt werden. Wir zuvor beschrieben unserer strengen Bewertung eines optimalen Waschmittelbasis Rattenniere Dezellularisierung Protokoll 7, die mehr schneller (ca. 1 Tag) als andere Methoden zuvor berichtet (Ross et al .- 5 Tage 12, Song et al .- 4,5 Tage 13), und setzt die Orgel zu einer deutlich geringeren Konzentration (0,1%) des Denaturierungsmittels Natriumdodecylsulfat (SDS) bei Dezellularisierung als frühere Berichte 12-15.
Eine begrenzte Anzahl von Studien haben die Verwendung von Nagetier-Nieren Dezellularisierung und die anschließende Verwendung als 3D-Gerüst für Zell Repopulation beschrieben (Bewertung anderswo 1) 12-16. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Beschreibung unserer zuvor ermittelten optimalen Dezellularisierung Strategie zur Herstellung von azellulären NierengerüsteSprague Dawley-Rattennieren 7. Mit Hilfe speziell entworfenen Perfusion Bioreaktoren in der Lage Dual Aussaat und Pflege Perfusionskultur 17. recellularize wir die azellulären Nieren Gerüste mit menschlichen RCTE Zellen, die konsequent die röhrenförmige Komponente wieder zu bevölkern in diesen dezellularisierten Matrizen, vermehren und überleben in Perfusionskultur über eine Woche. Wir die Verwendung der Resazurin Perfusion Assay zeigen ferner – einem kostengünstigen, nicht-zytotoxischen und nicht-invasive metabolische Beurteilung zuvor für Cytotoxizität verwendet Beispiele 17 -, um eine Anzeige der Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation innerhalb der rezellularisiertes Nieren über die Zeit 7 bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebene Dezellularisierung Protokoll konsistent erzeugt eine ganz azellulären Nieren ECM, die als 3D-Vorlage für die Kultur von menschlichen Nierenrinden Tubulusepithelzellen (beide proximalen und distalen Tubulus-abgeleitete) dient, zusätzlich zu den vaskulären endothelialen Zellen 7,17. Die Kanüle versehen Nierengefäßsystem dient als wesentliches Merkmal für eine gleichmäßige Abgabe von Reagenzien und Zellen in der gesamten Gerüst in einem Bioreaktor Set-up, so dass die Durchblutung Deze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
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