Herhaalde bloedafname voor Blood Tests in Adult zebravis
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Herhaalde bloedafname is een van de meest gebruikte technieken uitgevoerd op laboratoriumdieren. Echter, een niet-dodelijke protocol voor bloedafname uit zebravis niet vastgesteld. De vorige methoden voor bloedafname uit zebravis zijn dodelijk, zoals laterale incisie, onthoofding en de staart ablatie. Zo hebben we een nieuwe "herhaalde" bloedafname methode een gedetailleerd protocol waarin deze procedure ontwikkeld, en hier aanwezig. Deze methode is minimaal invasief en resulteert in een zeer lage mortaliteit (2,3%) voor zebravis, waardoor herhaalde bloedmonsters van hetzelfde individu. Het maximale volume bloedafname is afhankelijk van het lichaamsgewicht van de vis. Het volume voor herhaalde bloedafname tussenpozen moet ≤0.4% lichaamsgewicht per week of ≤1% per 2 weken, die werden geëvalueerd door meting van hemoglobine zijn. Bovendien, hemoglobine, nuchtere bloedglucose, plasma triacylglycerol (TG) en totaal cholesterol niveaus in mannelijke en vrouwelijke volwassen zebravissen werden gemeten. We pasten deze methode ook de ontregeling van het glucosemetabolisme in dieet-geïnduceerde obesitas onderzoeken. Deze bloedafname methode vele toepassingen, waaronder glucose en lipidemetabolisme en hematologische onderzoeken, die het gebruik van zebravis zal toenemen menselijke ziekte modelorganisme toestaan.
Introduction
Zebravis winnen steeds populairder als een waardevol model van menselijke ziekten vanwege hun organen en genetica zijn vergelijkbaar met die van mensen 1,2. Op het gebied van de ontwikkelingsbiologie, hebben vele studies aangetoond dat de zebravis en de mens vertonen gemarkeerd gelijkenis in hematopoiesis 3, hemostase 4,5 en myelopoiese 6. Volwassen zebravissen worden ook gebruikt voor het bestuderen immunologische 7, neurodegeneratieve 8 en obesitas gerelateerde ziekten 9 omdat modelorganisme kent gemeenschappelijke pathways met die verstoord menselijke ziekten. Voor overgewicht en obesitas gerelateerde ziekten (diabetes, leververvetting en niet-alcoholische steatohepatitis en atherosclerose), zebravis bloedglucose en lipiden niveaus grondig zijn onderzocht in verschillende transgene en dieet-geïnduceerde zwaarlijvigheid modellen 10-13.
Herhaalde bloed bemonstering van individuele dieren zullen gebruik en december dier te verminderenrease interindividuele verschillen. Echter, herhaalde monstername in kleine dieren zoals zebravis technisch moeilijk vanwege hun relatief kleine bloedvolume en het gebrek aan gemakkelijk toegankelijke vaartuigen. Verschillende werkwijzen voor eenmalige bloedafname van zebravis ontwikkeld, alhoewel deze methoden hebben hun eigen nadelen, zoals dodelijkheid, geassocieerde weefselbeschadiging en beperkte bloedvolume. Zo kan 1-5 gl bloed worden geoogst uit een laterale incisie van ongeveer 0,3 cm in lengte in het gebied van de dorsale aorta 5. Onthoofding met een schaar door te snijden door de schoudergordel kan 5-10 ul bloed 10 te verzamelen. Een andere handige bloedafname methode is staart ablatie 14. Hartpunctie is één potentiële alternatieve methode voor herhaalde bloedafname van dezelfde vis, maar de zeer kleine hoeveelheid verkregen (ongeveer 50 nl) met deze procedure beperkt het aantal analyses die kan worden uitvoemed 11. Dienovereenkomstig is een nieuw protocol nodig om herhaaldelijk niet-dodelijke bloedmonsters, die een kritische vooruitgang nodig zou zijn voor dit organisme een standaard modelorganisme voor menselijke ziekten mogelijk. Deze techniek zou het mogelijk maken het testen van farmacologische respons, ontdekking van moleculaire biomarkers voor de diagnose, bepaling van prognose en het volgen van verschillende ziekten, zoals stofwisselingsziekten, degeneratieve ziekten en verschillende soorten tumoren.
We daarom een minimaal invasieve werkwijze voor het verkrijgen van bloed uit zebravis serie 15. Hier laten we de procedure visueel en een gedetailleerd protocol voor deze techniek. Met behulp van deze methode, werden de normale waarde op basis van verschillende parameters, zoals hemoglobine, nuchtere bloedglucose en lipiden in het bloed van gezonde volwassen zebravissen geëvalueerd. Daarnaast hebben we ook onderzocht of deze methode geschikt is voor studies die seriële monsters per m nodigMonitoring van de temporele veranderingen in de bloedsuikerspiegel tijdens overvoeding experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij presenteren hier een gedetailleerd protocol voor serieel verkrijgen van bloed van volwassen zebravissen. Deze werkwijze is eenvoudig uit te voeren en we gebruiken in lab dagelijks. Deze bloedafname methode is gebaseerd op het plaatsen van een glazen capillaire naald in de zebravis de dorsale aorta. Tijdens deze procedure is het essentieel om voorzichtig te zijn om niet ablateren de wervelkolom, omdat het criterium voor het zoeken naar de dorsale aorta. Het verminderen van de wervelkolom letsel zal de overlevingskans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -. P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
