Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Gjentatte blodprøvetaking er en av de mest vanlige teknikker utført på forsøksdyr. Men ikke har blitt etablert et ikke-dødelig protokoll for blodprøvetaking fra sebrafisk. De tidligere metoder for blodprøvetaking fra sebrafisk er dødelige, for eksempel lateral snitt, halshogging og hale ablasjon. Dermed har vi utviklet en roman "gjentatt" blodinnsamlingsmetode, og presenterer her en detaljert protokoll som beskriver denne prosedyren. Denne metoden er minimal invasiv og resulterer i en meget lav dødelighet (2,3%) for sebrafisk, og dermed muliggjør gjentatte blodprøver fra samme individ. Det maksimale volum av blodprøver er avhengig av kroppsvekten av fisken. Volumet for gjentatte blodprøver med jevne mellomrom bør være ≤0.4% av kroppsvekt hver uke eller ≤1% hver 2 uker, noe som ble bedømt ved måling av blodhemoglobin. I tillegg hemoglobin, fastende blodsukker, plasma triacylglyserol (TG) og total cholesterol nivåer i mannlige og kvinnelige voksne sebrafisk ble målt. Vi har også brukt denne metoden for å undersøke feilregulering av glukosemetabolismen i kosten-indusert fedme. Denne blodprøvetaking metoden vil tillate mange programmer, inkludert glukose og lipid metabolisme og hematologiske studier, noe som vil øke bruken av sebrafisk som menneske sykdom modellorganisme.
Sebrafisk er stadig økende popularitet som en verdifull modell av menneskelige sykdommer fordi deres organer og genetikk er lik de menneskene 1,2. I feltet av utviklingsbiologi, har mange studier vist at sebrafisk og menneske viser markerte likhet i hematopoiesen 3, hemostase 4,5, og myelopoiesis 6. Voksen sebrafisk er også brukt for å studere immunologiske 7, nevrodegenerativ 8 og fedmerelaterte sykdommer 9 fordi denne modellen organisme aksjer felles trasé med de forstyrret i menneskelige sykdommer. For fedme og fedmerelaterte sykdommer (diabetes, leversteatose og alkoholisk steatohepatitis og aterosklerose), sebrafisk blodsukker og lipider nivåer har blitt grundig undersøkt i flere transgene og diett-indusert fedme modeller 10-13.
Gjentatte blodprøvetaking fra individuelle dyr vil redusere bruk av dyr og fellrease inter forskjeller. Imidlertid er gjentatt prøvetaking teknisk vanskelig på små dyr som sebrafisk på grunn av deres forholdsvis små blodvolum og mangel på lett tilgjengelige fartøy. Flere metoder for engangs blodprøvetaking fra sebrafisk har blitt utviklet, selv om disse metodene har sine egne ulemper, inkludert dødelighet, tilhørende skade vev og begrenset blodvolum. For eksempel, kan 1-5 ul blod høstes fra en lateral snitt på omtrent 0,3 cm i lengde i området for den dorsale aorta 5. Halshogging med saks ved å kutte gjennom brystbelte kan samle 5-10 mL blod 10. En annen praktisk blodprøvetaking metoden er halen ablasjon 14. Hjertepunktering er en potensielt alternativ metode for gjentatte blodprøvetaking fra samme fisk, men svært liten mengde oppnådd (ca. 50 nl) med denne fremgangsmåten begrenser antallet av analyser som kan være utføMED 11. Følgelig er en ny protokoll for å muliggjøre gjentatt ikke-dødelige blodprøver, noe som ville være en kritisk tid som er nødvendig for denne organisme være en standard modellorganisme for humane sykdommer. Denne teknikk ville tillate testing av farmakologisk respons, oppdagelse av molekylære biomarkører for diagnostisering, bestemmelse av prognose og overvåking av forskjellige sykdommer, slik som metabolske sykdommer, degenerative sykdommer og en rekke forskjellige maligniteter.
Vi har derfor utviklet en minimal invasiv metode for å skaffe blod fra sebrafisk serielt 15. Her viser vi til prosedyren visuelt og gi en detaljert protokoll for denne teknikken. Ved hjelp av denne metoden, ble det normal verdi basert på ulike parametre, blant annet hemoglobin, fastende blodsukker, og lipider i blodet hos friske voksne sebrafisk evaluert. I tillegg har vi også vurdert om denne metoden er egnet for studier som krever serieprøver av monitoring tidsmessige endringer i blodglukosenivåer under overfôring eksperimenter.
Vi presenterer her en detaljert protokoll for serielt skaffe blod fra voksen sebrafisk. Denne fremgangsmåten er enkel å utføre, og vi bruker den i laboratoriet på en daglig basis. Denne blodprøvetaking metoden er basert på å sette inn en glasskapillær nål inn i sebrafisk er rygg aorta. Under denne prosedyren, er det avgjørende å være forsiktig med å ikke ablate ryggraden fordi det er kriteriet for å søke etter rygg aorta. Redusere ryggraden skade vil forbedre overlevelse. Selv om denne teknikken er enkel …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |