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Bioengineering

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

doi: 10.3791/53271 Published: August 10, 2015

ERRATUM NOTICE

Abstract

Este protocolo detalha a geração de acelular, ainda, renais matriz extracelular (ECM) andaimes biofuncionais que são úteis como pequenos substratos modelo para o desenvolvimento do tecido do órgão escala. Sprague Dawley rins de ratazana são canulados através da inserção de um cateter na artéria renal e perfundido com uma série de detergentes de baixa concentração (Triton X-100 e dodecil sulfato de sódio (SDS)) ao longo de 26 h para derivar intactas, andaimes todo-renais com intacta vasculatura perfusable, glomérulos e túbulos renais. Após a descelularização, o andaime renal é colocado dentro de um vaso de bioreactor de perfusão personalizados, e a artéria renal cateterizada está ligado a um circuito de perfusão que consiste em: uma bomba peristáltica; tubulação; e sondas de opcionais para pH, oxigênio dissolvido, e pressão. Após a esterilização do andaime com ácido peracético e etanol, e o equilíbrio do pH (7,4), o andaime de rim é preparado para propagação através de perfusão de meio de cultura dentro de um largincubadora e capacidade mantida a 37 ° C e 5% de CO 2. Quarenta milhões de células epiteliais tubulares corticais renais (RCTE) são injectados através da artéria renal, e rapidamente perfundido através do andaime sob alto fluxo (25 ml / min) e de pressão (~ 230 mmHg) durante 15 min antes de reduzir o fluxo a uma taxa fisiológica (4 ml / min). Células RCTE preencher primeiramente o nicho ECM tubular dentro do córtex renal, proliferam e formam estruturas epiteliais tubulares ao longo de sete dias de cultura de perfusão. Uma solução resazurina 44 uM em meio de cultura é perfundido através do rim durante 1 h durante as trocas de média para proporcionar uma avaliação fluorométrico, à base de redox metabólica de viabilidade e proliferação celular durante tubulogenesis. O bioreactor de perfusão do rim permite a amostragem não invasiva de meio de avaliação bioquímica, e várias portas de entrada de ar permite a semeadura alternativa retrógrado através da veia renal ou ureter. Estes protocolos podem ser usadas para recellularize andaimes nos rins com umvariedade de tipos de células, incluindo as células endoteliais vasculares, do epitélio tubular, e fibroblastos do estroma, para avaliação rápida dentro deste sistema.

Introduction

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À medida que o número de pacientes que sofrem de fase final de insuficiência renal continua a aumentar, há uma escassez grave e crescente do número de rins de doadores disponíveis para transplante. A incapacidade de atender a demanda de um número crescente de candidatos continuamente espera-listados para o transplante renal levou a investigação em engenharia órgão rim com o objetivo final de desenvolvimento personalizado, enxertos renais implantáveis ​​sob demanda 1,2. , Que funcionará tecido renal a partir de células do próprio paciente eliminaria a necessidade de imunossupressão ao longo da vida, diminuir a quantidade de tempo que os pacientes gastam em diálise à espera de um transplante de rim, e estender o transplante salva-vidas a mais pacientes com doença renal crônica.

O primeiro passo para a bioengenharia um tecido renal usando células derivadas de pacientes é o de desenvolver uma estrutura de suporte que serve como um substrato de suporte para o parênquima renal (por exemplo Epítetos tubularLiAl), fibroblastos do estroma, e o crescimento celular vascular. Andaimes biomaterial derivadas de matrizes extracelulares de órgãos naturais (ECM) têm várias características que os tornam desejáveis ​​para utilização em engenharia de tecidos, incluindo a sua composição biológica natural; macro e microestrutura adequada para dotar funções fisiológicas; e biocompatibilidade celular, promovendo a adesão celular, migração e tecido construtiva remodelação 3. Um método promissor para produzir scaffolds para regeneração de tecidos renal é através decellularization de alogênicos ou xenog�icas rins que preservar muito da composição proteína natural complexo do ECM rim 4, manter a complexidade arquitetônica inerente do órgão, e superar a dificuldade associada com bottom up engenharia de tecidos celularizados grossas, fornecendo um suprimento vascular para as células em desenvolvimento após andaime recelularização 5.

Perfusão descelularização é um processo emque detergentes, enzimas ou outras soluções de desregulação celulares são uniformemente distribuído através da rede vascular do órgão 6. Esta estratégia tem sido definida como um processo eficiente para derivar acelulares andaimes ECM baseada em órgãos como tridimensional (3D), modelos biológicos para engenharia de órgão inteiro de 6-8, como evidenciado pelo desenvolvimento de modelos renais acelulares de rins humanos descartados 9 e os rins xenog�icas obtidos a partir de grandes animais (por exemplo, 10 porco, cabra 11) e fontes de roedores 12. Em particular, a utilização de modelos animais, tais como roedores pequenos requer menos células e meios de cultura, o que é especialmente útil para estudos Recellularization órgão no qual os números de células são normalmente limitados, como é o caso com os tecidos derivadas de células estaminais. O objectivo do protocolo de descelularização é descrito para a produção de um ECM renal acelular que pode ser usado como um sistema de andaimes 3D para a regeneração do rim structures, incluindo os túbulos são repovoados nefrónios que no presente exemplo com epiteliais tubulares cortical renal humano (células RCTE). Nós anteriormente descrito a uma avaliação rigorosa de um protocolo óptimo detergente à base de rim de rato descelularização 7, que é mais rápida (aproximadamente um dia) do que os outros métodos relatados anteriormente (Ross et al .- 5 dias 12, Song et al .- 4,5 dias 13), e expõe o órgão a uma concentração consideravelmente mais baixa (0,1%) do sulfato de dodecilo de sódio desnaturante (SDS) durante a descelularização que relatórios anteriores 12-15.

Um número limitado de estudos têm descrito o uso de rins de roedores para decellularization e posterior utilização como um arcabouço 3D para repovoamento celular (revisto em outra parte 1) 12-16. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição detalhada de nosso previamente estabelecido, a estratégia decellularization ideal para a produção de andaimes renais acelulara partir de rins de ratos Sprague Dawley 7. Usando bioreactores de perfusão de design personalizado capazes de dupla semeadura e manutenção de perfusão cultura 17, nós recellularize os andaimes renais acelular com células RCTE humanos, que consistentemente repovoar o componente tubular nessas matrizes descelularizados, proliferam e sobrevivem na cultura de perfusão para mais de uma semana. Demonstramos ainda mais a utilização do ensaio de resazurina perfusão - um barato, não-citotóxico, e avaliação metabólica não-invasiva anteriormente utilizado para citotoxicidade estuda 17 - para fornecer uma indicação da viabilidade das células e proliferação nos rins repovoados 7 ao longo do tempo.

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Protocol

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DECLARAÇÃO DE ÉTICA: Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as directrizes aprovadas pelo cuidado e uso Comitê da Universidade Northwestern animal Institucional.

1. rim Decelularização

  1. Preparar soluções de decelularização. Preparar os seguintes volumes de reagentes para cada rim para ser descelularizados, e um volume adicional (por exemplo, durante 4 rins, preparar 5000 ml de Triton X-100 para o passo 1.1.3.):
    1. Prepare 500 ml de água de osmose inversa (ROH 2 O). Nota: Em alternativa, a água desionizada pode ser utilizado nos passos onde ROH 2 O está indicado.
    2. Prepare 1,000 mL de Triton X-100, 1% (v / v) em ROH 2 O. Adiciona-se lentamente 10 ml de Triton X-100-990 ml de água numa proveta grande sob agitação rápida numa placa de agitação. Permitir que o reagente para dissolver completamente antes do uso (pelo menos 10 min).
    3. Prepare 1,000 mL de Triton X-100, 1% (v / v) em ROH 2 O (sepvolume de arate).
    4. Prepare 1,000 ml de sulfato de dodecil de sódio (SDS), 0,1% (v / v) em ROH 2 O. Adiciona-se lentamente 5 ml de SDS (solução-mãe a 20%) para 995 ml de água num copo grande, sob agitação rápida numa placa de agitação. Permitir que o reagente para misturar uniformemente antes da utilização (pelo menos 10 min).
    5. Prepare 500 ml ROH 2 O (volume separado).
  2. Prepare rins para decelularização.
    1. Recuperar um rim de um rato macho Sprague Dawley (250-300 g) como anteriormente descrito 7.
      1. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg de peso corporal). Examinar frequentemente a profundidade da anestesia (a cada 10-15 min) através da monitorização da função respiratória, frequência cardíaca e resposta toe pitada durante a cirurgia. Se o animal tem uma elevada taxa de respiração ou reflexo positivo de pedal, administrar uma dose suplementar (com 1/3 a 1/4 da dose inicial) de pentobarbital.
      2. Executar uma abdomina linha média longitudinall incisão para expor os rins, na aorta abdominal e veia cava inferior.
      3. Injectar 2000 Unidades USP de heparina / kg de peso do corpo para dentro da veia peniana.
      4. Mobilizar ambos os rins por dissecção suave. Cuidadosamente separar o rim a partir da gordura perirenal, mantendo a cápsula renal em torno do rim intacto. Perfundir os rins com solução salina fria (10 ml) por meio de infra-renal da aorta abdominal.
    2. Inserir um cateter de calibre 24 na artéria renal, ligar firmemente o cateter para a artéria, e (usando uma seringa) perfundir suavemente o rim com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) para limpar completamente o órgão de sangue.
    3. Imergir renal em 25 ml de PBS numa placa de Petri e colocar num congelador a -20 ° C para congelar gradualmente o órgão (induzindo assim a lise das células) para o armazenamento até que a descelularização.
      Nota: se for desejado, o ureter e / ou da veia renal também pode ser canulada para a semeadura retrógrada, embora não descrito em THIs protocolo.
    4. Descongelar completamente o rim congelado (equilibriate à temperatura ambiente (RT)), e perfundir suavemente com 10 ml de PBS para verificar a artéria renal ligado a existência de fugas. Se forem observadas fugas ou resistência significativa, re-cateterização da artéria renal.
  3. Prepare equipamentos para a descelularização. Montagem do sistema de perfusão descelularização como representado na Figura 1B.
    1. Conecte um 8 "comprimento da tubulação bomba peristáltica (Figura 1D, f) a dois comprimentos suficientes (> 36" recomendados) de 1/16 "de diâmetro (ID) tubos de borracha de silicone interna (Figura 1D, h). Use dois do sexo masculino bloqueio Luer para 1/8 "adaptadores farpado unidas por uma fêmea Luer x adaptador Luer feminino para unir segmentos de tubulação (Figura 1D, j). Inserir um bloqueio adicional Luer macho para 1/8 "adaptador farpado (Figura 1D, c) para a extremidade a jusante da linha de perfusão para fixação à renalcateter de artéria.
    2. Conecte cada segmento de tubo bomba peristáltica para a cabeça da bomba 4-rolo usando um grande cartucho de bomba.
    3. Depois de colocar a extremidade de montante de tubo de borracha de silicone no primeiro reservatório para a solução (ROH 2 O), mantenha pressionado o botão "Prime" para totalmente injetar cada circuito de perfusão com a solução. CRÍTICO: verificar que não existem bolhas de permanecer retido na tubagem, e que a extremidade de montante (esquerda aberta para retirar fluido) do tubo de borracha de silicone é presa abaixo da interface ar-líquido do reservatório do reagente, tal como ilustrado na Figura 1B.
  4. Execute o protocolo decellularization na RT 7.
    1. Ligue o cateter da artéria renal de cada rim descongeladas para a extremidade do circuito de perfusão a jusante da bomba, garantindo que não há bolhas de ar são aprisionadas no cateter. Permitir que o rim para ser suspenso ao longo da parede interior de um vazio 5 L proveta (reservatório de recolha do perfusato, ver Figure 1B) de modo a que a artéria renal não é dobrada ou enrolada.
    2. Ajuste o acionamento da bomba a 5 ml / min, e pressione o botão "Iniciar". Confirmar que cada rim é de perfusão através da observação soluções gotejamento a partir da parte inferior do órgão.
    3. Perfundir cada rim com os seguintes reagentes, conforme descrito na Figura 1A
      1. Perfundir com 500 ml ROH 2 O a 5 ml / min durante 1 hr, 40 min.
      2. Perfundir com 1,000 mL de 1% de Triton X-100 a 5 ml / min, durante 3 h, 20 min.
      3. Perfundir com 1,000 mL de 1% de Triton X-100 a 1 ml / min durante 16 h, 40 min.
      4. Perfundir com 1000 ml de 0,1% de SDS a 5 ml / min, durante 3 h, 20 min.
      5. Perfundir com 500 ml ROH 2 O a 5 ml / min durante 1 hr, 40 min.
        Nota: Cada rim descelulada podem ser armazenadas em PBS (sem aditivos) num tubo de 50 ml a 4 ° C durante um período máximo de duas semanas antes da utilização.

2. PorAssembléia fusão biorreator, rim Esterilização e Preparação para Recellularization

  1. Prepare navios de biorreatores.
    1. Lave os reservatórios de biorreatores de vidro (componente do corpo) e cabeças de biorreatores com quente, soluções diluídas detergente (por exemplo. Solução detergente 1% em água da torneira) e enxaguar abundantemente com água corrente e, em seguida, ROH 2 O. Deixe os componentes para secar completamente.
    2. Aplicar um volume pequeno (~ 5 ml) de reagente de siliconização para a parte inferior de cada reservatório. Certifique-se que o reagente molha toda a superfície inferior por alguns segundos, em seguida, drenar o excesso de líquido.
    3. Permitir que os reservatórios para secar numa campânula de fumos à TA S / N. Alternativamente, os reservatórios podem ser secos num forno a 100 ° C durante 30 min para acelerar a secagem e melhorar a durabilidade do revestimento, que se destina a impedir a fixação de células para o fundo do reservatório de vidro biorreactor.
  2. Prepare os componentes do circuito de perfusão para a esterilização (Figura1D).
    1. Cortar os seguintes comprimentos de tubagem (para cada biorreactor):
      1. Corte dois comprimentos de 25 "16/01" tubo de borracha de silicone ID (Figura 1D, h).
      2. Cortar uma 8 "comprimento de tubo de bomba peristáltica (Figura 1D, f).
      3. Corte um 4,25 "comprimento de 1/16" ID tubos de borracha de silicone.
      4. Corte dois comprimentos de 1 "1/16 de paredes espessas" tubo de borracha de silicone ID (Figura 1D, g).
      5. Corte um 2 "comprimento de 1/4" ID x 0,5 cm de diâmetro (OD) tubo de borracha de silicone externa (Figura 1D, e).
    2. Prepare os seguintes adaptadores Luer (para cada biorreator):
      1. Prepare 10 do sexo masculino bloqueio Luer para 1/8 'adaptadores farpado (Figura 1D, c)
      2. Prepare dois plugues macho Luer (Figura 1D, a)
      3. Prepare dois tampões Luer fêmea (Figura 1D, b)
      4. Prepare 5 fêmea Luerx adaptadores Luer fêmea (x5; Figura 1D, d)
    3. Lave todos os adaptadores de tubos e Luer com quente, soluções diluídas detergente, enxaguar em água da torneira e, em seguida, ROH 2 O, e deixe-os secar.
  3. Montar circuitos de perfusão.
    1. Deslizamento 1 "comprimento de 1/16" ID tubos de borracha de silicone de paredes espessas sobre entrada aceitante Luer ligado à cabeça do biorreator. Coloque macho Luer lock para 1/8 "adaptador farpa ID em extremidade aberta do tubo. Repita para o outro receptor Luer de entrada e conectar uma tampa Luer fêmea para vedar portas (destinado a ureteral ou venosas técnicas de semeadura não descritos neste protocolo).
    2. Conecte cada 25 "segmento de 1/16" ID tubos de borracha de silicone para o "segmento de tubulação da bomba peristáltica usando o bloqueio Luer macho para 8 1/8 'farpa ID e feminino Luer x fêmea adaptadores Luer (Figura 1D, j).
    3. Conecte uma extremidade aberta de silicone de borracha Tubing para o perfusato meios de saída do lado de fora da cabeça biorreactor. Ligue o "comprimento de 1/16" tubulação de ID para o lado oposto (interior) da saída do perfusato meios de 4,25 no interior da cabeça do biorreactor.
    4. Conecte um bloqueio Luer macho para 1/8 "adaptador farpado ID para a extremidade aberta remanescente da tubagem do circuito de perfusão. Conecte um Luer fêmea x adaptador Luer do sexo feminino para o bloqueio Luer macho. Conecte o Luer fêmea x adaptador Luer fêmea ao macho Luer aberta bloqueio levando à entrada Luer aceitante no biorreator. Isso servirá como a mídia perfusato entrada que conduz diretamente na artéria renal cateterizada.
    5. Certifique-se de que não há portas na tampa biorreator são deixadas em aberto ou exposto. Firmemente fechar a válvula de vácuo no corpo biorreactor.
    6. Montar o biorreactor cabeça sobre o corpo do reservatório, com um O-ring ensanduichada entre as ranhuras idênticas que revestem cada um dos componentes. Coloque um grampo metálico sobre a interface para manter os dois componentes em conjunto.
    7. Montar a porta de ventilação na cabeça biorreator com um filtro de ventilação de 0,2 mícron, conectando os dois componentes usando um "comprimento de 1/4" ID x 0,5 "OD tubo de borracha de silicone (Figura 1D, e) 2. Abra a válvula de ventilação.
    8. Solte ligeiramente a tampa de rosca vermelha na cabeça biorreator.
    9. Coloque os restantes adaptadores Luer e 6 "serrilhados espécime fórceps em uma bolsa de autoclave e selo.
  4. Autoclave os biorreatores montado e ficha Luer macho.
  5. Prepare os seguintes reagentes para a esterilização de andaime e perfusão médio antes da semeadura (volumes são listados por rim decelularizado):
    1. Dentro de uma hotte, preparar um ácido peracético de 50 ml de 0,1%, solução de 4% de etanol por adição de 2,56 ml de solução de ácido peracético (39% de concentração de estoque) e 40 ml de etanol prova 200 para ~ 957 mL ROH 2 O em um frasco de 1 L. Misture bem, invertendo repetidamente garrafa e coloque em cabine de segurança biológica.
    2. Prepararde 150 ml de PBS 1x solução, pré-esterilizado por autoclavagem.
    3. Preparar 50 ml de meio DMEM / F12 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
  6. Recolha os itens restantes para a montagem de perfusão biorreator. Coloque todos os itens em uma cabine de segurança biológica. CRÍTICA: Certifique-se de que o gabinete de segurança biológica está equipado com tomadas eléctricas trabalhando para energizar o acionamento da bomba digital. Como alternativa, use um cabo de extensão para ligar a unidade de bomba a tomadas eléctricas externas fora do gabinete.
    1. Recolha rins decelularizados.
    2. Recolha biorreatores autoclavada com circuitos de perfusão em anexo.
    3. Recolha bolsa autoclavada contendo adaptadores e pinças Luer.
    4. Recolha de acionamento da bomba digital com anexado cabeça 4 roletes, e grandes cartuchos de bomba (1 por circuito de perfusão).
  7. Completar o circuito de perfusão, como descrito na Figura 1C estéril c sobs condições dentro de uma cabine de segurança biológica.
    1. Conecte uma torneira de 3 vias (Figura 1D, i) entre o sexo masculino bloqueio Luer a 1/8 "adaptador farpa ID perto da entrada perfusato mídia e feminino adaptador Luer do Luer fêmea x. Deixar todas as três portas na torneira aberta.
    2. Remover a tampa de rosca vermelho na cabeça biorreactor e pipeta 50 ml de ácido peracético a 0,1%, solução de etanol a 4% para o reservatório através da abertura médio.
    3. Conecte o segmento de tubulação da bomba peristáltica para a cabeça da bomba usando um grande cartucho de bomba. Ajustar a taxa de fluxo de 5 ml / min, pressione "Start", e permitir que o circuito de prime.
      1. Quando o líquido enche a linha de perfusão e atinge a porta aberta remanescente da torneira de três vias, ligar a porta usando uma ficha macho Luer (Figura 1D, a).
      2. Permitir que o circuito de totalmente nobre até que nenhum ar é observada no tubo do circuito de perfusão ou no interior da entrada de Luer aceitador. Se necessry, aumentar a taxa de fluxo temporariamente para expelir as bolhas a partir da linha de perfusão. Quando completamente ferrado parar o acionamento da bomba.
    4. Encaixe cuidadosamente a extremidade Luer fêmea do cateter da artéria renal no aceitador de Luer macho de entrada na superfície interna da cabeça bioreactor utilizando as pinças esterilizadas 6 ". Verifique se a conexão está apertado e que nem o ar é deixado no cateter. Permitir que o rim para pendurar suavemente do cateter da artéria renal, de modo a que a artéria renal não se deforma nem torção.
    5. Aperte a braçadeira metálica segurando junto a cabeça biorreator e corpo de modo que o reservatório biorreator é hermeticamente fechado. Feche a tampa de rosca vermelha na cabeça biorreator.
  8. Esterilizar rins à TA por perfusão com 0,1% peracético, uma solução de etanol a 4% a 5 ml / min durante 1 hora, em seguida, três perfusões sequenciais de 1 h à temperatura ambiente com 50 ml de PBS, a 5 ml / min.
    1. Mudando soluções:
      1. Após 1 hora, parar a bomba e abrir tampa de rosca vermelha. Usando um sterile (autoclavada) pipetas de Pasteur, aspirar cuidadosamente toda a solução a partir do reservatório biorreactor. Deixar o circuito de perfusão completamente ferrado.
      2. Pipetar 50 ml de solução fresca para dentro do reservatório biorreator, feche a tampa de rosca, e ligar a bomba.
  9. Após a lavagem final, PBS, PBS aspirado a partir do reservatório e pipeta em 50 ml de meio DMEM / F12 suplementado com 10% FBS e 1% de Pen-Strep. Fechar a tampa de rosca, e transferir o bioreactor de perfusão com o circuito ligado a uma incubadora de grande capacidade, mantidos a 37 ° C e 5% de CO 2.
  10. Se necessário, transferir o acionamento da bomba para a incubadora. Ligar o circuito de bioreactor de perfusão para a bomba, e perfundir os rins a 4 ml / min durante pelo menos 1 hora antes da sementeira.

3. rim Recellularization com Renal Cortical Tubular células epiteliais

  1. Volumes suficientes quentes de DMEM / F12 (suplementado com 10% FBS e 1% de Pen-Strep) e cell dissociação enzima para elevação de células a 37 ° C. Volumes sugeridos estão listados abaixo:
    1. Prepare 10 ml de células dissociação enzima e 10 ml de DMEM / F12 por 175 centímetros 2 garrafa de cultura para o levantamento.
    2. Prepare 5-10 ml de DMEM / F12 por rim para ser semeada.
  2. Colete um número suficiente de frascos de cultura para a concentração desejada de semeadura (4 x 10 7 células imortalizadas RCTE humanos 18 por resultados nos rins em enxerto máxima de células RCTE utilizando esta estratégia de semeadura).
  3. Células de elevação dos frascos usando enzima de dissociação celular. Aspirar médio da garrafa, em seguida, pipetar 10 ml de células dissociação enzima em balão. Colocar o balão em 37 ° C incubadora para agilizar dissociação.
  4. Verificar balão em um microscópio de contraste de fase a cada 2 min, até que a dissociação completa de células de superfície balão é observada. Nota: O período de incubação variará, dependendo do nível de confluência das células, mas as células RCTE vai rEquire cerca de 15 minutos para dissociar completamente.
  5. Retirar uma amostra de suspensão de células dissociadas para a contagem antes da granulação. Dilui-se a suspensão de células com um volume igual de meio DMEM / F12 pré-aquecido, e centrifugar a 232 xg, a força centrífuga relativa (RCF) durante 5 min.
  6. Contar as células durante a centrifugação. Dilui-se a amostra obtida com um volume igual de azul de tripano, e pipeta 10 ul em cada extremidade de um hemacitómetro para contagem. Calcular o volume necessário de diluição sedimento para obter a concentração desejada de semeadura (2 x 10 7 células / ml).
  7. Após centrifugação, o sedimento de diluir com um volume apropriado de meio de cultura para obter uma concentração final de 2 x 10 7 células / ml. Retirar 2 ml da suspensão de sementeira numa seringa de 5 ml estéril.
  8. Transferir o biorreator de perfusão a uma cabine de segurança biológica. Gire a válvula de bloqueio para fechar o fluxo para a porta de semeadura. Remova o plugue de deslizamento de Luer machoa torneira, e conecte a seringa carregada com a suspensão de semeadura.
  9. Transferir rapidamente o circuito de perfusão de volta à incubadora, e usar o cartucho de grande bomba para proteger o segmento de tubulação da bomba peristáltica para a cabeça da bomba.
  10. Semeadura de células: Feche a porta da válvula torneira apontando na direção da bomba. Injecte lentamente a suspensão de células no rim, assegurando que toda a suspensão é transferida a partir da seringa para dentro da linha de torneira e perfusão. Coloque a válvula de torneira para fechar o fluxo a partir da seringa, e ligar a bomba a 25 mL / min durante 15 min.
  11. Após 15 min, reduzir a taxa de fluxo da bomba de 4 ml / min. Meio de troca (volume de 100 ml para as alterações subsequentes) no dia seguinte e, posteriormente, de dois em dois dias.

4. avaliação da viabilidade e proliferação celular usando Resazurina Perfusão Assay

  1. Preparar o reagente resazurina. Dissolve-se 110,5 mg de sal de sódio de resazurina em 100 ml de PBS, com agitação, e diluir 1:10, adicionando 5 ml dosolução resultante a 45 ml de PBS fresco para criar uma solução de estoque de resazurina 440 uM. Filtro-esterilizar (utilizando um filtro de seringa de 0,2 um), e armazenar a solução estoque em um tubo de 50 ml protegida da luz a 4 ° C.
  2. Prepare controles de mídia com suplemento de resazurina. Prepara-se uma solução a 10% de reagente de resazurina em meio de cultura (por ex. 5 ml de solução stock de resazurina + 45 mL de meio de cultura) para criar resazurina solução de trabalho. Autoclave um volume de 10 ml da solução de trabalho de resazurina num recipiente protegido da luz. Nota: Isto irá reduzir completamente o composto de resazurina a resorufina, e vai servir como um controlo positivo para calcular a percentagem de redução da resazurina.
  3. Alíquota de 1 ml cada de solução de trabalho resazurina (oxidado), autoclavado resazurina solução (reduzida), e meio de cultura trabalhando sozinho (em branco) em tubos de 1,5 ml de recolha selectiva. Colocar os tubos abertos no mesmo incubador como os bioreactores de perfusão.
  4. Transferir a perfusão do rimcircuito da incubadora para uma cabine de segurança biológica. Retire a tampa de rosca da cabeça biorreator, e meio de cultura aspirado do reservatório biorreator utilizando uma pipeta Pasteur.
  5. Pipeta de 10 ml de solução resazurina em reservatório, tampa de rosca próximo trabalho, e transferir circuito de perfusão do rim de volta para a incubadora.
  6. Iniciar a bomba a 4 ml / min e permitir que o reagente para perfundir através dos rins durante exactamente 1 h.
  7. Após 1 hora, parar a bomba, e transferir circuito de perfusão renal para a cabine de segurança biológica.
  8. Recolher a solução resazurina condicionado (parcialmente reduzido), e adiciona-se 100 ml de meio de cultura para o bioreactor de reservatório. Circuito de perfusão Transferência para incubadora, e retomar o fluxo (4 ml / min).
  9. Pipetar 100 l (x 3 repetições) condicionado resazurina solução, resazurina solução de trabalho, autoclavado a solução de trabalho, e meios de cultura em branco numa preto (opaco) placa de 96 poços de ensaio. Leia a intensidade de fluorescência (excitatião: 540/35; emissão: 590/20), utilizando um espectrofotômetro.
  10. Calcular redução percentual como uma razão de intensidades de fluorescência normalizados pela intensidade da fluorescência (FI) gerados por resazurina a forma oxidada (ORM, ou resazurina solução de trabalho não expostos a células) ou a forma reduzida resazurina (MRR, ou autoclavada solução de trabalho):% de redução = 100 x {[FI (solução resazurina condicionado) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. Para normalizar os resultados, a redução multiplicar% por volume circulante (10 ml) e divide-se por tempo de incubação (1 h).

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Representative Results

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Rins sequencialmente com água e dilui-se soluções de detergente (1% de Triton X-100, 0,1% de SDS) de acordo com um protocolo de descelularização óptimo previamente estabelecido (ver Figura 1A, B) 7, tornam-se progressivamente mais transparente ao longo de um período de 26 horas, conforme mostrado na Figura 2A. O andaime rim acelular resultante é desprovida de células e retém uma ECM renal coesa suportado por uma cápsula renal intacta, que não está danificado seguindo o protocolo de perfusão. Pelo perfusão detergente final (SDS), a rede vascular do rim, e em particular os vasos interlobares, são afixados no andaime descelularizado, devido à maior espessura destes vasos sanguíneos em relação à membrana basal comparativamente fina dos túbulos de nefrónios ( ver figura 2A, B). O órgão inteiro é limpo de células nativas, deixando para trás a rede membrana basal intacta de glomérulos, túbulos e collecting condutas, e a ECM de vasos sanguíneos descelularizados, incluindo lâmina elástica interna e externa das artérias interlobulares corticais (ver figura 2B, C). Além dos vasos maiores, as membranas basais dentro microvascular glomérulos também manter a integridade estrutural (ver figura 2B, C).

Rins descelularizados são armazenadas em PBS a 4 ° C para limitar a degradação hidrolítica natural da ECM renal, e deve ser usada dentro de 2 semanas de descelularização. Temos anteriormente descrito em pormenor a concepção de um bioreactor de perfusão personalizado baseado no rim, que é usado tanto para semeadura descelularizados andaimes nos rins de roedores, e a cultura a longo prazo dos órgãos repovoados sob fluxo 17. Para recelularização, um circuito de perfusão composto de borracha de silicone de pequeno diâmetro e uma bomba de tubo Pharmed resistentes à fadiga é utilizado meio de cultura de rota a partir do reservatório biorreactor, de uma bomba peristáltica, ede volta para a entrada do Luer aceitador ao qual a artéria renal cateterizada está ligado na face interior da cabeça do biorreactor (ver Figura 1C). Após a esterilização do rim descelularizado por perfusão com uma mistura de ácido / etanol peracético, o sistema de perfusão é preparada para semeadura por meio de cultura padrão (contendo FBS a 10% para melhorar a adesão célula-ECM), através do andaime no interior da incubadora circulante.

Os rins decelularizados podem agora servir como modelos ECM acelular para recelularização, que já anteriormente realizados usando células induzidas derivadas de células-tronco pluripotentes endoteliais para revascularização 7. Aqui, nós demonstrar a utilidade deste sistema biorreator andaime e perfusão para tubulogenesis usando epiteliais tubular células (RCTE) corticais renais de origem humana. RCTE células são semeadas em andaimes nos rins, através da artéria renal sob um protocolo de perfusão de alta pressão que tem sido descrito anteriormente 7, 17 .RCTE células infundidas neste casa forma principalmente para as regiões corticais do rim, onde preferencialmente repovoar os túbulos periglomerulares (ver Figura 3A). Poucas células incorporar dentro de glomérulos no dia 1 pós-semeadura, e de dia 7, glomérulos são praticamente desprovidos de células. Durante a cultura de perfusão, o meio é trocado a cada 2 dias, altura em que o ensaio de perfusão resazurina é simultaneamente realizados para fornecer avaliações comparativas de viabilidade das células ao longo do tempo (ver Figura 3B). Como apoiada pelos resultados de redução da resazurina, as células proliferam RCTE dentro do ECM 3D, formando muito bem organizados, estruturas tubulares de patentes por dia 7. Enquanto a maioria dessas células ocupar as regiões corticais do ECM renal, após 7 dias de cultura antegrade perfusão muitos túbulos forrado de RCTE estão presentes na medula exterior e túbulos papilares e dutos coletores (ver Figura 4). Depois de repovoamento com células RCTE e uma semana de percultura de fusão, a transparência observados após a descelularização é perdida, e o rim parece repovoados opaco e mais perto em aparência ao seu estado nativo (ver Figura 4).

Figura 1
Figura 1:. Kidney Decelularização Sistema e Protocolo e Recellularization Perfusão Circuit (A) Perfusão cronograma de reagentes para a descelularização de rins de roedores. Os reagentes utilizados para a descelularização, a taxa de fluxo volumétrico, e duração de cada passo são mostrados. (B) Perfusão decellularization set-up. As soluções são bombeados de modo unidireccional a partir de um reservatório de reagente a um recipiente de recolha de perfusado através de linhas de fluxo individuais para cada rim submetidos a descelularização. Até quatro rins podem ser descelularizados por bomba peristáltica. Circuito (C) Perfusão for semeadura e cultura de andaimes renais repovoados. As células são carregadas através de uma seringa ligada directamente a montante da entrada aceitador de Luer. Opcional sensores em linha para monitorização da pressão, o oxigénio dissolvido (DO 2), e o pH pode ser colocado a montante do biorreactor. A bomba peristáltica digital pode ser controlado por computador, e a pressão negativa (vácuo parcial) pode ser aplicada para auxiliar ureteral semeadura. (D) Os componentes usados ​​para criar linhas de perfusão durante descelularização (B) e recelularização (C). (A) encaixe Luer macho, (b) tampão de Luer fêmea, (c) fecho Luer macho para 1/8 "adaptador farpado, (d) Luer fêmea ao adaptador Luer fêmea, (e) de ¼" tubulação de ID de silicone, (f) tubo de bomba peristáltica, g: de espessura de parede de 1/16 "ID do tubo de borracha de silicone, (h) 1/16" ID do tubo de borracha de silicone, (i) a torneira de três vias, (J) de acoplamento utilizado para ligar segmentos de tubos através da combinação dois 1/8 "farpa para adaptadores Luer macho (c) utilizando umLuer fêmea para fêmea acoplador Luer (d). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Os resultados representativos de rim Decelularização bruta Representante e imagens microscópicas são mostrados de rins antes e seguintes descelularização. (A) Tempo série lapso de um decellularization renal submetidos. As imagens são mostradas imediatamente após a perfusão com cada reagente especificado. Após a perfusão de 0,1% de SDS (dodecilsulfato de sódio), rede vascular preservada é visível. (B) Imagens representativas de rins nativos ou descelularizados seccionado e corado com hematoxilina e eosina (H & E). A arquitetura ECM dos aspectos microestruturais, incluindo glomérulos, coleta dutos, E vasos sanguíneos, é bem preservado seguinte descelularização. Micrografias (C) Eletrônica de Varredura comparando glomérulos e túbulos em nativa (linha superior) e descelularizados (linha inferior) rins. Após a remoção de células, túbulos abertos são prevalentes em todo o rim. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Os resultados representativos de corticais renais humanas epiteliais tubulares Recellularization descelularizado de rato Os rins rins são repovoados através de uma técnica de perfusão anterógrada arterial de alta pressão que resulta em RCTE adesão celular primariamente para os túbulos renais do córtex. (A) representativos imagens de alta ampliação (20x) de hematoxilina e histolo manchado-eosinagicos seções de andaimes repovoados 1, 3 ou 7 dias após a semeadura. Top de linha mostra que as células ocupam o espaço tubular periglomerular apesar de ser injetado através da vasculatura arterial, indicando a sua preferência pelo primeiro nicho ECM renal. Arrowhead pontos amarelos para uma arteríola aferente com um lúmen que é desprovido de células. Lower linha mostra túbulos corticais onde as células proliferam RCTE, com o aumento da densidade celular ao longo de uma semana, e formam estruturas epiteliais tubulares hermeticamente embalados. (B) Um pequeno (10 ml) volume do meio de cultura suplementado com resazurina é recirculada através dos rins, no momento de mudanças de meio. Durante 60 min de perfusão, as células reduzir o composto oxidado resazurina (azul) a resorufina (vermelho), que produz um sinal altamente fluorescente em proporção ao número de células no rim. Consistente com o aumento observado na densidade celular observada nas imagens histológicas, aumenta por cento de redução de mais de resazurina cultura time com o crescimento da célula, proporcionando uma indicação não-invasivo de ambos viabilidade e a proliferação das células durante a cultura de manutenção. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 4 rins repovoados). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
. Figura 4: Resultados representativos: Comparação da Native, descelularizado, e repovoados Rins baixa ampliação imagens histológicas mostram o córtex renal, zona de transição entre as regiões da papila medulares córtex e medula externa, e em rins nativos (topo de linha), descelularizados (Decell; linha do meio), e 7 dias repovoados-RCTE (7 Day ReCell; linha inferior) andaimes. A linha a tracejado indica a fronteira aproximada entre o córtex renal (C) e da medula externa (H). Imagens brutas mostrar um rim em seu estado nativo após a recolha, seguindo descelularização, e 7 dias seguintes semeadura de células RCTE através da artéria renal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O protocolo descrito descelularização produz consistentemente um ECM rim completamente acelular que serve como um modelo 3D para a cultura de células humanas epiteliais renais corticais tubulares (tanto proximais e distais derivada de túbulo), em adição a células endoteliais vasculares 7,17. A vasculatura renal canulada serve como o elemento-chave para a administração uniforme de reagentes e células de todo o andaime num biorreactor definir-se, permitindo assim que as perfusão decelularização, sementeira de células, cultura de perfusão a longo prazo, e a resazurina protocolos de perfusão. Como tal canulação, adequada da artéria renal, antes de perfusão de órgãos é crítica, e deve ser tomado um cuidado especial para assegurar que a artéria renal não é obstruído ou danificado, e que o cateter é fixado. Os ratos Sprague Dawley de que os rins são recuperados devem ser sistemicamente heparinizado para evitar a coagulação na vasculatura durante colheita de órgãos, como coágulos intravasculares não pode be removido, e podem inibir a descelularização completa do rim.

O biorreator de perfusão usada para propagação e perfusão cultura de rins repovoados é projetado para permitir que vários métodos de semeadura in situ 17. Em adição à técnica de injecção arterial descrito aqui, as células podem ser injectadas retrógrada através do ureter ou da veia renal cateterizada. Além disso, o corpo é biorreactor equipado com uma válvula que permite a aplicação de pressão negativa (vácuo parcial; ver Figura 1C), para semeadura ureteral. Independentemente da estratégia utilizada semeadura, a perfusão de meio de cultura anterógrada através da artéria renal é crítica para nutriente adequado (por exemplo, oxigénio, a glicose) entrega a células semeadas.

O protocolo recelularização descrito demonstra a nossa utilização de matrizes renais descelularizados para servir como modelos especificamente para tubulogenesis epitelial. No entanto, temos anteriormente shprópria renais que a matriz também suporta a re-endotelização da rede vascular retida e pode ser revestida com células endoteliais estaminais pluripotentes derivadas de células humanas induzida, o que é uma observação importante para a eventual transplante a longo prazo dos rins repovoados em modelos animais, impedindo trombótica oclusão da vasculatura renal 7. Um obstáculo atual para o eventual aumento de escala de protocolos Recellularization renais para andaimes renais grande de animais é a substancialmente maior número de células necessárias para repovoar andaimes de rim humano porte. Estratégias eficientes de sementeira, tais como a técnica de injecção de alta pressão arterial, descritos acima, são extremamente necessárias para maximizar o número de células que enxertar dentro do ECM descelularizado. Dada a composição celular heterogênea do rim nativo, vários métodos de semeadura pode vir a ser obrigado a preencher novamente de forma eficaz os vários nichos renais extracelulares com diversos tipos de células que COLLECtivamente realizar as várias funções do rim, incluindo filtração, reabsorção, a concentração de urina, e síntese da hormona.

Finalmente, o ensaio de resazurina perfusão demonstrado neste artigo fornece uma avaliação não-invasiva, não-tóxica de viabilidade e a proliferação das células durante a cultura a longo prazo 7,17,18. O ensaio fornece feedback instantâneo sobre o estado metabólico de células em crescimento dentro de andaimes nos rins, e quando realizados regularmente em intercâmbios entre médias periódicos, pode ser utilizado para caracterizar a proliferação de células ao longo do tempo. O reagente de resazurina é barato, o ensaio requer pouco tempo para executar (1 hr), e é um método analítico mais conservadora para caracterizar a proliferação celular ou tendências metabólicos, em comparação com a avaliação histológica, o que requer o sacrifício terminal do andaime repovoados. O ensaio de resazurina perfusão também pode ser adaptado para a avaliação das populações de células durante o crescimento dentro de outro receórgãos ou tecidos llularized.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO VWR M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O Sigma-Aldrich 05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) Sigma-Aldrich 77240 Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol VWR V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces Sigma-Aldrich SL2 For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media Life Technologies 11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech Corning 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Corning 30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red Life Technologies 12605-028 Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Resazurin sodium salt Sigma-Aldrich R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC Cole-Parmer EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. Cole-Parmer EW-07519-70 Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. Cole-Parmer EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated VWR 82027-438
*Kidney perfusion bioreactor WilMad Labglass *Custom designs Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) BD Biosciences 381412 Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' Cole-Parmer HV-06508-14 Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack Cole-Parmer HV-06411-62 Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. Cole-Parmer HV-96410-14 Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD VWR 89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences VWR 28143-558 Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk Cole-Parmer T-45505-11 Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-22 Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs Careforde Healthcare 10254821 Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. BD Biosciences 309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish BD Biosciences 353001 Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 03/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal
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Cite this Article

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).More

Uzarski, J. S., Su, J., Xie, Y., Zhang, Z. J., Ward, H. H., Wandinger-Ness, A., Miller, W. M., Wertheim, J. A. Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development. J. Vis. Exp. (102), e53271, doi:10.3791/53271 (2015).

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