Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Upprepad blodinsamling är en av de vanligaste teknikerna som utförs på försöksdjur. Emellertid har en icke-dödlig protokoll för blodinsamling från zebrafisk inte fastställts. De tidigare metoder för blodinsamling från zebrafisk är dödliga, såsom lateral snitt, halshuggning och svans ablation. Därmed har vi utvecklat en ny "upprepade" bloduppsamlingsmetod och närvarande här ett detaljerat protokoll som beskriver denna procedur. Denna metod är minimalt invasiva och resulterar i en mycket låg dödlighet (2,3%) för zebrafisk, vilket möjliggör upprepad provtagning av blod från samma individ. Den maximala volymen av blodprovtagnings är beroende av kroppsvikten hos fisken. Volymen för upprepad blodprov med jämna mellanrum bör vara ≤0.4% av kroppsvikten varje vecka eller ≤1% var 2 veckor, vilket bedömdes genom mätning av blodhemoglobin. Dessutom, hemoglobin, fasteblodglukos, plasma triacylglycerol (TG) och totalt cholesterol nivåer i manliga och kvinnliga vuxna zebrafisk mättes. Vi ansökte även denna metod för att undersöka dysreglering av glukosmetabolismen i dietinducerad övervikt. Detta blod insamlingsmetod gör det möjligt för många tillämpningar, inklusive glukos och lipidmetabolism och hematologiska undersökningar, vilket kommer att öka användningen av zebrafisk som en mänsklig sjukdom modellorganism.
Zebrafisk får allt större popularitet som en värdefull modell för mänskliga sjukdomar eftersom deras organ och genetik liknar dem hos människor 1,2. När det gäller utvecklingsbiologi, har många studier visat att zebrafisk och mänsklig show märkt likhet i hematopoies 3, hemostas 4,5 och myelopoes 6. Vuxna zebrafisk används också för att studera immunologiska 7, neurodegenerativa 8 och fetmarelaterade sjukdomar 9 eftersom denna modell organism delar densamma som vid de störs i mänskliga sjukdomar. För fetma och fetmarelaterade sjukdomar (diabetes, leversteatos och nonalcoholic steatohepatitis och ateroskleros), zebrafisk blodsocker och lipider nivåer har undersökts grundligt i flera transgena och kost inducerad fetma modeller 10-13.
Upprepad blodprov från enskilda djur kommer att minska användningen djur och decemberrease skillnader mellan individer. Men är tekniskt svårt i små djur såsom zebrafisk upprepade provsamling på grund av deras relativt liten blodvolym och bristen på lättillgängliga fartyg. Flera metoder för en-gång bloduppsamlings från zebrafisk har utvecklats, även om dessa metoder har sina egna nackdelar, inklusive letalitet, tillhörande vävnadsskada och begränsad volym blod. Till exempel kan 1 till 5 | il blod skördas från en lateralt snitt av approximativt 0,3 cm i längd i området för det dorsala aortan 5. Halshuggning med en sax genom att skära genom skuldergördel kan samla 5-10 il blod 10. En annan lämplig blodprovtagningsmetod är svans ablation 14. Hjärtpunktur är ett potentiellt alternativ metod för upprepad uppsamling av blod från samma fisk, men mycket små belopp som erhålls (ca 50 nl) med detta förfarande begränsar antalet analyser som kan vara utför litenMed 11. Följaktligen behövs ett nytt protokoll för att möjliggöra upprepad icke-dödande blodprovstagning, vilket skulle vara en avgörande framsteg som krävs för denna organism vara en standardmodellorganism för mänskliga sjukdomar. Denna teknik skulle möjliggöra att testa farmakologiska svar, upptäckt av molekylära markörer för diagnos, bestämning av prognos samt övervakning av olika sjukdomar, såsom metaboliska sjukdomar, degenerativa sjukdomar och flera typer av maligniteter.
Vi utvecklade därför en minimalinvasiv metod för att erhålla blod från zebrafisk serie 15. Här kan vi visa förfarandet visuellt och ger ett detaljerat protokoll för denna teknik. Med den här metoden, var normalvärdet baseras på olika parametrar, inklusive hemoglobin, fasteblodglukos och lipider i blodet hos friska vuxna zebrafisk utvärderas. Dessutom utvärderade vi även om denna metod är lämplig för studier som kräver seriella prover från mÖVERVAKNING de temporala förändringar i blodglukosnivåer under övergödning experiment.
Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för seriellt erhålla blod från vuxna zebrafisk. Denna metod är enkel att utföra och vi använder den i labb på daglig basis. Denna bloduppsamlings metod är baserad på att föra in en glaskapillär nål i zebrafisk s dorsala aortan. Under denna procedur, är det viktigt att vara noga med att inte avlägsna ryggraden eftersom det är kriteriet för att söka efter rygg aorta. Minska ryggraden skadan kommer att förbättra överlevnaden. Även om denna teknik är enkel o…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |