Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Endotelial Planar Cell Modell for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics

Published: December 24, 2015 doi: 10.3791/53288
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

Abstract

Adaptiv immunitet er regulert av dynamisk interaksjon mellom T-celler og antigenpresenterende celler ("APC") referert til som "immunologiske synapser '. Innenfor disse intime celle-celle grensesnitt diskrete sub-cellulære klynger av MHC / Ag-TCR, F-aktin, heft og signalmolekyler danner og fornye seg raskt. Disse dynamikk er antatt å være kritiske faktorer som bestemmer både effektiviteten og kvaliteten av immunresponser som utvikler og derfor av beskyttende versus patologiske immunitet. Nåværende forståelse av immunologiske synapser med fysiologisk APC er begrenset av utilstrekkeligheten av den oppnåelige bildeoppløsning. Selv kunstige underlaget modeller (f.eks planar lipidbilag) tilbyr utmerket oppløsning og har vært svært verdifullt verktøy, de er iboende ikke-fysiologiske og unyansert. Vaskulære og lymfatiske endotelceller har dukket opp som en viktig perifert vev (eller stromal) rommet i "semi-profesjonal APC '. Disse APC (som uttrykker mest av den molekylære maskineri av profesjonelle APC) har den unike egenskap til å danne nesten plane celleoverflaten og er lett transfectable (f.eks med fluorescerende protein journalister). Heri en grunnleggende metode for å implementere endotelceller som en ny og fysiologisk 'plane cellulær APC modell "for forbedret avbildning og utspørring av grunnleggende antigene signaleringsprosessene vil bli beskrevet.

Introduction

T-lymfocytter er en gren av det adaptive immunsystemet, karakterisert ved evnen til effektivt å gjenkjenne peptid antigen (Ag) bundet til hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) molekyler gjennom deres T-celle-reseptorer (TCR) 1. Naive lymfocytter konstitutivt migrere og skanne faglige Ag celler '(APC, for eksempel, dendrittiske celler) i lymfeknuter, mens minne / effektor T-celler trenger for å effektivt kartlegge et ekstremt bredt spekter av APC og potensielle målceller i perifere vev.

I min etter første gangs registrering av beslektet Ag på en APC, lymfocytter arrestere deres migrasjon og begynner å danne en spesialisert intim celle-celle-grensesnitt kalles 'immunologiske synapsen "(IS). Vedvarende (dvs. 30-60 min) ER kontakter er nødvendig for å forsterke og opprettholde signale 2-7. Emerging studier identifisere at innenfor IS, er det kontinuerlig dannelse og rask remodeling av diskrete sub-cellulære signalmikro klynger (dvs. inneholder MHC / Ag-TCR, F-aktin, heft og signalmolekyler) som bestemmer styrken og kvaliteten på resulterende immunresponser 2-7. Imidlertid er dynamiske detaljer og reguleringsmekanisme av denne prosessen ufullstendig forstått 8,9. Dette stammer i stor grad fra tekniske utfordringer knyttet til uregelmessige topologier av APC flater og dårlig kontrollert orientering av celle-celle interaksjons fly, problemer som dypt begrenser den nødvendige tid og rom bildebehandling nærmer 8-10 (Figure1A).

Figur 1

Figur 1. En fysiologisk Planar Cell APC Modell for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics. Den skjematisk illustrerer tradisjonelle avbildning av immunologisk synapse mellom en T-celle og en professio nal APC (A) og T-celle og en tradisjonell plan lipidbilag APC modellen (B) i forhold til denne nye endotelial plane APC-modellen (C). Profesjonelle APC tilveiebringe fysiologiske immunologiske synapser men har dårlig orientert celle-celle grensesnitt (dvs. med hensyn til den optimale xy avbildningsplanet; oppløsning ~ 0,2 mikrometer), noe som dramatisk kompromisser romlig (z avbildningsplanet oppløsning ~ 1 um) og tidsmessig (dvs. på grunn av behovet for å gjentatte ganger søke gjennom alle z avbildningsplan) oppløsning av bildebehandling. Bilags modeller har en plan topologi som gir optimal spatiotemporal bildeoppløsning, men er også svært forenklet, ikke-fysiologiske og rigid. Dette endotelceller modellen kombinerer planar topologien lipidbilag med fysiologisk substrat av en klassisk APC å levere optimal romlig og tidsmessig bildeoppløsning i en fysiologisk setting.m / filer / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tidligere arbeid har delvis omgå disse hindringene ved å utvikle plant substrat modeller (dvs. lipidbilag og antistoff-belagte overflater) som gir optimal tid og rom-oppløsning (dvs. via fiksering av T-celleaktivering overflaten til et enkelt plan som er parallelt til den optimale xy avbildnings planet) 11-15 (figur 1B). Disse modellene har tilrettelagt viktig innsikt i de subcellulære / molekylær dynamikk som styrer antigen signale i T-celler, inkludert oppdagelsen av dynamisk aktin / TCR signal mikro-klynger 7,11-14. Imidlertid er slike modeller iboende kles, samt stiv (utelukker utviklingen / studiet av tre-dimensjonale topologiske egenskaper) (figur 1B). Derfor er det fortsatt usikkert hvordan å fortelle om slike funn til grafisiologic celle-celle immunovervåkning.

Men fortsatt studerte, er vaskulære og lymfatiske endotelceller fremstår som en stor (dvs. større i antall enn alle profesjonelle APC, ved ~ 1000 ganger) perifer rommet i "semi-profesjonelle 'APC 16-18. Disse cellene uttrykker MHC-I-, MHC-II- og et mangfold av co-stimulatorer molekyler (f.eks CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, men ikke CD80 og CD86) og er strategisk plassert på blod-vev grensesnitt der de tjener spesialiserte sentinel funksjoner 16-18. Tidligere studier har vist at endotelcellene effektivt kan gjen stimulere effektor / minne, men ikke naive, T-celler 19-25. Således endotelceller vil kunne spille unike APC roller i effektorfasen adaptive immunresponser i de perifere vev, slik som lokale innflytelse på T-celleaktivering, differensiering, hukommelse og toleranse 16,17,26. Critisk, når dyrket in vitro, endotelceller danner praktisk talt plane celleoverflater og er lett transfectable (f.eks, med fluorescerende protein reportere). Disse funksjonene er ideelle for høy spatiotemporal oppløsning avbildning av topologiske dynamikk i celle-celle interaksjoner 19,27. Dermed endotelceller kan tjene som en fysiologisk 'planar cellular APC' modell utpreget egnet for studiet av subcellulære / molekylær ombygging mekanismer som driver antigen anerkjennelse og regulerer svar (figur 1C) 19,20.

Tidligere etablert komplementære billedteknikker (inkludert transfeksjon av endothelia cellene med fluorescente protein produsentene av plasmamembranen og cytosol) for å studere detaljene for leukocytt-endotelial interaksjon under adhesjon og transendothelial migrering 27, viste at leukocytter sonde aktivt overflaten av endotel ved dynamisk innsetting end tilbaketrekking av sub-mikron-skala, actin-rik sylindriske fremspring (~ 200-1000 nm i diameter og dybde) betegnes invadosome lignende fremspring (dvs. 'ILPs') 27,28. Disse avbildnings tilnærminger har blitt ytterligere utvidet sammen med etableringen av protokoller for å dra nytte av endotelial APC-funksjon til å utvikle det første metoder for høy spatiotemporal oppløsning avbildning av T-celle-endotelial immunologiske synapse som rapportert 19,20 og beskriver videre heri. Et sentralt funn som stammer fra denne romanen planar mobil APC-modellen er at T-celle ILPs fungere både i å fremme innledende Ag deteksjon og i å opprettholde påfølgende signalering. Faktisk, matriser av flere ILPs (som ble stabilisert og påløpt i respons til innledende kalsium flux) viser berikelse i TCR og molekyler som tyder på aktiv signal slik PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrosin og HS1. Derfor ILPs synes å representere en tredimensjonal fysiologisk ekvivalent med den TCR-signalisering mikroklynger sett i planar bilags modeller. Denne tilnærmingen, og dermed avslører følsomt / rapporter molekylære og arkitektoniske (og implisitte biomekaniske) dynamikk ellers ikke synlig.

Metoden er beskrevet i dette dokumentet skal være nyttig for å bygge bro over gapet mellom profesjonell APC og kunstige APC substrat modeller for å styrke vår evne til å avhøre grunnleggende mekanismer for adaptive immunresponser. Mens her gjelder det på aktivering av CD4 + Th1-type effektor / minnecelle, kan denne grunnleggende metode kan lett modifiseres for å studere et bredt spekter av T-celletyper og Ags, som diskutert nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene beskrevet i denne protokollen er utført med primære humane T-celler og kommersielt tilgjengelige primære humane endotelceller (dermal eller lunge microvascular ECS) .Any forskningsprotokoll som omfatter mennesker må godkjennes av en Institutional Review Board og skriftlig informert samtykke skal gis fra hver blodgiver. Eksperimenter utført ved hjelp av denne protokollen ble godkjent av IRB av Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Klar Menneskelig CD4 + Th1 Effector / minne T-celler

  1. Påfør tourniquet til armen av donor, tørk vene med alkohol, og sett nålen. Sakte trekke 15 ml blod inn i vacutainer ved hjelp av EDTA som antikoagulant. Når blodet har blitt trukket, knyte opp tourniquet før du fjerner nålen. Umiddelbart legge trykk på såret med steril kompress når nålen er fjernet.
  2. Overfør blod til et 50 ml rør. Legg RPMI-1640 ved RT i 1: 1 fortynning (sluttvolum 30 ml). Overlappe nøye fortynnetd blod på to 50 ml rør inneholdende 15 ml av det filtrerte lymfocytter isoleringsmedium slik som Ficoll-Paque ved RT.
  3. Sentrifuger gradient ved RT i 30 minutter ved 1200 x g i en svingende spannrotor. Mens sentrifugering fremstille T-cellemedium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penicillin / streptomycin).
  4. Etter fjerning av 50 ml rør fra sentrifugen, observere fire lag: en pellet av røde blodceller i den nederste, den paque, et lag av celler som inneholder hvite blodlegemer (inkludert lymfocytter) og plasma. Fjern forsiktig hvite blodcellelaget med en Pasteur pipette og overføring i et 50 ml Falcon-rør.
  5. Vask den hvite blodcellelaget ved å tilsette RT RPMI-1460 (opptil 20 ml) og sentrifugering ved romtemperatur i 5 min ved 1200 x g. Resuspender de hvite blodcellene i 1 ml av T-cellemedium. Tilsett 5 ul av 1 ml cellesuspensjon til 250 pl T-cellemedium i et 1,5 ml sentrifugerør og bland forsiktig opp og ned ved pipette.
  6. Legg 25 mL fortynnetd cellesuspensjon til 25 pl 0,4% trypanblått. Tilsett 10 mL av blandingen til hver side av en standard hemocytometer.
  7. Plasser hemocytometer på et lavt strømforbruk lysmikroskop. Ved hjelp av et 10X objektiv telle antallet levende celler som har utelukket den Trypan blått fargestoff og som er til stede i midten kvadratet av begge sider av hemocytometer.
  8. For å beregne cellekonsentrasjonen, multiplisere gjennomsnittet av 2 firkanter ved 100 (fortynningsfaktor) og deretter multiplisere med 10 4 for å gi antall celler / ml.
  9. Juster sluttkonsentrasjonen til 0,5 x 10 6 celler / ml i T-cellemedium. Legg til en sluttkonsentrasjon på 1 pg / ml hver av bakterielle superantigener stafylokokk-enterotoksin B (SEB) og toksisk sjokksyndrom toksin-1 (TSST) til cellene. Kultur i 72 timer (37 ° C og 5% CO2) for å utvide CD4 + T-cellepopulasjon.
  10. Pellet T-celler (1200 xg, 5 min) og resuspender 0.5 x 10 6 celler / ml i T-celle-medium med dentilsetning av humant IL-15 (20 ng / ml). Transfer lymfocytter til en T150 kolbe. Fortsett å utvide / dele celler i hele mellom IL-15 hver 24-48 timer etter behov (basert på media farge, dvs. når media svinger fra rosa til svakt gul) etterpå. Opprettholde den resulterende lymfocyttpopulasjon for opp til 15 dager.
    MERK: Ved design, vil denne protokollen aktivere og utvide spesifikt undergruppe av CD4 + T-celler som er reaktive til SEB og TSST og deretter kjøre dem mot en Th1-lignende effector / minne fenotype. Andre hvite blodcellene ikke å overleve og vokse under disse betingelser, slik at ved trinn 1,10 cellene vil være minst 95% CD4 +, CD45RO + -T-celler 19, som lett kan vurderes ved strømningscytometri. Hvis ønskelig, kan ytterligere rensing lett oppnås gjennom kommersielt tilgjengelig antistoff / magnetisk kulebaserte positive eller negative seleksjons kits.

2. Starter primære humane endotel Cell Culture

<ol>
  • Belegge en T25-kolbe med fibronektin (FN) 20 ug / ml i PBS i sterile betingelser. La ved romtemperatur i 30-60 min. Fjern FN og tilsett 5 ml komplett medium (endotel Basal Medium (EBM-2) medium supplert med endotel vekstmedium (EGM-2) singlequots). Pre-inkubasjon i 37   ° C cellekulturinkubator i minst 30 min.
  • Tine en ampulle av frossen human lunge eller dermale mikrovaskulære endotelceller (HLMVECs eller HDMVECs) i et 37 ° C vannbad under leilighetsvis forsiktig omrøring i ~ 2-3 min. Umiddelbart overføre celler til T25 kolbe med forvarmet media. Virvle og plasser i inkubator ved 37 ° C.
  • Endre media etter ~ 4-6 timer. Fortsette å endre media omtrent hver 48 time (eller når media blir litt gul) til plate når ~ 90-95% konfluens.

    • 3. Generell Splitting og Utvidelse av endotelceller

    1. Grow celler til ~ 90-95 confluency. Dette kan ta 2-5 dager. For splitting,fjerne media og skyll med PBS. Fjern PBS og erstatte med minimumsvolum av fersk 1x trypsin (0,5 ml for T25 eller 1,5 ml for T75). Virvle å dekke hele overflaten med trypsin. Inkuber ved 37 ° C for ~ 5 min. Overvåke avløsning av cellene fra platen ved hjelp av et lavt strømforbruk lysmikroskop.
    2. Når mesteparten av cellene vises avrundet eller frittstående, tilsett 5 volum (dvs. i forhold til trypsin volum tilsatt) av forvarmet komplett EGM-2-medium og lett Pipette over overflaten av kolben for å løsne alle celler.
    3. Telle endotelceller med hemocytometer som beskrevet i 1.6 til 1.7. Pellet cellene ved sentrifugering (5 minutter, 1200 xg). Fjern supernatanten. Juster konsentrasjonen til 0,5 millioner celler per ml ved tilsetning av forvarmet komplett EGM-2 MV media.
    4. Overfør porsjoner av celler til de aktuelle FN-belagt retter eller kolber for vedlikehold. Virvle og plasser i inkubatoren. Endre media innen 6-12 timer av platekledning. Medie should endres omtrent hver 48 time etterpå.

    4. endotelcelle Transfeksjon

    MERK: Primær endotelceller er ildfast til transfeksjon av de fleste vanlige kjemiske og electroporation metoder. Den kjernefysiske transfeksjon basert metode som er beskrevet nedenfor tillater relativt høy transfeksjonseffektivitet (~ 50-70%). Et effektivt alternativ metode er bruk av infeksjon med passende virale vektorer (se kommentarer i Materials tabell).

    1. Forbered T25 eller T75 kolber (som nødvendig) av HLMVECs eller HDMVECs til en endelig tetthet på 90-95% confluency.Coat med fibronektin (FN) 20 ug / ml i PBS i sterile betingelser enten mikroskopkulturplater som Delta-T plater (for trinn 5) eller 12 mm, runde dekkglass plassert inne i en brønn i en 24-brønners cellekulturplate (for trinn 6) med som beskrevet ovenfor (2,1).
    2. Tilsett 1 ml komplett EGM-2 kultur media til mikroskop kultur platesor 0,5 ml til hver 24 godt og likevekt plater ien fuktet 37 ° C / 5% CO2 inkubator.
    3. Avling og telle endotelceller som i trinn 3.1-3.3.Centrifuge det nødvendige volum av celler (0,5 million celler per prøve) ved 1200 xg i 5 min ved RT. Resuspender cellepelleten i 100 ul omhyggelig RT atom transfeksjon løsning per prøve.
    4. Kombiner 100 mL av cellesuspensjon med på 1-5 mikrogram DNA. Overfør celle / DNA suspensjon inn sertifisert cuvette; Prøven må dekke bunnen av kyvetten uten luftbobler.
      MERK: Konstruksjoner rettet YFP eller DsRed til cellemembranen (gjennom de N-terminale 20 aminosyrer av neuromodulin som inneholder et signal for posttranslational palmitoylation) ble brukt alene (membran-YFP alene eller membran-DsRed alene) eller ko-transfektert med et cytoplasmic volumet markør (f.eks membran-YFP og løselig DsRed). Mange permutasjoner av fluorescerende protein markører kan anvendes.
    5. Lukk kyvetten med hetten. Sett kyvetten medcelle / DNA-suspensjonen i kyvetten innehaveren av electroporator og anvende elektroporering program S-005. Ta kyvetten ut av holderen når programmet er ferdig.
    6. Legg ~ 500 mL av preekvilibrert kultur media til kyvetten og forsiktig fjerne cellesuspensjonen fra kyvetten bruke plast overføring pipetter gitt i atom transfeksjon kit.
    7. For eksperimenter med mikroskop kulturplater partisjonere cellesuspensjonen fra en reaksjon likt mellom to retter som inneholder forvarmet medier (trinn 4,2-4,3). For eksperimenter med 24 brønn / plate, partisjon én reaksjon likt mellom 3 brønner.
    8. Cellene inkuberes i en fuktet 37 ° C / 5% CO2 inkubator og endre media 4-6 timer, og på nytt ved 12 til 16 timer etter transfeksjon.

    5. Levende Cell Imaging and Analysis

    1. Forbereder endotelet
      1. Dag 0: Co-transfisere primære HLMVECs med membran-YFP og løselig DsRed via en nucleofeDette skjer teknologi som beskrevet i trinn 4 og plate på levende celle bildebehandling kulturplater.
      2. Dag 1: Skift medium med friskt medium inneholdende IFN-γ (100 ng / ml) for å indusere MHC-II-ekspresjon. På dag 2. stimulere transfekterte celler ved tilsetning av 20 ng / ml TNF-α til den eksisterende media.
      3. På dag 3, inkuber endotel med 1 pg / ml hver av bakterielle superantigener stafylokokk-enterotoksin B (SEB) og toksisk sjokksyndrom toksin 1 (TSST) ved 37 ° C i 30-60 minutter umiddelbart før forsøkene. Utelate dette trinnet for '-Ag' kontroll forhold.
    2. Forbereder Lymfocytter
      1. Parallelt med trinn 5.1.3, forberede Buffer A (fenolrødt-fritt HBSS) supplementert med 20 mM Hepes, pH 7,4 og 0,5% volum / volum humant serum albumin forvarmet til 37 ° C. Ta en prøve av dyrkede lymfocytter og bestemme tettheten ved å telle med en hemocytometer (trinn 01.12 til 01.17).
      2. Sentrifuger 2 millioner celler per prøve på 1,200 x g i 5 minutter ved romtemperatur i et 15 ml konisk rør. Sug media og forsiktig resuspender cellepelleten i 2 ml buffer A, slik at ingen cellegruppene forblir.
      3. Fjerne en frisk porsjon av Fura-2 kalsium fargestoff og resuspender i DMSO for å lage en lager-konsentrasjon på 1 mM.
      4. Tilsett 2 mL av Fura-2 stamløsning til T-cellesuspensjonen (2 mM sluttkonsentrasjon), hetten røret og blandes umiddelbart ved å snu røret for å sikre jevn dispersjon av fargestoff. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
      5. Sentrifuger som i trinn 5.2.2. Aspirer Buffer-A og forsiktig, men grundig resuspendere lymfocytter i 20 til 40 ul av frisk Buffer-A.
    3. Levende celler Imaging Setup og Acquisition
      MERK: Et bredt utvalg av systemer kan være ansatt for live-cell fluorescens bildebehandling på stående og invertert lysmikroskoper. Grunnleggende krav er fluorescens lyskilde og filtre, en CCD-kamera, motorisert filterbytte og skodder, et oppvarmet scenen (eller mikroskopope monter oppvarmet kammer) og programvare for automatisert bilde oppkjøpet. For denne protokollen høy numerisk apertur, høy forstørrelse (dvs. 40X, 63x) olje nedsenking linser er nødvendig for å oppnå den nødvendige romlig oppløsning. Spesielle hensyn må tas i å velge riktig fluorescens kilde og objektiver for Fura-2-baserte kalsium bildebehandling som ikke alle er kompatible med de nødvendige 340/380 nm eksitasjonsbølgelengdene. En alternativ tilnærming (kompatibel med standard grønne og røde fluorescens filtersett) kan anvendes med ikke-ratiomentic kalsiumfølsomme fargestoffer (for eksempel Fluo-4, Rhod-3), men disse kan ikke nøyaktig kvantifisere kalsium-fluks og bare gi en relativ / kvantitativ avlesning.
      1. Slå på mikroskop system (PC for drift, mikroskop, CCD-kamera, filterhjul og xenon lampe).
      2. Åpne utpekt programvare.
      3. Sett opp mikroskop / software for automatisert flerkanals time-lapse imaging. Inkluder sekvensiell oppkjøp av annonsenifferential interferens kontrast (DIC), standard grønn fluorescens, standard rød fluor og standard 340 og 380 nm eksitasjon Fura-2 bilder. Sette intervallet for oppkjøpet for 10-30 sek og en total varighet på ~ 20-60 min.
        1. Satt eksponeringstider for Fura-2 bildebehandling.
          1. Legg til ny objektiv olje og montere et mikroskop skål inneholdende kun 0,5 ml Buffer-A på oppvarmingstrinnet adapteren og umiddelbart slå på å ekvilibrere til 37 ° C (vil ta ~ 2-3 min).
          2. Legg hviler fura2-lastet lymfocytter til montert mikroskop fatet kammeret ved hjelp av en 20 mL pipette.
          3. Slå på lyse feltet imaging. Velg lysbanen til okularene. Bruk av grovskruen for å bringe objektiv i kontakt med bunnen av miscoscope fatet. Bruk okularet og finskruen å fokusere på de T-cellene avgjort i bunnen av fatet.
          4. Bruk xy scene kontroller for å velge et felt som inneholder minst 10 celler. Unngåoverfylt felt og celleklumper, da disse vil lage bilde gjenstander.
          5. Bytt fra lyse feltet til fluorescerende lyskilde. Bytt fra okularet bildebehandling til CCD-kamera. Sett oppkjøp parametere (f.eks eksponeringstid, detektor forsterknings- og binning). Ved hjelp av programvaren erverve hviler Fura2-340 og Fura2-380 bilder (som starter med samme eksponeringstid for hver, vanligvis i området fra ~ 200-1000 msek).
          6. Bruk av fremgangsmåtene beskrevet i trinn 5.4.1 beregne Fura2-340 / Fura2-380 for hver lymfocytt. Utføre gjentatte gjentakelser av å justere Fura2-340 og Fura2-380 eksponeringstider, skaffe bilder og beregne prosenter til gjennomsnittsverdiene er nær en.
        2. Satt eksponeringstider for mem-YFP og DsRed.
          1. Bytt mikroskopet fatet brukes i trinn 5.3.3.1 med en miscroscope fatet inneholder transfektert, aktivert og SAg behandlet (eller ubehandlet; kontroll) HLMVECs eller HDMVECs fra cellekultur inkubator (trinn 4.5.1). Bruk en engangsoverføring pipette for å fjerne raskt media, skyll en gang ved tilsetting av ~ 1 ml forvarmet Buffer-A. Aspirer og deretter tilsett 0,5 ml Buffer-A.
          2. Identifisere områder der brightly fluorescerende positive transfektant endotelceller er tilstede og synes sunt med velformede inter veikryss.
          3. Juster oppkjøp parametere (f.eks eksponeringstid, detektor forsterknings- og binning) for mem-YFP og DsRed. Vær sikker på at midlere fluorescens signalintensitet i hver kanal faller mellom 25% og 75% av det dynamiske området for detektoren.
      4. Gjennomføre levende celle bildebehandling eksperiment.
        1. Bruk automatisert programvare for å begynne image oppkjøpet og fange flere intervaller på bildene for å etablere baseline.
        2. Under innhenting gjelder ~ 5 ul av konsentrerte Fura-2-lastede lymfocytter (fra trinn 5.2) til sentrum av mikroskopet fatet avbildningsfeltet ved å innføre spissen av et lite volum (P-5eller P-20) pipette inn i mediet i nærheten av sentrum av målet og tas ut langsomt.
        3. Som lymfocytter bosette seg i bildefeltet, foreta finjusteringer i fokus for å sikre at T-celle-endothelia celle grensesnitt (immunologiske synapser) er opprettholdt i fokusplanet. Med 40 og 63X objektiv, ~ 10-20 celler per felt er optimal. Hvis færre celler er observert i bildefeltet gjenta trinn 5.3.4.2.
        4. Etter at den ønskede observasjonsintervall av eksperimentet er konkurrerte, fortsetter avbildning og umiddelbart pipettere ionomycin direkte inn i miscoscope fatet (ved hjelp av teknikk som i 5.3.4.2) til en endelig konsentrasjon på 2 mM for å indusere maksimal kalsium-fluks / Fura-2 signaleringssignalet (dvs. , et middel for kalibrering, Se analyse 5.4.).
        5. Som et alternativ til 5.3.4.4after den ønskede observasjonsintervall av eksperimentet er konkurrerte, straks suge Buffer-A og erstatte den med 0,5 ml fikseringsløsning (3,7% formaldehyd i PBS) i 5 min vedRT, etterfulgt av skylling tre ganger med PBS. Deretter går du videre til trinn 6.
    4. Analyse av levende celler Imaging
      MERK: Etter lagring ervervet filer, kan de bli analysert direkte eller eksporteres for analyse av et bredt spekter av off-line bildeanalyse programmer. ImageJ er en spesielt verdifull, svært allsidig pakke som er fritt tilgjengelig og kompatibelt med nesten alle oppkjøp programvarepakken. Utformingen av bildebehandling eksperimenter som er beskrevet i trinn 5,1-5,3 vil gi høye romlige og tidsmessige oppløsning dynamikken i interaksjon mellom lymfocytter og endotelial APC i fravær og nærvær av beslektede SAg. Nesten ubegrensede analyser er mulig når adressering bildedata for mobil morfometrisk / signal dynamikk. De spesifikke formål som beskrives i denne protokollen er koordinert for å kvantifisere lymfocyttmigrering og signalisering (dvs. kinetikk og nivåer av intracellulært kalsium flux) sammen med dynamiskal endringer i den immunologiske synapsen arkitektur med fokus på spesifikke funksjoner (dvs. ILPs / PODO-utskrifter). Følgende er eksempler på egen standard og ikke-standard (dvs. utviklet spesielt for spørsmål disse eksperimenter /) analyser.
      1. Mål Lymfocytt Kalsium flux
        1. Velg de innledende Fura2-340 (340 nm EX-510 nm EM) og Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) bilder som ble anskaffet før tilsetting av lymfocytter. Bruke disse som bakgrunnsbilder og digitalt trekke dem fra alle bildene i tidsseriene for hvert respektive kanal.
        2. For hvert tidspunkt lage en digital ratio bilde av bakgrunnen korrigert Fura2-340 og bakgrunnskorrigert Fura2-380 bilder (dvs. 340 nm EX-510 nm EM-bakgrunn / 380 nm EX-510 nm EM-bakgrunn).
        3. Velg den aktuelle programvaren tegneverktøyet. Klikk på skjermen for å tegne en sirkulær regionen interest (ROI) rundt hver lymfocytt. Disse vil generere en piksel-midlet forholdsverdi for hver lymfocytt og tidsramme.
        4. Plott beregnet forholdet som en funksjon av tid ved hjelp av et egnet program (f.eks regnearkprogram). Beregn gjennomsnitt kalsium-fluks for forsøket ved å summere de forholdsverdiene av alle lymfocyttene per felt, og dividere denne verdi av det totale antall lymfocytter for hvert tidspunkt
      2. Gjennomføre lympocyte migrasjon sporing analyse.
        1. Analysere celle T celle migrasjon ved hjelp av et egnet celle sporing program (f.eks ImageJ) ved hjelp av DIC kanal fra hver video. Bruke ImageJ Cell Tracking Plugin, identifisere i hver ramme tyngdepunktet til hver celle manuelt ved å klikke på den i hvert progressive ramme.
        2. Bruk de resulterende serie xy koordinater (dvs. spor av migrasjonsveier) for å beregne gjennomsnittlig hastighet (total avstand migrert / total intervall of avbildning) og tortuosity (total avstand migrert / lineær ende-til-ende-avstand mellom celleplassering i den første og siste bilde).
        3. Kryss korrelere disse parametre med kalsium-fluks (5.4.1) dynamikk på en celle-for-celle-basis.
      3. Vurdere Podo-print / ILP Tetthet i IS
        1. Tell antall ILP dannet i hver T-celler er definerte intervaller (for eksempel 5 minutter etter tilsetningen av T-celler). Disse kan identifiseres diskret mikron-skala fluorescerende membran-YFP ringene som co-lokalisere med mørke ringer i cytoplasma DsRed på endothelial APC på et område av lymfocytt vedheft.
        2. Kryss korrelere de resulterende 'ILP indeksene "med kalsium-fluks (5.4.1) dynamikk på en celle-for-celle-basis.
      4. Mål Podo-print / ILP levetid.
        1. For hver Podo-print / ILP i en gitt IS beregne sine liv som siste tidspunkt da en ILP var synlig - tidspunktet da at Podo-print / ILP first dukket opp. Gjennomsnittlig ILP levetid både per IS.
        2. Kryss korrelere disse livene med kalsium-fluks (5.4.1) dynamikk på en celle-for-celle-basis.
      5. Vurdere tinning forholdet mellom første ILP dannelse og kalsium flux.
        1. For hver lymfocytt identifisere tidspunktet (frame) der kalsium først stiger over baseline 19.
        2. For hver lymfocytt identifisere tidspunktet hvor den første Podo-print / ILP vises.
        3. For hver lymfocytt beregne en "offset tid 'ved å trekke den opprinnelige kalsium-fluks tidspunkt fra den til den første Podo-print / ILP. Gjennomsnittlig verdiene for alle lymfocytter i et felt. Positive verdier indikerer ILP dannelsen forut kalsium flux mens negative tall indikerer det motsatte.
          MERK: Disse eksperimentene kan lett utføres under fysiologisk relevant laminær skjærstrømmen bruker kommersielt tilgjengelige parallell-vegg flyt bilde kamre som beskrevet en9.

    6. Fast-celle Imaging and Analysis

    1. Fast endepunkt T-celle-endothelial IS formasjon og Farging
      1. Forbered T-celler som er beskrevet i 1. Klar endotelceller (- / + SAg) som i trinn 5.1 (transfeksjon, i trinn 5.1.1 valgfritt). Ta en prøve av dyrkede lymfocytter og bestemme tettheten ved å telle med en hemocytometer (§ 1).
      2. Overføre en lymfocytt kultur volum tilsvarende minst 3 x 10 5 lymfocytter / prøve til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 200 xg i 3 min. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i lymfocytt Buffer-A (trinn 5.2.1) konsentrasjon på 6 x 10 5 lymfocytter / ml.
      3. Fjern de endoteliale celler fra cellekulturinkubator og (forløp en sample av gangen) suksessivt aspirer media og erstatte med 0,5 ml av lymfocyttsuspensjonen (3 x 10 5 lymfocytter / prøve) og erstatte 37 ° C iinkubator.
      4. Etter passende inkuberingstider, nevnt ovenfor, aspirer medium fra brønnene og legge tilstrekkelig Fixative Solution (3,7% formaldehyd i PBS) til å fullstendig dekke prøven (for eksempel i 24 brønners plate ~ 300-500 mL). Inkuber ved romtemperatur i 5-10 min.
      5. Skyll prøve 3 ganger med PBS. Flekk ved tilsetning av primært antistoff i 60 minutter ved romtemperatur (se liste). Dersom det primære antistoff er rettet mot et intracellulært protein, må en ytterligere permeabilization trinn som skal utføres ved tilsetning av tilstrekkelig permeabilization løsning (0,01% TritonX-100 i PBS) for fullstendig å dekke prøven i 1 min ved RT. Skyll prøve 3 ganger med PBS. Legg egnede sekundære antistoffer (i noen tilfeller samtidig fluorescerende phalloidin) i 60 min ved RT.
      6. Monter sirkulær glass dekkglass på en bilde lysbilde. Fast endepunkt T-celle-endothelial IS formasjon og farging. Til å begynne bildebehandling sted bilde lysbildet som inneholder eksempler på mikroskopet scenen og velg 63X oljeobjektiv. Bruk frisk nedsenking olje.
    2. Bruk lyse-feltet bildemodus og okulære linser for å finne fokusplanet. Bytt til epifluorescence og inspisere prøven via okulære linser. Velg et felt av interesse. Bytt til laser-scanning modus.
    3. Ved hjelp av hurtig-scan mode og arbeider i bredeste mulige individuell regulering av lasereffekten og forsterkning for hver kanal for å optimalisere signal slik at, ideelt sett, når den spesifikke signalintensitet på minst ~ 25% og ikke mer enn 75% av det dynamiske området av detektorene.
    4. Bruk av manuell fokus kontroller, raskt søke gjennom Z-aksen og identifisere de øvre og nedre grense for seksjonering (typisk all informasjon skal lagres på en tykkelse på ~ 15 mikrometer). Velg Z-aksen seksjon tykkelse i området fra 0,2 til 1,0 mikrometer ~.
    5. Til slutt, zoom / beskjære bildefeltet til den spesifikke regionen av interesse og oppførsel scan. I tillegg til å ha veldig lyst og spesifikk fluorescens siSignal- i prøven, anskaffe høyoppløselig 3D-imaging krever gjentakelser av skanning og gjøre justeringer til oppkjøp parametere. Målet er å oppnå maksimal xy og z-akse-oppløsning, uten nevneverdig foto-bleking.
    6. Kvalitativt analysere topologien av 3D topologi av IS ved å gjennomføre digital 3D rekonstruksjon av de resulterende optiske seksjoner gjennom et egnet program (for eksempel bilde J). Gjennom lignende programmer kvantitativt vurdere fluorescenssignal distribusjon (f.eks Pearsons samlokalisering og samsvar fluorescens intensitet line-scan analyse og ortogonale visning).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    En ny avbildning tilnærming ved hjelp av endotelceller og kombinere oppløsningen fordelene med den plane lipidbilag modellen med fysiologisk kompleksitet og deformerbarhet av profesjonelle APC ble utviklet (figur 1). Figur 2 viser eksempler på typiske migrasjon, kalsium-fluks og topologiske dynamikk observert med denne nærme seg. I fravær av SAg på endotelet, SAg-spesifikke CD4 + Th1 lymfocytter raskt spre seg, polarisere og lateralt migrere løpet flaten endothelial (Figur 2A) uten fluxing kalsium (ikke vist). Innen ~ 5-10 min disse lymfocytt initiere sjele over endotelet. I nærvær av SAg lasting på endotelet, lymfocytter spre symmetrisk med en "stekt egg 'topologi, initiere vedvarende (dvs. i 30-60 min) intracellulært kalsium fluks (figur 2B; Film 1) i løpet av hvilken tid de oppviserliten eller ingen migrering (figur 2C).

    Figur 2
    Figur 2. Levende celleanalyse for T-celleaktivering og migrering og Immunologisk Synapse Topologi av endotel APC-er. (A) Paneler viser et eksempel på en tidsserie avbildning av T-cellemigrering på endotelet i fravær av SAg. Øvre Panel viser DIC bilder. Utgangsstillingen for den trekkende T-celle er indikert med rød stiplet linje. Nedre panel viser invaginations dannet på endotelet ved migrasjon av T-celle. Piler indikerer dannelse av forbigående ringer (~ 0,5-1 mikrometer diameter) av membran-YFP fluorescens dannet som et resultat av T-celle generering av "invadosome lignende fremspring '(ILPs) mot endotel-APC overflate (se D). (B) viser et eksempel på en lignende serie i nærvær av SAg belastede endotel (venstre; se ogsåtilsvar Film 1) og kvantitativ spor av dynamiske endringer i kalsiumnivået (til høyre). Piler indikerer innledende ILPs formasjon som korrelerer med initiering av kalsium-fluks (i) og påfølgende stabilisering av flere ILPs som korrelerer med høyt kalsium-strøm (ii). (C) som i forsøkene A og B ble underkastet celle sporing analyse. DIC bilder på venstre viser representative T-celle migrasjonsveier over varighet på 10 min (røde spor). Grafen til høyre viser de beregnede migrasjonshastigheter i fravær og nærvær av sag. (D) Dynamisk synapse immunologisk analyse av topologi (modifisert fra 19). Skjematisk (i) illustrerer en sensitiv endotelceller / APC 'topologi reporter system "som består av membran-målrettede-YFP og løselig cytosolisk RFP. Actin-mediert ILP som stikker inn i endothelial celleoverflaten generere sylinderformede invaginations (en type celle foot-print, kalt en "Podo-print ') giving opphav til kraftig bøyd membran som vises som ringer av membran-YFP fluorescens (dvs. veggene i sylinderen på en face). Cytosol fortrengning og utelukkelse på disse loci vises som mørke sirkler av cytosolisk RFP. DIC og fluorescens bilder i (ii) viser et eksempel på en slik analyse i nærvær av SAg (se også tilsvarende film 2). En enkelt innledende Podo-print / ILP utvikler seg til en rekke> 20 stabilisert ILPs over 15 min. Blå boks på 15 min (iii) viser et høyoppløselig visning av en enkelt Podo-print / ILP der en ring av membran-YFP lapper med en region av utelukket cytosolisk RFP. Stiplet linje (iv) viser en kvantitativ analyse av linje scan fluorescensintensiteter. Skala barer = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Som tidligere etablert, lymfocytter activEly sonde overflaten av endotelium ved å utvide aktin og HS1 (en homolog cortactin) anriket og WASp- og src-avhengige fremspring kalt "invadosome lignende fremspring; (ILPs; hver ~ 0,5-1 mikrometer i dybden i diameter) 27,28. Transfeksjon av membran-målrettede fluorescens protein (FP) har vist seg å gi svært følsomme for pressen subcellulære topologiske dynamikk ved celle-celle-overflater. På denne måte er det blitt vist at lyse ringer av fluorescerende membran-FP er en indikasjon på membran bøying under T endotelial-celle-interaksjon som et resultat av T-celle-ILPs fremspring. Det er vist her, og i tidligere studier 19,20, at mens små klynger av ILPs form og omsetningen raskt (dvs. en levetid på ~ 10-30 sek) under sideveis vandring av T-celler på endotelium i fravær av SAg (figur 2A ), blir de svært stabilisert (dvs. liv med ~ 30 min) og samle inn tette arrays i nærværav SAg (figur 2B). Videre analyse av ILPs og kalsium innvielseskinetikk ('Offset tid ") viser at ILPs forut kalsium signalering, noe som tyder på at de hjelp i MHC-II / Ag gjenkjenningsprosessen (figur 2Bii). I tillegg stabilisert ILPs arrays danne samsvar med maksimal kalsium fluks (figur 2Bii). Ideen om at de ringer av membran fluorescens tilsvarer T celle utstikkere kjøring diskrete invagination flekker i endotelceller APC, bekreftes av demonstrasjonen at disse ringene i alle tilfeller korrelerer romlig og kinetisk med soner av fortrengt / ekskludert cytoplasma (som rapportert av løselig DsRed; Figur 2D og Movie 2).

    Figur 3 gir eksempler på fast endepunkt confocal imaging studier. Etter 10 min av ko-inkubasjon i nærvær av SAg, ISS dannet mellom T-celler og endotelceller APC ble fotografert ved fiksering, immuno-fluorescens farging og konfokalmikroskopi. Disse studiene gir analyse av subcellulære distribusjons dynamikken i kritiske molekyler og signal aktiviteter innenfor ISS spesielt forhold til ILPs. Nærmere bestemt, cytoskeletal / cytoskeletal regulator (aktin, HS1, figur 3A), antigen-presentasjon / gjenkjenning (CD3 / MHC-II, figur 3B) adhesjon (ICAM-1, LFA-1, talin, figur 3C), og antigen-signalering (PKC -Q Figur 3D) er sett til å være co-anriket i Podo-utskrifter / ILP. Digital rekonstruksjon av konfokale seriell-seksjon z-stabler gir komplementær bevis for de som er vist i figur 2D at T-celle-endotel-endotel IS har en diskret 3-dimensjon arkitektur avbrutt av T-celle ILP utstående i APC overflate (figur 3Aii, Ci, iii, D). (Figur 3Civ).

    Figur 3 Figur 3. Fast Prøve Analyse av Molecular Dynamics distribusjon i T-celle-endotelcelle Immunologiske synapser. Lymfocyttene ble inkubert på SAg belastet endotel i 30 minutter og fiksert og farget. I indikert paneler endotelceller ble pre-transfektert å uttrykke membran-YFP eller -DsRed. (A) Representative bildefremvisning aktin (i) og HS1 (a cortactin homolog; ii) co-anriket ved periferien av den immunologiske synapse i mikro-klynger som korrelerer med sentrum av endoteliale fluorescerende ringer av membran-YFP (dvs. ' PODO-prints '; Se figur 2D) bekrefter at T-celle ILPs er ansvarlig for utseendet PODO-utskrifter. En side view (ii. 90 ° Projection) illustrerer at ILPs representerer tre-dimensjonal utvekst i z bildeplanet (modifisert fra 19). (B) Representative anrikning av T-celle-TCR (i) og endothelial MHC-II (ii) innen den immunologiske synapsen, viser diskret subcellulær partisjone til ILP / Podo-utskrifter. (C) (i) Representant co-anrikning av ICAM-1 og LFA-1 i PODO-utskrifter og ILP, henholdsvis av IS. (i) viser en 3-D digital rekonstruksjon av konfokale deler av den dreies 60 ° (øvre panel) og 90 ° (ortogonale vis, nedre paneler). (ii) Viser et zoomet syn på IS en face. (iii) viser et ortogonalt tverrsnitt av den eske region (ii) (modifisert fra 19). (iv) Representant co-anrikning av Talin (en integtin / aktin linker protein) og aktin i IS ILPs. (D) Representant co-anrikning av TCR signalmolekyl PKC-Q med aktin i IS ILPs. Hvert panel viser et en face view (nedre venstre del) og to distinkte ortogonale visninger (90 ° Projeksjons). Helt til venstre og høyre panel bruk er duplikater av sine, respektive nabo paneler, anslått ved hjelp av en regnbue fluorescence intensitetsskala (modifisert fra 19). Skala barer = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Movie 1

    Movie. 1: Levende-Cell Dynamic Imaging av T-celle Kalsium signale og immunologiske Synapse Topology Time-lapse levende celle avbildning av fura2 belastede CD4 + Th1 lymfocytt samspill med endotel uttrykker membran-YFP og lastet med SAg, tilsvarende figur 2B. Venstre panel viser intracellulære kalsiumnivåer (regnbue: kule farger, lavt kalsium, varme farger høy kalsium) i T-celle. Høyre panel vist membran-YFP fluorescens på overflaten av endotelial APC. Lymfocytter er sett til å sette i gang å spre og ILP dannelse (sett via fluorescerende ringer i mem-YFP kanal, dvs. 'PODO-prints'; se figur 2Bi), etterfulgt av induksjon av en vedvarende (30-60 min) intracellulært kalsium flux, som skjer i samsvar med dannelse av perifere matriser av ILPs / Podo-utskrifter analoge til TCR / aktin 'signaliserer mikro-gruppert "som er sett i plane bilaget APC modeller (se figur 2Bii). Intervallet mellom rammer er 20 sek. Klikk her for å se denne videoen.

    Movie 2

    Movie 2: Levende-Cell Dynamic Imaging av Immunologisk Synapse Topology viEn fluoriserende Reportere i Endotelial APC. Time-lapse levende celle avbildning av CD4 + Th1 lymfocytt (DIC, venstre) i samspill med endotelet samuttrykker membran-YFP (grønn) og løselig cytosolisk DsRed (rød) og lastet med SAg, tilsvarende Figur 2D. Høyre panel viser merge av DIC, membran og cytoplasma signalering. De kombinerte signaler om membran og cytoplasma fluorescens følsomt rapportere dannelse og ombygging av flere ~ 0,2-1 mikrometer-skala overflate invaginations (PODO-trykk) som følge av arrays T-celle sondering med ILP utstikkere. Klikk her for å se denne videoen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Samlet sett beskriver denne protokollen metoder for å undersøke endotelceller som i) studerte fysiologiske APC og ii) som en ny type 'plane cellular APC-modellen ". Med hensyn til tidligere, har det blitt stadig mer verdsatt at ikke-blodkreft perifere (eller 'stromal') APC spiller avgjørende, ikke-redundante roller (dvs., sammenlignet med blodkreft APC) i utformingen adaptive immunresponser 16-18. Blant slike "semi-profesjonelle 'APC, vaskulær og lymfatiske endotelceller (som langt overgikk profesjonell APC) er blant de beste verdsatt 16-18. Men detaljene i signalanlegg hendelser og deres kombinert immunologiske synapser fortsatt i stor grad uninvestigated. Metodene som er beskrevet her gir grunnlag for å fremme forståelse i dette nye området. For eksempel bruke disse tilnærmingene til studiet av ISS dannet på endothelial fra ulike vev som er kjent for å vise tydelig adaptive immunologisk funksjon (f.eks, lever og lymfatiske endothelia) kan være spesielt lærerikt.

    Betydelig, hjelper denne metoden til å bygge bro mellom profesjonelle APC og kunstige APC underlaget modeller for å styrke evnen til å avhøre grunnleggende mekanismer for adaptive immunresponser. Mens planar APC underlag (dvs. lipidbilag, antistoff-belagt glass) gir optimal bilde (som har ført til mange kritiske innsikter 7,11-14), slike modeller er iboende begrenset. Alternativt detaljer om fysiologiske celle-celle skanning dynamikk har hittil blitt dypt skjult av orienteringsrelatert bildespørsmål 8-10. Imaging evner gitt i dagens tilnærming vinne denne hindringen som entydig viser ellers undetectable tredimensjonal subcellulære arkitektur og rask ombygging av en fysiologisk APC-T-celle-grensesnitt. Disse tilbudet potensial for ny forståelse av antigen signaling.

    For eksempel, den forståelse at T-cellene danner ILPs beriket med TCR, aktin og signalmolekyler (for eksempel figur 2d, figur 3), tyder på at disse sannsynligvis representerer den fysiologiske tre-dimensjonale mot deler til den plane TCR signalemikro klynger observert kunstig APC substrater 6,7,12-14,29-31. Dette innebærer at under fysiologiske innstillinger, kan lymfocytter ansette ILPs som diskrete subcellulære '3D-reaksjonsvolumer' med 'signalosome'-lignende egenskaper som forsterker og opprett signaliserer ved å konsentrere viktige molekyler / aktiviteter 32,33. I tillegg tilstedeværelsen av betydelige biomekaniske innganger (dvs. celle-celle kraftpåførings) ved severdighetene Hvis ILP utstikket mot APC kan utledes fra bildebehandling. Dette er nontrivial som mekaniske krefter er i økende grad sett på som viktige tilretteleggere av antigen signalering, mens nøyaktig hvordan slike krefter ermanifest fortsatt uklart 14,34-37.

    Den generelle betydningen av denne modellen som en rimelig surrogat for profesjonelle APC er støttet av den direkte demonstrasjonen at lignende ILP matriser kunne sees i synapser dannes på ECS og DCS (og i mindre grad B-celler) når det analoge bildedannende fremgangsmåter ble benyttet (f.eks , anvendelse av de samme fluorescens maskin og kontroll av IS plane orientering planet 19). Likevel må det tas i betraktning at de relative biomekaniske egenskapene til EF versus profesjonelle APC membran flater er ukjent, og at forskjeller i denne parameteren kan påvirke detaljene IS topologi og antigene reaksjoner.

    Nøkkelen til den tilnærmingen som er beskrevet her er sterkt knyttet til sin oppløsning fordeler. Dette i sin tur er sterkt relatert til styrken av det fluorescens-signalet. Dermed er det viktig å være spesielt oppmerksom på å optimalisere transfeksjon og farging av elektronisk fcent journalister og bildeparametere / teknikk (f.eks eksponeringstid, fokus, osv ...). Med hensyn til den førstnevnte, den protokoll for live-cellestudier som her beskrives er begrenset til transfeksjon av generiske membranen og cytoplasmiske markører som rapporterer topologiske endringer på T-celle-APC grensesnitt i sanntid (f.eks figur 2, filmer 1, 2). I tillegg kan denne protokollen lett modifiseres til for mer sofistikert analyse av samtidig innføre / bilde ytterligere journalister i endotelet (f.eks fluorescerende protein-merket MHCI / II og heft, kostimulerende og co-hemmende molekyler og biosensorer for alarm og biomekanisk dynamikk). Dessverre er imidlertid en generell begrensning som lymfocytter er notorisk vanskelige å transfektere. Dette utelukker praktisk bruk av fluorescerende proteiner (f.eks tagget til TCR, PKC-Q, etc.) i T-celler for live cell imaging.

    Mensgjeldende protokollen innebærer aktivering av menneskelig effektoren / minne CD4 + Th1 typen lymfocytter gjennom SAg (en mye brukt modell), mye bredere muligheter finnes. Som tidligere demonstrert 19,20 denne tilnærmingen er lett tilpasses et bredt spekter av andre innstillinger, for eksempel reaksjoner fra andre CD4 + undergrupper og aktivering av CD8 + lymfocytter draps svar. Ved isolering av lymfocytter og endotelceller fra eksisterende TCR-transgene stammer denne fremgangsmåten er også lett kan tilpasses for å studere reaksjoner på spesifikke peptidantigener 19,20. Til slutt blir den nåværende metode begrenset til undersøkelse av effektor / minne T-celler. Imidlertid transfeksjon av endotelceller med de essensielle kostimulerende molekyler (CD80 / 86, som normalt ikke uttrykkes på endotel) kan gi rom for undersøkelse av naive celle grunnings dynamikk i denne modellen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD Biosciences 367203
    BD alcohol swabs BD Biosciences 326895
    BD Vacutainer Safety-Lok BD Biosciences 367861 K2 EDTA
    BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set BD Biosciences 367335
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-1L
    Ficoll-Paque Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Bring to RT before use
    FCS-Optima Atlanta Biologics s12450 Heat inactivated
    Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
    Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
    staphylococcal enterotoxin B Toxin Technology BT202RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    toxic shock syndrome toxin 1 Toxin Technology TT606RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    human IL-15 R&D Systems 247-IL-025 Stock solution 50ug/ml in PBS
    PBS Life Technologies 10010-049
    Fibronectin Life Technologies 33016-015 Stock solution 1mg/ml in H20
    HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells Lonza CC-2543 Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
    EGM-2 MV bullet kit Lonza CC-3202
    Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T-4174 Stock solution 10x, dilute in PBS
    amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit Lonza vpb1003 Required Kit for step 4
    IFN-g Sigma-Aldrich I3265 Stock solution 1mg/ml in H20
    TNF-alpha 10ug, human Life Technologies PHC3015 Stock solution 1mg/ml in H20
    phenol Red-free HBSS Life Technologies 14175-103
    Hepes Fisher Scientific BP299-100
    Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016-100G Stock solution 1M in H20
    Magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337 Stock solution 1M in H20
    Human Serum albumin Sigma-Aldrich A6909-10ml
    Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil Fisher Scientific 12-624-66A
    Fura-2 AM 20x50ug Life Technologies F1221 Stock solution 1mM in DMSO
    pEYFP-Mem (Mem-YFP) Clontech 6917-1
    pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) Clontech 632466
    pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) Clontech 632512
    pEGFP-Actin Clontech 6116-1
    Alexa Fluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
    Formaldehyde solution 37% Fisher Scientific BP531-500 Toxic, use fumehood
    Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-5ML
     Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
    Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A 
    Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 Fisher Scientific 10-126-9
     Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 Fisher Scientific   13-680-65
     Corning Cell Culture Treated T175 Fisher Scientific 10-126-61 
    Glass coverslips  Fisher Scientific 12-545-85  12 mm diameter
     Falcon Tissue Culture Plates 24-well Fisher Scientific 08-772-1
    Delta-T plates Bioptechs 04200415B
    Wheaton Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8D
    1.5 ml Eppendorf tube  Fisher Scientific 05-402-25
     ICAM1 mouse anti-human BD Biosciences 555509
    HS1 mouse anti-human BD Biosciences 610541
    Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified ebioscience BMS102
    Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 ebioscience 53-0037-41
    Anti-MHC Class II antibody  Abcam ab55152
    Anti-Talin 1 antibody Abcam ab71333
    Anti-PKC theta antibody  Abcam ab109481
    phosphotyrosine (4G10 Platinum) Millipore 50-171-463
    Nucleofector II Amaxa Biosystems Required electroporator for step 4
    Zeiss Axiovert Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss LSM510  Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss Axiovison Software Carl Zeiss MicroImaging
    NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet NuAIRE Nu-425-600
     Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator Fisher Scientific 202370
    Centrifuge 5810 Eppendorf EW-02570-02
    Hemocytometer Sigma-Aldrich  Z359629 Bright-Line Hemocytometer
    Isotemp Waterbath model 202 Fisher Scientific 15-462-2

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
    2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
    3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
    4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
    5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
    6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
    7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
    8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
    9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
    10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
    11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
    12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
    13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
    14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
    15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
    16. Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
    17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
    18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
    19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
    20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
    21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
    22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
    23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
    24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
    25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
    26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
    27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
    28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
    29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
    30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
    31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
    32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
    33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
    34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
    35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
    36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
    37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

    Tags

    Immunologi Immunologisk synapse T-celle reseptor Major histokompatibilitetskompleks lymfocytter antigenpresenterende celle endotelet signalering kalsium aktin bildebehandling adaptiv immunitet migrasjon
    En Endotelial Planar Cell Modell for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Martinelli, R., Carman, C. V. An… More

    Martinelli, R., Carman, C. V. An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics. J. Vis. Exp. (106), e53288, doi:10.3791/53288 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter