This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Este protocolo detalha a geração de acelular, ainda, renais matriz extracelular (ECM) andaimes biofuncionais que são úteis como pequenos substratos modelo para o desenvolvimento do tecido do órgão escala. Sprague Dawley rins de ratazana são canulados através da inserção de um cateter na artéria renal e perfundido com uma série de detergentes de baixa concentração (Triton X-100 e dodecil sulfato de sódio (SDS)) ao longo de 26 h para derivar intactas, andaimes todo-renais com intacta vasculatura perfusable, glomérulos e túbulos renais. Após a descelularização, o andaime renal é colocado dentro de um vaso de bioreactor de perfusão personalizados, e a artéria renal cateterizada está ligado a um circuito de perfusão que consiste em: uma bomba peristáltica; tubulação; e sondas de opcionais para pH, oxigênio dissolvido, e pressão. Após a esterilização do andaime com ácido peracético e etanol, e o equilíbrio do pH (7,4), o andaime de rim é preparado para propagação através de perfusão de meio de cultura dentro de um largincubadora e capacidade mantida a 37 ° C e 5% de CO 2. Quarenta milhões de células epiteliais tubulares corticais renais (RCTE) são injectados através da artéria renal, e rapidamente perfundido através do andaime sob alto fluxo (25 ml / min) e de pressão (~ 230 mmHg) durante 15 min antes de reduzir o fluxo a uma taxa fisiológica (4 ml / min). Células RCTE preencher primeiramente o nicho ECM tubular dentro do córtex renal, proliferam e formam estruturas epiteliais tubulares ao longo de sete dias de cultura de perfusão. Uma solução resazurina 44 uM em meio de cultura é perfundido através do rim durante 1 h durante as trocas de média para proporcionar uma avaliação fluorométrico, à base de redox metabólica de viabilidade e proliferação celular durante tubulogenesis. O bioreactor de perfusão do rim permite a amostragem não invasiva de meio de avaliação bioquímica, e várias portas de entrada de ar permite a semeadura alternativa retrógrado através da veia renal ou ureter. Estes protocolos podem ser usadas para recellularize andaimes nos rins com umvariedade de tipos de células, incluindo as células endoteliais vasculares, do epitélio tubular, e fibroblastos do estroma, para avaliação rápida dentro deste sistema.
À medida que o número de pacientes que sofrem de fase final de insuficiência renal continua a aumentar, há uma escassez grave e crescente do número de rins de doadores disponíveis para transplante. A incapacidade de atender a demanda de um número crescente de candidatos continuamente espera-listados para o transplante renal levou a investigação em engenharia órgão rim com o objetivo final de desenvolvimento personalizado, enxertos renais implantáveis sob demanda 1,2. , Que funcionará tecido renal a partir de células do próprio paciente eliminaria a necessidade de imunossupressão ao longo da vida, diminuir a quantidade de tempo que os pacientes gastam em diálise à espera de um transplante de rim, e estender o transplante salva-vidas a mais pacientes com doença renal crônica.
O primeiro passo para a bioengenharia um tecido renal usando células derivadas de pacientes é o de desenvolver uma estrutura de suporte que serve como um substrato de suporte para o parênquima renal (por exemplo Epítetos tubularLiAl), fibroblastos do estroma, e o crescimento celular vascular. Andaimes biomaterial derivadas de matrizes extracelulares de órgãos naturais (ECM) têm várias características que os tornam desejáveis para utilização em engenharia de tecidos, incluindo a sua composição biológica natural; macro e microestrutura adequada para dotar funções fisiológicas; e biocompatibilidade celular, promovendo a adesão celular, migração e tecido construtiva remodelação 3. Um método promissor para produzir scaffolds para regeneração de tecidos renal é através decellularization de alogênicos ou xenog�icas rins que preservar muito da composição proteína natural complexo do ECM rim 4, manter a complexidade arquitetônica inerente do órgão, e superar a dificuldade associada com bottom up engenharia de tecidos celularizados grossas, fornecendo um suprimento vascular para as células em desenvolvimento após andaime recelularização 5.
Perfusão descelularização é um processo emque detergentes, enzimas ou outras soluções de desregulação celulares são uniformemente distribuído através da rede vascular do órgão 6. Esta estratégia tem sido definida como um processo eficiente para derivar acelulares andaimes ECM baseada em órgãos como tridimensional (3D), modelos biológicos para engenharia de órgão inteiro de 6-8, como evidenciado pelo desenvolvimento de modelos renais acelulares de rins humanos descartados 9 e os rins xenog�icas obtidos a partir de grandes animais (por exemplo, 10 porco, cabra 11) e fontes de roedores 12. Em particular, a utilização de modelos animais, tais como roedores pequenos requer menos células e meios de cultura, o que é especialmente útil para estudos Recellularization órgão no qual os números de células são normalmente limitados, como é o caso com os tecidos derivadas de células estaminais. O objectivo do protocolo de descelularização é descrito para a produção de um ECM renal acelular que pode ser usado como um sistema de andaimes 3D para a regeneração do rim structures, incluindo os túbulos são repovoados nefrónios que no presente exemplo com epiteliais tubulares cortical renal humano (células RCTE). Nós anteriormente descrito a uma avaliação rigorosa de um protocolo óptimo detergente à base de rim de rato descelularização 7, que é mais rápida (aproximadamente um dia) do que os outros métodos relatados anteriormente (Ross et al .- 5 dias 12, Song et al .- 4,5 dias 13), e expõe o órgão a uma concentração consideravelmente mais baixa (0,1%) do sulfato de dodecilo de sódio desnaturante (SDS) durante a descelularização que relatórios anteriores 12-15.
Um número limitado de estudos têm descrito o uso de rins de roedores para decellularization e posterior utilização como um arcabouço 3D para repovoamento celular (revisto em outra parte 1) 12-16. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição detalhada de nosso previamente estabelecido, a estratégia decellularization ideal para a produção de andaimes renais acelulara partir de rins de ratos Sprague Dawley 7. Usando bioreactores de perfusão de design personalizado capazes de dupla semeadura e manutenção de perfusão cultura 17, nós recellularize os andaimes renais acelular com células RCTE humanos, que consistentemente repovoar o componente tubular nessas matrizes descelularizados, proliferam e sobrevivem na cultura de perfusão para mais de uma semana. Demonstramos ainda mais a utilização do ensaio de resazurina perfusão – um barato, não-citotóxico, e avaliação metabólica não-invasiva anteriormente utilizado para citotoxicidade estuda 17 – para fornecer uma indicação da viabilidade das células e proliferação nos rins repovoados 7 ao longo do tempo.
O protocolo descrito descelularização produz consistentemente um ECM rim completamente acelular que serve como um modelo 3D para a cultura de células humanas epiteliais renais corticais tubulares (tanto proximais e distais derivada de túbulo), em adição a células endoteliais vasculares 7,17. A vasculatura renal canulada serve como o elemento-chave para a administração uniforme de reagentes e células de todo o andaime num biorreactor definir-se, permitindo assim que as perfusão decelularização, se…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Reagents | |||
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Equipment: | |||
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
*Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
Perfusion Circuit Components | |||
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
Other Components | |||
5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |