Abstract
Adaptiv immunitet regleras av dynamiska interaktioner mellan T-celler och antigenpresenterande celler (APC) kallade immunologiska synapser ". Inom dessa intima gränssnitt cell-cell diskreta sub-cellulär kluster av MHC / Ag-TCR, F-aktin, vidhäftning och signalmolekyler bildar och renovera snabbt. Denna dynamik tros vara en avgörande betydelse för effektiviteten och kvaliteten på de immunsvar som utvecklar och därför skyddande kontra patologisk immunitet. Aktuell kunskap om immunologiska synapser med fysiologisk APC begränsas av otillräcklig erhållas avbildning upplösning. Även artificiella substrat modeller (t.ex. plana lipiddubbelskikt) erbjuder utmärkt upplösning och har varit mycket värdefulla verktyg, de är till sin natur icke-fysiologiska och förenklad. Vaskulära och lymfatiska endotelceller har dykt upp som en viktig perifer vävnad (eller stromaceller) fack av "semi-yrkeal APC '. Dessa APC (som uttrycker de flesta av de molekylära maskiner professionella APC) har den unika funktionen att bilda praktiskt taget plana cellytan och är lätt transfekterbara (t.ex. med fluorescerande protein reportrar). Häri en grundläggande strategi för att genomföra endotelceller som en roman och fysiologisk "plana cell APC modell" för förbättrad avbildning och förhör grundläggande antigena signalprocesser kommer att beskrivas.
Introduction
T-lymfocyter är en gren av det adaptiva immunsystemet kännetecknas av förmågan att effektivt känna igen peptidantigen (Ag) bundna till större histokompatibilitetskomplex (MHC) molekyler genom deras T-cellreceptorer (TCR) 1. Naiva lymfocyter konstitutivt migrera och skanna yrkesmässiga Ag presenterande celler "(APC, t.ex. dendritiska celler) i lymfkörtlar, medan minnet / T-celler behöver för att effektivt kartlägga ett mycket brett utbud av APC och potentiella målceller inom perifera vävnader.
I min efter första redovisningen av besläktad Ag på en APC, lymfocyter arrestera deras migration och börja bilda en specialiserad intim cell-cell-gränssnittet kallas "immunologisk synaps" (IS). Fortsatt (dvs 30-60 min) ÄR kontakter krävs för att förstärka och upprätthålla signalering 2-7. Tillväxtstudier identifiera att inom IS, är det den kontinuerliga bildningen och snabb remodeling diskreta sub-cellulära signaleringsmikrokluster (dvs innehållande MHC / Ag-TCR, F-aktin, vidhäftning och signalmolekyler) som avgör styrka och kvalitet resulterande immunsvar 2-7. Men dynamiska detaljer och regleringsmekanism i denna process ofullständigt förstått 8,9. Detta beror till stor del från tekniska utmaningar som är förknippade med oregelbundna topologier av APC ytor och dåligt kontrollerad orientering av interaktions cell-cell flygplan, frågor som i grunden begränsar den erforderliga Spatiotemporal avbildning närmar 8-10 (Figure1A).
Figur 1. en fysiologisk Planar Cell APC Modell för Imaging Immunological Synapse Dynamics. Schemat visar traditionella avbildning av immunologisk synaps mellan en T-cell och en professio nella APC (A) och T-cell och en traditionell plana lipiddubbelskikt APC modell (B) i jämförelse med denna nya endotel plana APC modell (C). Professionella APC ger fysiologiska immunologiska synapser men erbjuder dåligt orienterad cell-cell-gränssnitt (det vill säga, med avseende på den optimala xy avbildningsplanet; upplösning ~ 0,2 | im), som dramatiskt äventyrar rumsliga (z avbildningsplanet upplösning ~ 1 | im) och tidsmässiga (dvs., på grund av behovet att upprepade gånger söka igenom alla z avbildningsplan) upplösning avbildning. Dubbelskikts modeller har ett plant topologi som ger optimal Spatiotemporal avbildningsupplösning, men är också mycket förenklade, icke-fysiologiska och styvt. Denna endotelceller modellen kombinerar den plana topologi lipidbiskikt med den fysiologiska substrat av ett klassiskt APC att leverera optimal rumsliga och tidsmässiga avbildning upplösning i en fysiologisk miljö.m / filer / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tidigare arbete har delvis kring dessa hinder genom utvecklings plana substratmodeller (dvs lipiddubbelskikt och antikroppsbelagda ytor) som ger optimala Spatiotemporal upplösning (dvs., via fastställande av cellaktivering ytan T till en och samma plan som är parallellt med den optimala xy avbildning planet) 11-15 (Figur 1B). Dessa modeller har underlättat viktiga insikter i de subcellulära / molekylära dynamik som styr antigen signalering i T-celler, inklusive upptäckten av dynamiska aktin / TCR signalering mikrokluster 7,11-14. Men sådana modeller inneboende förenklad, liksom stela (utgör hinder för utveckling / studie av 3-dimensionella topologiska funktioner) (Figur 1B). Därför är det osäkert hur man relatera dessa resultat till physiologic cell-cell-immunövervakning.
Men fortfarande understudied är vaskulära och lymfatiska endotelceller framstår som en stor (dvs större i antal än alla professionella APC, genom ~ 1000 gånger) periferiutrymme "halvprofessionella" APC 16-18. Dessa celler uttrycker MHC-I-, MHC-II och en mängd co-stimulator molekyler (t.ex., CD40, LFA3, ICOSL, 4-1 BB, OX40L, TL1A, PD-L1, men inte CD80 och CD86) och är strategiskt placerad vid blodvävnads gränssnitt där de tjänar specialiserade kontrollfunktionerna 16-18. Tidigare studier har visat att endotelceller kan effektivt åter stimulera effektor / minne, men inte naiva, T-celler 19-25. Sålunda endotelceller är sannolikt att spela unika APC roller i effektorfasen av adaptiva immunresponser inom de perifera vävnader, såsom lokalt inflytande på T-cellsaktivering, differentiering, minne och tolerans 16,17,26. Critiskt, när den odlas in vitro, endotelceller bildar nästan plana cellytor och är lätt transfekterbara (t.ex. med fluorescerande protein reportrar). Dessa funktioner är idealiska för hög Spatiotemporal upplösning avbildning av topologiska dynamik under cell-cell-interaktioner 19,27. Således endotelceller kan tjäna som en fysiologisk "plana cell APC modell klart lämpad för studier av de subcellulära / molekylära remodeling mekanismer som driver antigenigenkänning och reglerar svar (Figur 1C) 19,20.
Tidigare etablerade kompletterande avbildningstekniker (inklusive transfektion av endotel celler med fluorescerande protein skaparna av plasmamembranet och cytosolen) för att studera detaljerna i leukocyt-endotel interaktion under vidhäftning och transendotelial migration 27, visade att leukocyter sond aktivt yta endotel genom dynamisk insättnings end indragning av sub-micron skala, aktin rika cylindriska utsprång (~ 200-1000 nm i diameter och djup) kallas invadosome liknande utsprång (dvs "IUP) 27,28. Dessa avbildning har utökats ytterligare tillsammans med skapandet av protokoll för att dra nytta av endotel APC-funktion för att utveckla de första metoderna för hög Spatiotemporal upplösning avbildning av T-cells endothelial immunologisk synaps som rapporterats 19,20 och ytterligare beskriver häri. En central slutsats härrör från denna nya plana cellulära APC-modellen är att T-cell IUP fungera både för att främja inledande Ag upptäckt och för att upprätthålla efterföljande signalering. I själva verket, kedjor av flera IUP (som stabiliserats och upplupna som svar på initial kalciumflöde) visar anrikning i TCR och molekyler som tyder på aktiv signalering sådan PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrosin och HS1. Därför IUP verkar representera en tre-dimensionell fysiologisk motsvarande TCR-signalering mikrokluster sett i plana dubbelskiktsmodeller. Detta tillvägagångssätt således känsligt avslöjar / rapporter molekylära och arkitektoniska (och underförstådda biomekaniska) dynamik annars inte upptäckas.
Den metod som beskrivs i detta dokument ska vara till nytta för att överbrygga klyftan mellan professionella APC och konstgjorda APC substrat modeller för att förbättra vår förmåga att förhöra grundläggande mekanismer adaptiva immunsvar. Även här ligger fokus på aktivering av CD4 + Th1-typ effektor / minnescell, kan denna grundläggande strategi lätt modifieras för att studera ett brett spektrum av T-celltyper och Ags, såsom diskuteras nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök som beskrivs i detta protokoll genomförs med primära humana T-celler och kommersiellt tillgängliga primära humana endotelceller (dermalt eller lung mikrovaskulära EC) .Any forskningsprotokoll på människor måste godkännas av en institutionell översyn ombord och skriftligt informerat samtycke måste tillhandahållas från varje blodgivare. Experiment utförda med hjälp av detta protokoll godkändes av IRB av Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Förbereda Human CD4 + Th1 Effector / Memory T-celler
- Applicera tryckförband till armen av givare, torka ven med alkohol och sätter nålen. Sakta drar 15 ml blod i Vacutainer använder EDTA som antikoagulant. När blodet har tagits, knyta stasen innan du tar bort nålen. Omedelbart utöva påtryckningar för att sår med steril gasbinda när nålen tas bort.
- Överför blodet till en 50 ml rör. Lägg RPMI-1640 vid RT på en 1: 1 utspädning (slutlig volym 30 ml). Försiktigt overlay den utspäddad blod på två 50 ml rör innehållande 15 ml av förfiltrerad lymfocyter isoleringsmedium såsom Ficoll-Paque vid RT.
- Centrifugera gradienten vid RT i 30 min vid 1200 x g i en svängande hink rötor. Medan centrifugering förbereda T-cell-medium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penicillin / streptomycin).
- Vid avlägsnande av 50 ml rör från centrifugen, observera fyra skikt: en pellet av röda blodceller i botten, den paque, ett skikt av celler, som innehåller vita blodkroppar (inklusive lymfocyter) och plasman. Ta försiktigt bort den vita blodkroppsskikt med en pasteur-pipett och överföring i en 50 ml Falcon-rör.
- Tvätta den vita blodkroppsskiktet genom tillsats RT RPMI-1460 (upp till 20 ml) och centrifugering vid RT under 5 min vid 1200 x g. Resuspendera vita blodkroppar i 1 ml T-cellmedium. Tillsätt 5 pl av en ml cellsuspension till 250 | j, l-T-cellmedium i en 1,5 ml centrifugrör och blanda försiktigt upp och ned med pipett.
- Tillsätt 25 | il utspäddd cellsuspension till 25 pl 0,4% Trypan blå. Tillsätt 10 pl av blandningen till vardera sidan av en standard-hemocytometer.
- Placera hemocytometer på en låg effekt ljusmikroskop. Med hjälp av en 10X mål räkna antalet levande celler som har uteslutit Trypan blå färg och är närvarande i mitten torget i båda sidor av hemocytometer.
- För att beräkna cellkoncentrationen, multiplicera genomsnittet av de 2 rutor med 100 (spädningsfaktor) och sedan multiplicera med 10 4 för att ge antalet celler / ml.
- Justera den slutliga koncentrationen till 0,5 x 10 6 celler / ml i T-cellmedium. Lägg till en slutlig koncentration av 1 | j, g / ml vardera av bakteriella superantigener stafylokockenterotoxin B (SEB) och toxisk chocksyndrom toxin 1 (TSST) och cellerna. Kultur för 72 h (37 ° C och 5% CO2) för att expandera CD4 + T-cellpopulationen.
- Pellets T-celler (1200 xg, 5 min) och resuspendera vid 0,5 x 10 6 celler / ml i T-cell-medium medtillsats av humant IL-15 (20 ng / ml). Överföring lymfocyter till en T150-kolv. Fortsätter att expandera / dela celler i sin helhet på medellång IL-15 var 24-48 timmar som behövs (baserat på media färg, dvs när media vänder från rosa till svagt gul) därefter. Behåll den resulterande lymfocytpopulationen i upp till 15 dagar.
OBS: Genom design, kommer detta protokoll aktivera och expandera särskilt delmängd av CD4 + T-celler som är reaktiva mot SEB och TSST och sedan köra dem mot en Th1-liknande effektor / minne fenotyp. Andra vita blodkroppar inte att överleva och växa under dessa betingelser, så att för steg 1,10 cellerna kommer att vara minst 95% CD4 *, CD45RO + T-celler 19, såsom kan lätt bedömas genom flödescytometri. Om så önskas kan ytterligare rening lätt uppnås genom kommersiellt tillgänglig antikropp / magnetisk-pärla baserade positiva eller negativa selektions kit.
2. Starta Primary humana Endothelial Cell Culture
<ol>3. Allmänna Uppdelning och utbyggnad av endotelceller
- Odla celler till ~ 90-95 konfluens. Detta kan ta 2-5 dagar. För delning,ta bort media och skölj med PBS. Ta bort PBS och ersätt med minimal volym av färsk 1x trypsin (0,5 ml för T25 eller 1,5 ml för T75). Snurra försiktigt för att täcka alla yta med trypsin. Inkubera vid 37 ° C under ~ 5 min. Övervaka avskiljandet av cellerna från plattan med hjälp av en låg effekt ljusmikroskop.
- När majoriteten av celler verkar rundade eller fristående, tillsätt 5 volym (dvs jämfört med trypsin tillsatta volymen) förvärmda komplett EGM-2-medium och försiktigt pipettera över ytan av kolven för att frigöra alla cellerna.
- Räkna endotelceller med en hemocytometer, såsom beskrivs i 1,6-1,7. Pellets cellerna genom centrifugering (5 min, 1200 xg). Avlägsna supernatanten. Justera koncentrationen till 0,5 miljoner celler per ml genom tillsats av förvärmda komplett EGM-2 MV media.
- Överför alikvoter av celler till lämpliga FN-belagda rätter eller flaskor för underhåll. Snurra försiktigt och placera i inkubatorn. Ändra media inom 6-12 timmar av plätering. Medie should ändras ungefär var 48 h därefter.
4. Endothelial Cell Transfektion
OBS: Primär endotelceller är terapiresistenta transfektion av de flesta vanliga kemikalier och elektroporation metoder. Kärn transfektion baserade metod som beskrivs nedan medger relativt hög transfektionseffektivitet (~ 50-70%). Ett effektivt alternativ metod är användningen av infektion genom lämpliga virala vektorer (se kommentarer i Material tabell).
- Förbered T25 eller T75-kolvar (efter behov) av HLMVECs eller HDMVECs till en slutlig densitet av 90 till 95% confluency.Coat med fibronektin (FN) 20 ug / ml i PBS under sterila förhållanden antingen mikroskop odlingsplattor som Delta-T-plattor (för steg 5) eller 12 mm cirkulära täckglas placerade inuti en brunn på en 24-brunnars cellodlingsplatta (för steg 6) med som beskrivits ovan (2,1).
- Tillsätt 1 ml av komplett EGM-2 odlingsmedia till mikroskop kultur platesor 0,5 ml till varje 24 brunn och jämvikta plattor ien fuktad 37 ° C / 5% CO2 inkubator.
- Skörd och räkna endotelceller såsom i stegen 3.1-3.3.Centrifuge den erforderliga volymen av celler (0,5 miljoner celler per prov) vid 1200 xg under 5 min vid RT. Resuspendera cellpelleten försiktigt i 100 pl RT kärn transfektion lösning per prov.
- Kombinera 100 il cellsuspensionen med 1-5 pg DNA. Överför cell / DNA suspensionen i certifierade kyvett; prov får täcka botten av kyvetten utan luftbubblor.
OBS: Konstruktioner som riktar YFP eller DsRed till cellmembranet (genom de N-terminala 20 aminosyrorna av neuromodulin som innehåller en signal för posttranslationell palmitoylering) användes enbart (membran-YFP enbart eller membran DsRed enbart) eller samtransfekterades med ett cytoplasma volymetriska markör (t.ex. membran YFP och löslig DsRed). Många permutationer av fluorescerande proteinmarkörer kan användas. - Stäng kyvetten med locket. Sätt i kyvett medcell / DNA suspensionen i kuvetthållaren av elektroporator och tillämpa elektroporering programmet S-005. Ta kyvetten ur hållaren när programmet är avslutat.
- Lägg ~ 500 pl av förjämviktad odlingsmedier till kyvetten och försiktigt bort cellsuspensionen från kyvetten med hjälp av plastöverföringspipetter som finns i kärn transfektion kit.
- För experiment med mikroskop odlingsplattor partitionera cellsuspensionen från en reaktion lika mellan två rätter som innehåller förvärmda media (Steg 4,2-4,3). För experiment med användning av 24 brunn / platta, skiljeväggen en reaktion lika mellan 3 brunnar.
- Inkubera cellerna i en fuktad 37 ° C / 5% CO2 inkubator och byta media 4-6 h, och igen vid 12-16 h efter transfektion.
5. Levande cell imaging och analys
- Förbereda endotelet
- Dag 0: Co-transfektera primära HLMVECs med membran YFP och löslig DsRed via en nucleofeInsatser teknik som beskrivs i steg 4 och plattan på levande cell imaging odlingsplattor.
- Dag 1: Byt medium med färskt medium innehållande IFN-γ (100 ng / ml) för att inducera MHC-II-expression. På dag 2. Stimulera transfekterade celler genom tillsats av 20 ng / ml TNF-α till den befintliga mediet.
- På dag 3, inkubera endotelet med en ^ g / ml vardera av bakteriella superantigener stafylokockenterotoxin B (SEB) och toxisk chock-syndrom-toxin 1 (TSST) vid 37 ° C under 30-60 min omedelbart före experiment. Hoppa över detta steg för "-Ag" kontrollförhållanden.
- Framställning Lymfocyter
- Parallellt med steg 5.1.3, förbereda buffert A (fenolrött-fri HBSS) med tillsats av 20 mM Hepes, pH 7,4 och 0,5% volym / volym humant serumalbumin förvärmas till 37 ° C. Ta ett prov av odlade lymfocyter och bestämma densiteten genom räkning med en hemocytometer (steg 1,12-1,17).
- Centrifugera 2 miljoner celler per prov på 1,200 xg under 5 min vid RT i en 15 ml koniskt rör. Aspirera media och försiktigt resuspendera cellpelleten i 2 ml buffert A så att inga cellkluster kvar.
- Avlägsna en färsk alikvot av Fura-2 kalcium färgämne och återsuspendera i DMSO för att göra en förrådskoncentration av 1 mM.
- Lägg 2 pl av Fura-2 förrådslösning till cellsuspensionen T (2 ^ M slutlig koncentration), lock på röret och blanda omedelbart genom att vända röret för att säkerställa jämn dispersion av färgämnet. Inkubera vid 37 ° C i 30 minuter.
- Centrifugera som i steg 5.2.2. Aspirera buffert-A och försiktigt men grundligt tersuspendera lymfocyter i 20-40 pl av färskt buffert-A.
- Live-cell imaging Setup och Acquisition
OBS: Ett brett utbud av system kan användas för live-cell fluorescens avbildning på upprätt och omvänt ljusmikroskop. Grundkrav inkluderar en fluorescens ljuskälla och filter, en CCD-kamera, motoriserade filter växling och fönsterluckor, en uppvärmd skede (eller Microscope-monterbar uppvärmd kammare) och programvara för automatisk bildtagning. För detta protokoll hög numerisk öppning, hög förstoring (dvs, 40X, 63x) oljedopp linser krävs för att uppnå den nödvändiga rumsliga upplösningen. Särskild försiktighet måste iakttas vid val av lämplig fluorescenskällan och linser för Fura-2-baserade kalcium avbildning som inte alla är förenliga med de nödvändiga 340/380 nm excitationsvåglängder. Ett alternativt tillvägagångssätt (kompatibel med vanliga gröna och röda fluorescens filteruppsättningar) kan användas med icke-ratiomentic kalciumkänsliga färgämnen (t.ex. Fluo-4, Rhod-3), även om dessa inte exakt kan kvantifiera kalciumflöde och bara ge en släkting / kvantitativ avläsning.- Slå på mikroskopsystemet (PC för drift, mikroskop, CCD-kamera, filterhjul och xenonlampa).
- Öppna den utsedda programvara.
- Ställ in mikroskop / mjukvara för automatiserad flerkanalig time-lapse avbildning. Inkludera sekventiell förvärv av annonsifferential interferenskontrast (DIC), standard grön fluorescens, standard röd fluorescerar och standard 340 och 380 nm excitation Fura-2 bilder. Ställ in intervallet för förvärv för 10-30 sekunder och en total varaktighet på ~ 20-60 min.
- Ställ in exponeringstider för Fura-2 avbildning.
- Lägg till ny objektiv olja och montera ett mikroskop skål innehållande endast 0,5 ml av buffert-A på värmesteg adaptern och sväng omedelbart till jämvikt till 37 ° C (tar ~ 2-3 min).
- Lägg vila fura2-laddade lymfocyter till den monterade mikroskop skålen kammaren med hjälp av en 20 l pipett.
- Aktivera ljusa fält avbildning. Välj ljusvägen till okularen. Använd den grova fokus ratten för att sätta mål i kontakt med botten av miscoscope skålen. Använd okularet och på finfokuseringsvredet att fokusera på de T-celler regleras på botten av skålen.
- Använd kontrollerna xy scenen för att välja ett fält som innehåller minst 10 celler. Undvikaöverbefolkade områden och cellklumpar som dessa kommer att skapa avbildningsartefakter.
- Växla från ljust fält att fluorescerande ljuskälla. Växla från okularet avbildning till CCD-kamera. Ställ ackvisitionsparametrar (t.ex. exponeringstid, detektor förstärkning och binning). Med hjälp av programvaran förvärva vila Fura2-340 och Fura2-380 bilder (som börjar med samma exponeringstid för varje, vanligtvis inom intervallet ~ 200-1000 ms).
- Använd de metoder som beskrivs i Steg 5.4.1 att beräkna Fura2-340 / Fura2-380 för varje lymfocyt. Utför upprepade iterationer av att justera Fura2-340 och Fura2-380 exponeringstider, hämta bilder och beräkna nyckeltal tills medelvärdena ligger nära 1.
- Ställ in exponeringstider för mem-YFP och DsRed.
- Byt mikroskop skålen används i steg 5.3.3.1 med en mikroskop maträtt innehållande transfekterade, aktiveras och SAg behandlade (eller obehandlade, kontroll) HLMVECs eller HDMVECs från cellodlingsinkubator (steg 4.5.1). Använd en engångs överföringspipett att snabbt ta bort media, skölj en gång genom tillsats av ~ 1 ml förvärmda buffert-A. Aspirera och sedan lägga 0,5 ml buffert-A.
- Identifiera områden där ljust fluorescerande positiva transfektanta endotelceller är närvarande och verkar friska med välformade inter korsningar.
- Justera ackvisitionsparametrar (t.ex. exponeringstid, detektor förstärkning och binning) för mem-YFP och DsRed. Se till att medelfluorescenssignalintensitet i varje kanal ligger mellan 25% och 75% av det dynamiska området hos detektorn.
- Ställ in exponeringstider för Fura-2 avbildning.
- Genomför levande cell imaging experiment.
- Använd automatiserade program för att börja bildtagning och fånga flera intervall av bilder för att fastställa baslinjen.
- Tillämpa ~ 5 ul koncentrerade Fura-2-laddade lymfocyter (från steg 5,2) till mitten av mikroskop skålen bildfältet Under förvärv genom att föra in spetsen av en liten volym (P-5eller P-20) pipetten i media nära centrum av målet och utkast långsamt.
- Som lymfocyter bosätta sig i bildfältet, göra finjusteringar i fokus för att säkerställa att cell endotel cellgränssnitt T (immunologiska synapser) bibehålls i fokalplanet. Med 40 och 63x mål, ~ 10-20 celler per fält är optimala. Om färre celler observeras i bildfältet upprepa steg 5.3.4.2.
- Efter den önskade observationsintervallet av experiment tävlade, fortsätta avbildning och omedelbart pipett jonomycin direkt i miscoscope skålen (med användning av teknik som i 5.3.4.2) till en slutlig koncentration av 2 | iM för att inducera maximal kalciumflöde / Fura-2 signaleringssignalen (dvs. , ett medel för kalibrering, Se analys 5.4.).
- Som ett alternativ till 5.3.4.4after den önskade observationsintervallet av experiment tävlade, omedelbart aspirera Buffert-A och ersätta det med 0,5 ml fixeringslösning (3,7% formaldehyd i PBS) under 5 min vidRT, följt av sköljning tre gånger med PBS. Fortsätter sedan till steg 6.
- Analys av Live-cell imaging
OBS: När du har sparat förvärvade filer, kan de analyseras direkt eller exporteras för analys av ett brett utbud av off-line bildanalys program. ImageJ är en särskilt värdefull, mångsidig paket som är fritt tillgängliga och kompatibla med nästan alla förvärvsprogrampaketet. Utformningen av imaging experiment som beskrivs i steg 5.1-5.3 kommer att ge höga rumsliga och tidsupplösning dynamiken av interaktioner mellan lymfocyter och endotel APC i frånvaro och närvaro av besläktad SAg. Nästan obegränsade analyser är möjliga när man behandlar bilddata av cellulära morfometrisk / signaleringsdynamik. De särskilda mål som beskrivs i detta protokoll är att koordinerat kvantifiera lymfocytmigration och signalering (dvs, kinetik och nivåer av intracellulär kalciumflöde) tillsammans med dynamiskal förändringar i den immunologiska synapsen arkitektur med fokus på specifika egenskaper (dvs. IUP / Podo-tryck). Följande är exempel på separata standard och icke-standard (dvs, som utvecklats speciellt för dessa experiment / frågor) analyser.- Mät Lymfocyt kalciumflöde
- Välj första Fura2-340 (340 nm EX-510 nm EM) och Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) bilder som förvärvades före tillsats av lymfocyter. Använd dessa som bakgrundsbilder och digitalt subtrahera dem från alla bilder i tidsserien för respektive kanal.
- För varje tidpunkt skapa en digital förhållande bild av bakgrunden korrigerad Fura2-340 och bakgrundskorrigerad Fura2-380 bilder (dvs 340 nm EX-510 nm EM-bakgrund / 380 nm EX-510 nm EM-bakgrund).
- Välj rätt verktyg programvara ritning. Klicka på skärmen för att rita en cirkulär region intresset (ROI) runt varje lymfocyt. Dessa kommer att generera en pixelmedelvärdeskvotvärde för varje lymfocyt och tidsram.
- Plotta beräknade förhållandet såsom en funktion av tiden med användning av lämpligt program (t.ex., kalkylprogram). Beräkna medelvärde kalciumflöde för experimentet genom att summera kvotvärdena av alla lymfocyterna per fält och dividera detta värde med det totala antalet lymfocyter för varje tidpunkt
- Genomföra lympocyte spårning migrationsanalys.
- Analysera cell T-cell migration med hjälp av en lämplig spårning cell program (t.ex. ImageJ) med hjälp av DIC kanalen från varje video. Använda ImageJ Cell Tracking Plugin identifiera i varje ram tyngdpunkten för varje cell manuellt genom att klicka på den i varje progressiv bild.
- Använd de resulterande serie xy-koordinater (dvs spår av migrationsvägar) för att beräkna medelhastigheten (total sträcka migrerade / totalt intervall of imaging) och slingrighet (totala sträckan migrerade / den linjära end-to-end avståndet mellan cellposition i den första och sista bilden).
- Kors korrelerar dessa parametrar med kalciumflöde (5.4.1) dynamiken på en cell-för-cell-basis.
- Bedöma Podo-trycket / ILP Densitet inom IS
- Räkna totala antalet ILP bildad i varje T cell definieras intervall (t.ex. 5 min efter tillsats av T-celler). Dessa kan identifieras diskret micron skala fluorescerande membran-YFP ringar som samar lokalisera med mörka ringar i cytoplasma DsRed på endothelial APC på ett ställe för lymfocytadhesion.
- Korskorrelera de resulterande "ILP index" med kalciumflöde (5.4.1) dynamiken på en cell-för-cell-basis.
- Mät Podo-trycket / ILP livstid.
- För varje Podo-trycket / IUP i en given IS beräkna sina livstid som den sista tidpunkten då en ILP var synlig - tidpunkten när den Podo-trycket / ILP fiförsta dök upp. Genomsnittlig ILP livstid både per IS.
- Kors korrelerar livslängderna med kalciumflöde (5.4.1) dynamiken på en cell-för-cell-basis.
- Bedöm tidsförhållandet mellan första ILP bildning och kalciumflöde.
- För varje lymfocyt identifiera tidpunkten (ram) där kalcium först stiger över baslinjen 19.
- För varje lymfocyt identifiera tidspunkten vid vilken den första Podo-trycket / IUP visas.
- För varje lymfocyt beräkna en "förskjuten tid" genom att subtrahera den initiala kalciumflöde tidpunkt från den hos den initiala Podo-trycket / ILP. Det genomsnittliga värden för alla lymfocyter i ett fält. Positiva värden indikerar ILP bildningen föregår kalciumflöde medan negativa tal indikerar motsatsen.
OBS: kan Dessa experiment lätt utföras under fysiologiskt relevant laminärt skjuvflöde användning av kommersiellt tillgängliga parallellväggflödes imaging kammare som beskrivs 19.
- Mät Lymfocyt kalciumflöde
6. fast cell imaging och analys
- Fast endpoint T-cell-endotel IS bildning och färgning
- Förbered T-celler såsom beskrivits i 1. Preparera endotelceller (- / + SAg) som i steg 5,1 (transfektion, är valfri Steg 5.1.1). Ta ett prov av odlade lymfocyter och bestämma densiteten genom att räkna med en hemocytometer (avsnitt 1).
- Överför en lymfocytkultur volym ekvivalent med åtminstone 3 x 10 5 lymfocyter / provet till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 200 xg under 3 min. Avlägsna supernatanten och suspendera lymfocyter pelleten i buffert-A (steg 5.2.1) koncentration av 6 x 10 5 lymfocyter / ml.
- Ta endotelcellerna från cellodlingsinkubator och (fortsätter ett prov åt gången) successivt Aspirera media och ersätta med 0,5 ml lymfocytsuspensionen (3 x 10 5 lymfocyter / prov) och byt till 37 ° C ^ncubator.
- Efter lämpliga inkubationstider, nämnts ovan, aspirera mediet från brunnarna och tillsätt tillräckligt Fixative Solution (3,7% formaldehyd i PBS) för att helt täcka provet (t.ex. i 24 brunnar ~ 300-500 l). Inkubera vid rumstemperatur under 5-10 minuter.
- Skölj prov 3 gånger med PBS. Fläck genom tillsats primär antikropp under 60 min vid RT (se lista). Om den primära antikroppen är riktad till ett intracellulärt protein, måste ett ytterligare permeabilization steg som ska utföras genom att tillsätta tillräcklig permeabilization lösning (0,01% TritonX-100 i PBS) för att fullständigt täcka provet under 1 min vid rumstemperatur. Skölj prov 3 gånger med PBS. Lägg till lämpliga sekundära antikroppar (i vissa fall samtidigt fluorescerande phalloidin) för 60 min vid RT.
- Montera den cirkulära glastäckglas på en avbildnings bild. Fast slutpunkt T-cell-endotel IS bildning och färgning. Till att börja imaging plats avbildningsglid innehåller prover på mikroskop scenen och välj 63X oljamål. Applicera färsk immersionsolja.
- Använd ljusfält bildåtergivningsläge och ögonlinser för att lokalisera fokalplanet. Växla till epifluorescence och inspektera provet via okulära linser. Välj ett intresseområde. Växla till laserskanningsläge.
- Använda snabbskanningsläge och arbetar i största fältet möjliga individuellt justera lasereffekten och vinst på varje kanal för att optimera signalen så att, helst, når det specifika signalintensiteten åtminstone ~ 25% och högst 75% av det dynamiska omfånget av detektorerna.
- Använda manuella fokuskontrollerna, snabbt skanna igenom Z-axeln och identifiera de övre och undre gräns för sektionering (typiskt all information bör ingå i en tjocklek på ~ 15 pm). Välj Z-axeln snittjocklek i intervallet ~ 0,2-1,0 pm.
- Slutligen, zoom / beskära bildfältet till den specifika regionen av intresse och beteende scan. Förutom att ha mycket ljusa och specifik fluorescens signal i provet, förvärva hög upplösning 3D-avbildning kräver iterationer av scanning och göra justeringar ackvisitionsparametrar. Målet är att erhålla maximal xy och z-axel upplösning, utan märkbar fotoblekning.
- Kvalitativt analysera topologi 3D topologi IS genom att utföra digital 3D-rekonstruktion av de resulterande optiska snitt genom ett lämpligt program (t.ex. Bild J). Genom liknande program kvantitativt bedöma fluorescenssignalen fördelning (t.ex. Pearsons samlokalisering och korrelat fluorescensintensiteten line-scan analys och ortogonala visning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En ny avbildningsteknik med hjälp av endotelceller och kombinera upplösning fördelarna med plana lipidbiskikt modell med den fysiologiska komplexitet och deformerbarhet professionella APC utvecklades (Figur 1). Figur 2 ger exempel på typiska migration, kalciumflöde och topologiska dynamik observerats med detta närma sig. I avsaknad av SAg på endotel, SAg-specifika CD4 + Th1-lymfocyter snabbt spridas, polarisera och sidled migrera över endotelytan (Figur 2A) utan mjukning kalcium (ej visad). Inom ~ 5-10 min dessa lymfocyter initiera trans över endotelet. I närvaro av SAg lastning på endotel, lymfocyter sprids symmetriskt med en "stekt ägg" topologi, initiera ihållande (dvs under 30-60 min) intracellulär kalciumflöde (Figur 2B, Movie 1) under vilken tid de uppvisarliten eller ingen migration (figur 2C).
Figur 2. Live Cells Analys av T-cellsaktivering och Migration och immunologisk Synapse topologi Endothelial APC. (A) Paneler visar ett exempel på tidsserie avbildning av T-cell migration på endotel i frånvaro av SAg. Övre panel visar DIC bilder. Den initiala positionen för den vandrande T-cell indikeras av den röda streckade linjen. Lägre Panelen visar invaginationer bildas på endotel genom migrationen T-cellen. Pilar indikerar bildning av transienta ringar (~ 0,5-1 | im diameter) av membran YFP fluorescens bildas som ett resultat av T-cell generation 'invadosome liknande utsprång "(ILP) mot endoteliala APC-ytan (se L). (B) visar ett exempel på en liknande serie i närvaro av SAg belastad endotel (vänster; Se ävenmotsvarande film 1) och kvantitativ spår av de dynamiska förändringar i kalciumnivåer (höger). Pilar indikerar initiala IUP formation som korrelerar med initieringen av kalciumflöde (i) och efterföljande stabilisering av multipla IUP som korrelerar med hög kalciumflöde (ii). (C) Experiment som i A och B utsattes för cellspårningsanalys. DIC bilder på vänster visar representativa T-cellmigrationsvägar över varaktigheten av 10 min (röda spår). Diagram till höger visar de beräknade migrationshastigheter i frånvaro och närvaro av SAg. (D) Dynamisk analys av immunologisk synaps topologi (modifierad från 19). Schematisk (i) visar en känslig endotelcell / APC "topologi reportersystem" som består av membran inriktade-YFP och löslig cytosoliska RFP. Aktin-medierad ILP som skjuter in den endothelial cellytan generera cylinderformade invaginationer (en typ av cellulär fot-print, kallas en "Podo-print") giving upphov till skarpt böjd membran som visas som ringar av membran-YFP fluorescens (dvs., de cylinderns väggar sett en face). Cytosol förskjutning och uteslutning vid dessa loci visas som mörka cirklar av cytosoliskt RFP. DIC och fluorescens bilder i (ii) visar ett exempel på en sådan analys i närvaro av SAg (Se även motsvarande film 2). En enda inledande Podo-trycket / ILP utvecklas till en rad> 20 stabiliserade IUP över 15 minuter. Blå rutan på 15 min (iii) visar en högupplöst bild av en enda Podo-trycket / ILP varvid en ring av membran YFP lappar med ett område av uteslutas cytosoliska RFP. Streckad linje (iv) visar en kvantitativ linjeanalys av fluorescensintensiteter. Skalstrecken = 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som tidigare fastställts, lymfocyter actively sond yta endotel genom att utvidga aktin och HS1 (en cortactin homolog) -berikat och WASp- och src beroende utsprång kallas "invadosome liknande utsprång; (IUP, varje ~ 0,5-1 um djup i diameter) 27,28. Transfektion av membran riktade fluorescerande protein (FP) har visat sig ge mycket känsliga reportrar för subcellulära topologiska dynamik på cellcellytor. På detta sätt har det visat sig att ljusa ringar av fluorescerande membran-FP är indikativa för membran böjning under T-cell-endotel interaktion till följd av T-cell IUP utsprång. Det visas här, och i tidigare studier 19,20, att medan små kluster av IUP formuläret och omsättning snabbt (dvs., livstider av ~ 10-30 sek) under lateral migration av T-celler på endotel i frånvaro av SAg (Figur 2A ), blir de mycket stabiliserat (dvs livstid ~ 30 min) och samlas i täta rader i närvaroSag (Figur 2B). Vidare analys av IUP och kalcium initiering kinetik ("Offset tid") visar att IUP föregå kalciumsignalering, vilket tyder på att de stöd i erkännandeprocessen MHC-II / Ag (Figur 2Bii). Dessutom stabiliserad IUP matriser bildar proportion maximal kalciumflöde (Figur 2Bii). Tanken att ringarna av membran fluorescens motsvarar T-cell utsprång kör diskreta invagination fläckar i endotelceller APC, bekräftas av demonstrationen att dessa ringar i samtliga fall korrelerar rumsligt och kinetiskt med zoner av fördrivna / uteslutits cytoplasman (som rapporterats av lösligt DsRed; Figur 2D och Film 2).
Figur 3 ger exempel på fasta endpoint konfokala imaging studier. Efter 10 min av samtidig inkubation i närvaro av SAg, ISS bildas mellan T-celler och endotelceller APC avbildades genom fixering, immuno-fluorescens färgning och konfokalmikroskopi. Dessa studier ger analys av subcellulära distributions dynamiken i kritiska molekyler och signalverksamhet inom ISS särskilt förhållande till IUP. Specifikt cytoskelett / cytoskelettala regulator (aktin, VS1; figur 3A), antigenpresentation / erkännande (CD3 / MHC-II, figur 3B) vidhäftning (ICAM-1, LFA-1, talin; figur 3C), och antigena signalering (PKC Q, Figur 3D) ses att samarbeta anrikas i Podo-utskrifter / ILP. Digital rekonstruktion av konfokala serie avsnitt z-stackar ger kompletterande bevisning de som visas i figur 2D att T-cells endotel endotel IS har en diskret 3-dimensionell arkitektur avbryts av T-cells ILP skjuter ut i APC ytan (Figur 3Aii, Ci, iii, D). (Figur 3Civ).
Figur 3. Fast-Sample Analys av Molecular Distribution Dynamics i T-cell Endothelial Cell Immunologiska synapser. Lymfocyter inkuberades på SAg belastad endotel under 30 minuter och fixeras och färgas. I angivna paneler endotelceller var pre-transfekterade för att uttrycka membran YFP eller -DsRed. (A) Representativa avbildning visar aktin (i) och HS1 (en cortactin homolog, ii) sam-anrikad vid periferin av den immunologiska synapsen i mikrokluster som korrelerar med centrum för endoteliala fluorescerande ringar av membran YFP (dvs. ' Podo-utskrifter ", se figur 2D) bekräftar att T-cell IUP är ansvariga för uppkomsten av Podo-utskrifter. En sidovy (ii. 90 ° Projection) visar att IUP representerar 3-dimensionella utsprång i z avbildningsplanet (modifierad från 19). (B) Representativa anrikning av T-cell-TCR (i) och endothelial MHC-II (ii) inom immunologiska synapsen, visar diskreta subcellulära uppdelning till ILP / Podo-utskrifter. (C) (I) Representativa sam-anrikning av ICAM-1 och LFA-1 i Podo-tryck och ILP, respektive av IS. (i) visar en 3-D digital rekonstruktion av konfokala sektioner av IS roteras 60 ° (övre paneler) och 90 ° (ortogonal vy, lägre paneler). (ii) visar ett zoomat vy av IS en face. (iii) visar ett ortogonalt tvärsnitt av den inramade regionen i (ii) (modifierad från 19). (iv) representant co-anrikning av talin (en integtin / aktin bindande protein) och aktin i ÄR IUP. (D) representant co-anrikning av TCR signalmolekyl PKC-Q med aktin i ÄR IUP. Varje panel visar en en face vy (nedre vänstra delen) och två distinkta ortogonala vyer (90 ° Projektions). Längst till vänster och höger sida använder är kopior av deras, respektive angränsande paneler, beräknade med hjälp av en regnbåge fluorescence intensitetsskala (modifierad från 19). Skalstrecken = 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1:. Live-cell Dynamisk avbildning av T-cell Kalcium Signa och immunologisk Synapse Topologi Time-lapse levande cell imaging av fura2 belastad CD4 + Th1 lymfocyter interagerar med endotel uttrycker membran YFP och laddade med SAg, motsvarande figur 2B. Vänster panel visar intracellulära kalciumnivåer (regnbåge kyla färgar, låg kalcium, varma färger höga kalcium) i T-cell. Högra panelen visas membran YFP fluorescens på ytan av endotel APC. Lymfocyter ses att initiera spridning och ILP formation (sett via fluorescerande ringar i mem-YFP kanal, dvs "Podo-prints ', se figur 2Bi), följt av induktion av en ihållande (30-60 min) intracellulär kalciumflöde, vilket sker i proportion till bildning av perifera uppsättningar av IUP / Podo-prints analoga med TCR / aktin "signalering mikro klustrade" som ses i plana tvåskiktsmembran APC modeller (se figur 2Bii). Intervallet mellan bilderna är 20 sekunder. Klicka här för att se filmen.
Film 2: Live-cell Dynamisk avbildning av immunologisk Synapse topologi viEn fluorescerande Reportrar i Endothelial APC. Time-lapse levande cell imaging av CD4 + Th1 lymfocyter (DIC, vänster) interagerar med endotel samuttrycka membran YFP (grön) och lösligt cytosoliskt DsRed (röd) och laddade med SAg, motsvarande Figur 2D. Högra panelen visar sammanslagning av DIC, membran och cytoplasma signalering. De kombinerade signalerna av membran och cytoplasmisk fluorescens lyhört rapportera bildning och ombyggnad av flera ~ 0,2-1 um skala yta invaginationer (Podo-tryck) som är resultatet av matriser T-cells sondering med ILP utsprång. Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammantaget beskriver detta protokoll metoder för att undersöka endotelceller som i) understudied fysiologiska APC och ii) som en ny typ av "plana cellulära APC-modellen". När det gäller den förstnämnda, har det blivit allt mer uppenbart att icke-hematopoetiska perifera (eller "stromala) APC spelar kritiska, icke-redundanta roller (dvs jämfört med hematopoetisk APC) i utformningen av adaptiva immunsvar 16-18. Bland sådana "halvprofessionella" APC, vaskulära och lymfatiska endotelceller (som vida är fler än professionella APC) är bland de bästa uppskattade 16-18. Men detaljerna i signaleringshändelser och deras kopplade immunologiska synapser i stort sett outforskat. De metoder som beskrivs här utgöra grunden för att främja förståelse inom detta framväxande område. Exempelvis att tillämpa dessa metoder för studiet av ISS bildad på endotel från olika vävnad som är kända att uppvisa distinkta adaptive immunologisk funktion (t.ex. lever och lymfatiska endotel) kan vara särskilt lärorikt.
Betecknande hjälper denna metod för att överbrygga klyftan mellan professionella APC och konstgjorda APC substrat modeller för att öka förmågan att förhöra grundläggande mekanismer adaptiva immunsvar. Medan plana APC-substrat (dvs lipiddubbelskikt, antikroppsbelagda glas) ger optimal avbildning (vilket har lett till många kritiska insikter 7,11-14), sådana modeller till sin natur är begränsade. Alternativt, uppgifter om fysiologiska scanning cell-cell dynamik har hittills djupt skyms av orienteringsrelaterad imaging frågor 8-10. De avbildningsfunktioner som finns i den nuvarande strategin att övervinna detta hinder för att unikt avslöja annars odetekterbara tredimensionella subcellulär arkitektur och snabb ombyggnad av en fysiologisk APC-T-cell-gränssnitt. Dessa erbjudande potential för ny förståelse av antigen signaling.
Exempelvis uppskattning att T-celler bildar IUP berikade med TCR, aktin och signalmolekyler (t.ex., Figur 2D, Figur 3), tyder på att dessa representerar sannolikt den fysiologiska 3-dimensionella motparter till den plana TCR signalering mikrokluster observeras på artificiell APC substrat 6,7,12-14,29-31. Detta innebär att under fysiologiska inställningar kan lymfocyter anställa IUP som diskreta subcellulära "3D-reaktionsvolymer" med "signalosome' liknande egenskaper som förstärker och upprätthålla signalering genom att koncentrera viktiga molekyler / aktiviteter 32,33. Dessutom, närvaron av betydande biomekaniska ingångar (dvs cell-cell kraftapplicerings) på sevärdheter om ILP utsprång mot APC kan härledas från avbildning. Detta är nontrivial som mekaniska krafter alltmer ses som viktiga kontaktpersoner av antigen signalering, medan exakt hur sådana krafter ärmanifesterade fortfarande oklart 14,34-37.
Den totala betydelsen av denna modell som en rimlig ersättning för professionell APC stöds av vår direkta bevis att liknande ILP arrayer kunde ses i synapser bildas på EC och utvecklingsländerna (och i mindre utsträckning B-celler) när analoga avbildning användes (t.ex. , användningen av samma fluorescens beslutsfattare och kontroll av IS plan orienteringsplanet 19). Icke desto mindre, måste det anses att de relativa biomekaniska egenskaperna hos EG kontra professionella APC membranytorna är okända och att skillnader i denna parameter kan påverka uppgifter om IS topologi och antigena svar.
Nyckeln till det tillvägagångssätt som beskrivs här är starkt relaterad till dess upplösning fördelar. Detta i sin tur är starkt relaterad till styrkan hos den fluorescenssignal. Därför är det viktigt att ägna särskild uppmärksamhet för att optimera transfektion och färgning av fluorescent reportrar och bildparametrar / teknik (t.ex. exponeringstid, fokus, etc ...). När det gäller den förstnämnda, protokoll för levande cellstudier som här beskrivits är begränsad till transfektion av generisk membran och cytoplasmiska markörer som rapporterar topologiska förändringar på T-cellen-APC-gränssnitt i realtid (t.ex. Figur 2, Filmer 1, 2). Dessutom kan detta protokoll lätt modifieras till mer sofistikerad analys av samtidigt införande / imaging ytterligare reportrar i endotel (t.ex. fluorescerande protein-märkt MHCI / II och vidhäftning, co-stimulerande och co-hämmande molekyler och biosensorer för larm och biomekaniska dynamik). Olyckligtvis är emellertid ett allmänt begränsningen att lymfocyter är notoriskt svåra att transfektera. Detta utesluter bekväm användning av fluorescerande proteiner (t.ex. taggade till TCR, PKC-Q, etc) i T-celler för levande cell imaging.
Medandet nuvarande protokollet innebär aktivering av human effektor / minne CD4 + Th1 typ lymfocyter via SAg (ett vanligt modell), finns mycket bredare möjligheter. Som tidigare visats 19,20 detta tillvägagångssätt är lätt anpassas till ett brett utbud av andra inställningar såsom svaren från andra CD4 + delmängder och aktivering av CD8 + lymfocyter dödande svar. Genom isolering av lymfocyter och endotelceller från befintliga TCR-transgena stammar denna metod är också lätt anpassas för att studera svar på specifika peptidantigener 19,20. Slutligen den nuvarande strategin begränsas till undersökning av effektor / minnes T-celler. Men transfektion av endotelceller med de väsentliga samstimulerande molekyler (CD80 / 86, som normalt inte uttrycks på endotel) kan möjliggöra studier av naiva cell priming dynamiken i denna modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
- Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
- Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
- Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
- Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
- Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
- Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
- Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
- Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
- Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
- Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
- Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
- Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
- Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
- Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
- Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
- Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
- Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
- Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
- Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
- Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
- Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
- Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
- Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
- Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).
