Abstract
Adaptieve immuniteit wordt geregeld door dynamische interacties tussen T-cellen en antigeen-presenterende cellen ("APC's") genoemd "immunologische synapsen. Binnen deze intieme cel-cel-interfaces discrete sub-cellulaire clusters van MHC / Ag-TCR, F-actine, hechting en signaalmoleculen vormen en snel te verbouwen. Deze dynamiek wordt gedacht dat ze kritische factoren voor zowel de efficiëntie en kwaliteit van de immuunresponsen die zich ontwikkelen en dus van beschermende immuniteit tegen pathologische. Huidige begrip van immunologische synapsen met fysiologische APC's wordt beperkt door de ontoereikendheid van de verkregen beeldresolutie. Hoewel kunstmatig substraat modellen (bijvoorbeeld vlakke lipidendubbellagen) bieden een uitstekende resolutie en zijn zeer waardevolle hulpmiddelen geweest, ze zijn inherent niet-fysiologische en ongenuanceerd. Vasculaire en lymfatische endotheelcellen naar voren zijn gekomen als een belangrijke perifere weefsels (of stromale) compartiment van 'semi-beroepal APCs. Deze APC's (die het merendeel van de moleculaire machinerie van professionele APC's tot expressie) hebben de unieke eigenschap van het vormen nagenoeg vlak celoppervlak en gemakkelijk te transfecteren (bijvoorbeeld met fluorescente proteïne reporters). Hierin een fundamentele benadering van endotheelcellen als nieuw en fysiologische "vlakke cellulaire APC model" voor verbeterde beeldvorming en ondervraging van fundamentele antigene signaleringsprocessen uitvoering worden beschreven.
Introduction
T lymfocyten een tak van het adaptieve immuunsysteem gekenmerkt door het vermogen om efficiënt te herkennen peptide-antigeen (Ag) gebonden aan major histocompatibility complex (MHC) moleculen door hun T-celreceptoren (TCR's) 1. Naïeve lymfocyten constitutief migreren en scannen 'professionele Ag presenterende cellen (APC's, bijvoorbeeld, dendritische cellen) in lymfeklieren, terwijl het geheugen / effector-T-cellen nodig hebben om effectief te overzien een zeer breed scala van APC's en potentieel doelwit cellen in perifere weefsels.
In de min na de eerste opname van verwante Ag op een APC, lymfocyten arresteren hun migratie en beginnen aan een gespecialiseerde intieme cel-cel-interface genaamd 'immunologische synaps' vormen (IS). Aanhoudende (dwz 30-60 min) IS contacten nodig zijn om te versterken en te ondersteunen signalering 2-7. Opkomende studies identificeren die binnen de IS, is de continue vorming en snelle remodeling van discrete sub-cellulaire signalering micro-clusters (dwz bevattende MHC / Ag-TCR, F-actine, adhesie en signaalmoleculen) de sterkte en de kwaliteit van de verkregen immuunreacties 07/02 bepalen. Echter, dynamische details en regulerend mechanisme van dit proces onvolledig begrepen 8,9. Dit vloeit grotendeels voort uit de technische uitdagingen in verband met onregelmatige topologieën van APC oppervlakken en slecht gecontroleerde oriëntatie van de cel-cel interactie vliegtuigen, kwesties die diep beperken de vereiste spatiotemporele imaging benaderingen 8-10 (Figure1A).
Figuur 1. Een Fysiologische Planar Cell APC Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics. Het schema illustreert traditionele beeldvorming van immunologische synaps tussen een T-cel en een professio nal APC (A) en T-cel en een traditionele vlakke lipide dubbellaag APC model (B) in relatie tot deze nieuwe endotheliale vlakke APC model (C). Professionele APCs bieden fysiologische immunologische synapsen maar bieden weinig georiënteerde cel-interface (dat wil zeggen ten opzichte van de optimale xy beeldvlak; resolutie ~ 0,2 pm), die dramatisch compromissen ruimtelijke (z beeldvlak resolutie ~ 1 micrometer) en tijd (dat wil zeggen, vanwege de noodzaak om herhaaldelijk gescand door alle z beeldvlakken) oplossing van beeldvorming. Bilaag modellen hebben een vlakke topologie die optimale spatiotemporele beeldvorming resolutie voorziet, maar ook sterk vereenvoudigd, niet-fysiologische en rigide. Deze endotheelcellen model combineert de vlakke topologie van lipidendubbellagen met de fysiologische substraat van een klassieke APC om een optimale ruimtelijke en temporele beeldvorming resolutie leveren in een fysiologische omgeving.m / files / ftp_upload / 53.288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vorige werk is gedeeltelijk omzeild deze obstakels door het ontwikkelen vlakke ondergrond modellen (dwz lipidendubbellagen en antilichaam-gecoate oppervlakken) die optimale spatiotemporele resolutie (dwz bieden, via de vaststelling van de T-cel activatie oppervlak in een enkel plan dat parallel aan de optimale xy beeldvorming vliegtuig) 11-15 (Figuur 1B). Deze modellen hebben belangrijke inzichten vergemakkelijkt in de subcellulaire / moleculaire dynamica dat antigene signalering in T-cellen, met inbegrip van de ontdekking van dynamische actine / TCR signalering micro-clusters 7,11-14 controleren. Echter, dergelijke modellen inherent oversimplified, evenals stijve (evenwel de ontwikkeling / studie van 3-dimensionale topologische kenmerken) (Figuur 1B). Daarom blijft het onzeker hoe dergelijke bevindingen aan phy betreffensiologic cel-cel immune surveillance.
Hoewel nog weinig bestudeerd, vasculaire en lymfatische endotheelcellen zijn in opkomst als een grote (dwz, groter in aantal dan alle professionele APC's, door ~ 1000-voudig) perifere compartiment van 'semi-professioneel "APC's 16-18. Deze cellen brengen MHC-I, MHC-II en een veelheid aan co-stimulator moleculen (bijvoorbeeld CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, maar niet CD80 en CD86) en strategisch gepositioneerd aan de bloed-weefsel interface waar ze dienen gespecialiseerde sentinel functies 16-18. Vorige studies aangetoond dat endotheelcellen effectief opnieuw stimuleren effector / geheugen, maar niet naïeve T-cellen 19-25. Aldus endotheelcellen waarschijnlijk unieke APC rollen in effector fase van adaptieve immuunreacties in de perifere weefsels, zoals lokale invloed op T-celactivering, differentiatie, geheugen en tolerantie 16,17,26. Critisch, wanneer gekweekt in vitro endotheliale cellen vormen vrijwel vlakke celoppervlakken en gemakkelijk te transfecteren (bijvoorbeeld met fluorescente proteïne reporters). Deze functies zijn ideaal voor hoge spatiotemporele resolutie beeldvorming van topologische dynamiek in cel-cel interacties 19,27. Zo endotheelcellen kunnen dienen als een fysiologische "vlakke cellulaire APC-model duidelijk geschikt voor het onderzoek van de subcellulaire / moleculaire remodeling mechanismen antigeenherkenning drijven en te reguleren responsen (figuur 1C) 19,20.
Eerder vastgestelde complementaire beeldvormingstechnieken (waaronder transfectie van endotheel cellen met fluorescent eiwit makers van de plasmamembraan en cytosol) voor het bestuderen van de details van leukocyt-endotheel interactie tijdens hechting en transendotheliale migratie 27, bleek dat leukocyten actief sonde het oppervlak van het endotheel door dynamische inbrengen van eend terugtrekken van sub-micron-schaal, actine-rijke cilindrische uitsteeksels (~ 200-1000 nm in diameter en diepte) genoemd invadosome-achtige uitsteeksels (dat wil zeggen, 'POPs') 27,28. Deze beeldvormingstechnieken zijn verder uitgebreid met de creatie protocollen te profiteren van endotheliale APC functie om de eerste werkwijzen voor spatiotemporele hoge resolutie afbeelding van de T-cel-endotheliale immunologische synaps gerapporteerde 19,20 ontwikkelen en verder hierin beschreven. Een centrale bevinding afgeleid van deze nieuwe vlakke cellulaire APC model is dat T-cel POPs functioneren, zowel in het bevorderen van de initiële Ag detectie en bij het instandhouden van de daaropvolgende signalering. Inderdaad, arrays van meerdere POPs (die werden gestabiliseerd en opgebouwd in reactie op calciumflux initiële) tonen verrijking in TCR en moleculen die wijzen op actieve signalering zoals PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrosine en HS1. Daarom POPs lijken een driedimensionale fysiologische equivalent aan het TCR-signalering micro vertegenwoordigenclusters gezien op vlakke dubbellaag modellen. Deze aanpak, dus onthult gevoelig / rapporten moleculaire en architecturale (en impliciete biomechanische) dynamiek anders niet aantoonbaar.
De hierin beschreven werkwijze moet nuttig zijn om de kloof tussen professionele APC en kunstmatige APC substraat modellen om ons vermogen om fundamentele mechanismen van adaptieve immuunreacties ondervragen verbeteren zijn. Hoewel hier de nadruk op de activatie van CD4 + Th1-type effector / geheugencel kan deze basisaanpak gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van T-cel soorten en Ags bestuderen, zoals hieronder besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten beschreven in dit protocol worden uitgevoerd met primaire menselijke T-cellen en in de handel verkrijgbaar primaire menselijke endotheelcellen (huid of longen microvasculaire EC) Je verder onderzoeksprotocol met mensen moet worden goedgekeurd door een institutionele review board en schriftelijke geïnformeerde toestemming moet worden verstrekt uit elke bloeddonor. Experimenten uitgevoerd met behulp van dit protocol werd goedgekeurd door de IRB van Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Voorbereiding Human CD4 + Th1 effector / geheugen T-cellen
- Toepassing tourniquet aan de arm van de donor, veeg ader met alcohol, en steek de naald. Langzaam trekken 15 ml bloed in vacutainer met EDTA als antistollingsmiddel. Wanneer het bloed is getrokken, los van de tourniquet voordat het verwijderen van de naald. Onmiddellijk van toepassing druk om wond met steriel gaasje wanneer de naald wordt verwijderd.
- Breng bloed naar een 50 ml buis. Add RPMI-1640 bij kamertemperatuur in een 1: 1 verdunning (eindvolume 30 ml). Overlay zorgvuldig de verdunded bloed op twee 50 ml buizen met 15 ml van voorgefilterde lymfocyten isolatiemedium zoals Ficoll-Paque bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de helling bij KT gedurende 30 min bij 1200 xg in een swinging bucket rotor. Terwijl centrifugeren bereiden T-cel medium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penicilline / streptomycine).
- Na verwijdering van de 50 ml buis van de centrifuge, in acht vier lagen: een pellet van rode bloedcellen op de bodem, de paque, een laag van cellen die witte bloedcellen (waaronder lymfocyten) en de plasma bevat. Verwijder de witte bloedcellen laag met een pasteur pipet en overdracht in een 50 ml Falcon buis zorgvuldig.
- Was de witte bloedcellen laag door toevoeging RT RPMI-1460 (tot 20 ml) en centrifugeren bij KT gedurende 5 min bij 1200 x g. Resuspendeer de witte bloedcellen in 1 ml T-celmedium. Voeg 5 ul van de 1 ml celsuspensie met 250 pi T-celmedium in een 1,5 ml centrifugebuis en meng voorzichtig op en neer met een pipet.
- Voeg 25 ul verdundd celsuspensie tot 25 pi 0,4% trypan blauw. Voeg 10 ul van het mengsel aan elke zijde van een standaard hemocytometer.
- Plaats hemocytometer op een laag vermogen lichtmicroscoop. Met behulp van een 10X objectief tel het aantal levende cellen dat trypan blauwe kleurstof uitgesloten en aanwezig in het middelste vierkant van beide zijden van de hemocytometer worden.
- Om de celconcentratie vermenigvuldigt het gemiddelde van de kwadraten van 2 100 (verdunningsfactor) en vervolgens vermenigvuldigen met 10 4 om het aantal cellen / ml.
- Stel het uiteindelijke concentratie 0,5 x 10 6 cellen / ml in T-celmedium. Voeg een eindconcentratie van 1 ug / ml van bacteriële superantigenen stafylokok enterotoxine B (SEB) en toxische-shocksyndroom toxine 1 (TSST) aan de cellen. Cultuur van 72 uur (37 ° C en 5% CO 2) aan de CD4 + T-celpopulatie uit te breiden.
- Pellet T-cellen (1200 xg, 5 min) en resuspendeer in 0,5 x 10 6 cellen / ml in T-celmedium mettoevoeging van menselijk IL-15 (20 ng / ml). Transfer lymfocyten een T150 kolf. Verder uit te breiden / split cellen volledig medium-IL-15 elke 24-48 uur als nodig is (op basis van media kleur, dat wil zeggen, wanneer de media verandert van roze tot licht geel) daarna. Behouden de resulterende lymfocytenpopulatie voor maximaal 15 dagen.
OPMERKING: Door het ontwerp, zal dit protocol te activeren en uit te breiden met name subset van CD4 + T-cellen die reactief zijn SEB en TSST en dan rijden ze naar een Th1-achtige effector / geheugen fenotype. Andere witte bloedcellen niet te overleven en te groeien onder deze omstandigheden, zodat stap 1,10 de cellen ten minste 95% CD4 +, CD45RO + T-cellen 19, zoals gemakkelijk kan worden beoordeeld door flowcytometrie. Desgewenst kunnen verdere zuivering gemakkelijk worden bereikt door in de handel verkrijgbaar antilichaam / magnetische bead-based positieve of negatieve selectie kits.
2. Vanaf primaire humane endotheelcellen Cultuur
<ol>3. Algemene Splitsen en uitbreiding van endotheelcellen
- Cellen groeien tot confluentie ~ 90-95. Dit kan 2-5 dagen duren. Voor splitsing,Verwijder de media en spoel met PBS. PBS verwijderen en te vervangen met een minimale hoeveelheid verse 1x trypsine (0,5 ml voor T25 of 1,5 ml voor T75). Zwenk om alle oppervlak met trypsine te dekken. Incubeer bij 37 ° C ~ 5 min. Bewaken van de onthechting van de cellen van de plaat met een laag vermogen lichtmicroscoop.
- Wanneer meeste cellen lijken rond of losgemaakt, voeg 5 volume (dat wil zeggen, vergeleken met het volume trypsine toegevoegd) voorverwarmde volledige EGM-2 medium en voorzichtig pipetteren over het oppervlak van de kolf om alle cellen los.
- Telling endotheliale cellen met een hemocytometer beschreven in 1,6-1,7. Pellet de cellen door centrifugeren (5 min, 1200 x g). Verwijder het supernatant. Pas concentratie 0.500.000 cellen per ml door toevoeging van voorverwarmde volledige EGM-2 MV media.
- Overdracht aliquots van cellen om de juiste FN-beklede schalen of flacons onderhoud. Zwenk en plaats in de incubator. Wijzig de media binnen 6-12 uur in de platen. Media should ongeveer vervolgens om 48 uur worden vervangen.
4. endotheelcellen Transfectie
OPMERKING: Primaire endotheelcellen ongevoelig transfectie de meeste gebruikelijke chemische werkwijzen en elektroporatie. De transfectie gebaseerde werkwijze nucleaire hieronder beschreven maakt betrekkelijk hoge transfectie efficiëntie (~ 50-70%). Een effectieve alternatieve methode is het gebruik van een infectie door geschikte virale vectoren (zie opmerkingen bij Materials tabel).
- Bereid T25 en T75 flessen (indien nodig) van HLMVECs of HDMVECs tot een uiteindelijke dichtheid van 90-95% confluency.Coat met fibronectine (FN) 20 ug / ml in PBS in steriele omstandigheden ofwel microscoop cultuur platen zoals Delta-T-platen (voor stap 5) of 12 mm ronde dekglaasjes geplaatst in een putje van een 24-well celkweek plaat (voor stap 6) met als hierboven (2.1) beschreven.
- Voeg 1 ml compleet EGM-2 kweekmedia tot microscoop cultuur platesor 0,5 ml voor elke 24 goed evenwicht en platen ineen bevochtigde 37 ° C / 5% CO2 incubator.
- Oogst en tel endotheelcellen in stappen 3.1-3.3.Centrifuge het vereiste volume van cellen (0,5 miljoen cellen per monster) bij 1200 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 100 pl RT nucleaire transfectieoplossing per monster.
- Combineer 100 pi celsuspensie met 1-5 pg DNA. Transfer cel / DNA suspensie in gecertificeerde kuvet; monster de bodem van de cuvette te dekken zonder luchtbellen.
OPMERKING: Constructen richten YFP of DsRed aan het celmembraan (via de N-terminale 20 aminozuren van neuromoduline die een signaal voor posttranslationele palmitoylering bevat) werden alleen toegepast (membraan-YFP alone of membraan-DsRed afzonderlijk) of gecotransfecteerd met een cytoplasma volumetrische marker (bijvoorbeeld membraan-YFP en oplosbare DsRed). Vele permutaties van fluorescente eiwit markers kunnen worden gebruikt. - Sluit de cuvet met de dop. Plaats de cuvet metcel / DNA suspensie in de cuvettehouder van de electroporator en toepassen elektroporatie programma S-005. Neem de cuvette uit de houder zodra het programma klaar is.
- Voeg ~ 500 ul van de vooraf in evenwicht kweekmedia de cuvette en verwijder voorzichtig de celsuspensie uit de cuvette met de plastic transferpipetten voorzien in de transfectiekit kern.
- Voor experimenten met microscoop cultuur platen verdelen de celsuspensie van de ene reactie even tussen twee gerechten met voorverwarmde media (Stappen 4,2-4,3). Voor experimenten met 24 goed / plaat, partitie één reactie gelijkelijk over 3 putten.
- Incubeer de cellen in een bevochtigde 37 ° C / 5% CO2 incubator veranderingsmedia 4-6 uur en opnieuw bij 12-16 uur na transfectie.
5. Live-cell imaging en analyse
- Het voorbereiden van endotheel
- Dag 0: Co-transfecteren primaire HLMVECs met membraan-YFP en oplosbare DsRed via een nucleofection technologie zoals beschreven in stap 4 en plaat op voor live-cell imaging kweekplaten.
- Dag 1: Vervang medium met vers medium met IFN-γ (100 ng / ml) aan MHC-II-expressie te induceren. Op dag 2. Stimuleer getransfecteerde cellen door toevoeging van 20 ng / ml TNF-α de bestaande media.
- Op dag 3, incubeer het endotheel met 1 ug / ml van bacteriële superantigenen stafylokok enterotoxine B (SEB) en toxische-shocksyndroom toxine 1 (TSST) bij 37 ° C gedurende 30-60 min onmiddellijk voorafgaand aan experimenten. Sla deze stap voor '-AG' controle omstandigheden.
- Het voorbereiden van lymfocyten
- Gelijktijdig met stap 5.1.3, bereiden Buffer A (fenolrood-vrije HBSS), aangevuld met 20 mM Hepes, pH 7,4 en 0,5% v / v humaan serumalbumine voorverwarmd tot 37 ° C. Neem een monster van gekweekte lymfocyten en het bepalen van de dichtheid door het tellen met een hemocytometer (Stap 1,12-1,17).
- Centrifuge 2 miljoen cellen per monster op 1,200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een 15 ml conische buis. Zuig media en voorzichtig resuspendeer celpellet in 2 ml buffer A zodat geen celgroepen blijven.
- Verwijderen van een verse portie van Fura-2 calcium kleurstof en resuspendeer in DMSO een voorraad concentratie van 1 mM te maken.
- Voeg 2 ul van Fura-2 voorraadoplossing aan de T-celsuspensie (2 uM eindconcentratie), cap de buis onmiddellijk meng door de buis gelijkmatige spreiding van kleurstof te verzekeren. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min.
- Gecentrifugeerd zoals in stap 5.2.2. Zuig buffer-A en voorzichtig maar grondig mengen lymfocyten in 20-40 pl verse buffer-A.
- Live-cell imaging Setup en Acquisition
Opmerking: Een grote verscheidenheid aan systemen kunnen worden toegepast voor levende cellen fluorescentie beeldvorming op rechtop en omgekeerd lichtmicroscoop. Basisvereisten zijn een fluorescentie lichtbron en filters, een CCD-camera, gemotoriseerde filter schakelen en rolluiken, een verwarmd podium (of Microscope-monteerbare verwarmde kamer) en software voor geautomatiseerde beeldacquisitie. Voor dit protocol hoge numerieke lensopening, hoge vergroting (dat wil zeggen, 40x, 63x) olie-immersie-lenzen nodig zijn om de nodige ruimtelijke resolutie te bereiken. Speciale zorg moet worden genomen bij het kiezen van de juiste fluorescentie bron en lenzen voor Fura-2-gebaseerde calcium beeldvorming als niet alle compatibel zijn met de vereiste 340/380 nm excitatie golflengten. Een alternatieve benadering (compatibel met standaard groene en rode fluorescentie filtersets) kan worden gebruikt met niet-ratiomentic calcium-gevoelige kleurstoffen (bv Fluo-4, Rhod-3), hoewel deze niet nauwkeurig kwantificeren calcium flux en alleen een relatieve / kwantitatieve uitlezing.- Schakelen microscoop systeem (PC voor gebruik, microscoop, CCD-camera, filter wiel en xenon lamp).
- Open de aangewezen software.
- Opgezet microscoop / software voor automatische multichannel time-lapse imaging. Omvatten sequentiële overname van adifferential interferentie contrast (DIC), standaard groene fluorescentie, standaard rode fluoresceren en de standaard 340 en 380 nm excitatie Fura-2 beelden. Stel het interval voor het ingaan van 10-30 seconden en een totale duur van ~ 20-60 min.
- Stel belichtingstijden voor Fura-2 beeldvorming.
- Voeg verse objectieve olie en monteer een microscoop schotel met slechts 0,5 ml buffer-A op de verwarming podium adapter en onmiddellijk zet in evenwicht tot 37 ° C (duurt ~ 2-3 min).
- Add rust fura2 geladen lymfocyten aan de gemonteerde microscoop gerecht kamer met behulp van een 20 pi pipet.
- Zet helder field imaging. Selecteer het lichtpad naar het oculair. Gebruik de grove scherpstelling knop om objectief in contact komt met bodem van de miscoscope gerecht te brengen. Gebruik het oculair en het scherpstellen knop te concentreren op de T-cellen zich op de bodem van de schaal.
- Gebruik de xy fase controles een gebied dat ten minste 10 cellen te selecteren. Vermijdenovervol velden en celklonten omdat deze beeldvorming artefacten creëren.
- Switch van helder veld naar lichtbron fluorescerend. Overschakelen van oculair beeldvorming CCD-camera. Stel acquisitie parameters (bijvoorbeeld, belichtingstijd, detector winst en binning). De software verwerven rust Fura2-340 en Fura2-380 afbeeldingen (ab dezelfde belichtingstijd voor ieder, gewoonlijk in het bereik van ~ 200-1000 msec).
- Gebruik de in stap 5.4.1 op de Fura2-340 / Fura2-380 berekenen voor elk van lymfocyten beschreven methoden. Voeren herhaalde herhalingen van het aanpassen van de Fura2-340 en Fura2-380 belichtingstijden, het verwerven van beelden en het berekenen van verhoudingen tot de gemiddelde waarden liggen dicht bij 1.
- Stel belichtingstijden voor mem-YFP en DsRed.
- Vervang de microscoop schaal gebruikt in stap 5.3.3.1 met een miscroscope schotel met getransfecteerde, geactiveerd en SAg behandeld (of onbehandeld; controle) HLMVECs of HDMVECs van celkweek incubator (Steps 4.5.1). Gebruik een wegwerp transferpipet snel verwijderen media uitspoelen één handeling door toevoeging van ~ 1 ml voorverwarmde buffer-A. Aspireren en voeg vervolgens 0,5 ml buffer-A.
- Identificeer gebieden waar fel fluorescerend positieve transfectant endotheelcellen aanwezig zijn en gezond met goed gevormde intercellulaire kruispunten worden weergegeven.
- Pas acquisitie parameters (bv, belichtingstijd, detector winst en binning) voor mem-YFP en DsRed. Zorg ervoor dat de gemiddelde fluorescentie signaalintensiteit elk kanaal ligt tussen 25% en 75% van het dynamisch bereik van de detector.
- Stel belichtingstijden voor Fura-2 beeldvorming.
- Voeren voor live-cell imaging experiment.
- Gebruik geautomatiseerde software om de afbeelding acquisitie te beginnen en te vangen enkele tussenpozen van afbeeldingen om de baseline vast te stellen.
- Gedurende acquisitie toepassing ~ 5 ul geconcentreerd Fura-2 geladen lymfocyten (van stap 5.2) naar het centrum van de beeldvormende veldmicroscoop schotel door de tip van een klein volume (P-5of P-20) pipet in de media nabij het midden van het doel en uitwerpen langzaam.
- Lymfocyten vestigen in het beeldveld, nauwkeurig afstellen in de focus te verzekeren dat de T-cel-endotheel cel interface (immunologische synapsen) worden behouden in het brandvlak. Met 40 en 63x objectief, ~ 10-20 cellen per veld optimaal zijn. Als er minder cellen worden waargenomen in de beeldvorming gebied herhaal stap 5.3.4.2.
- Nadat de gewenste waarneming interval experiment wordt geconcurreerd, verder imaging onmiddellijk pipet ionomycine onmiddellijk in miscoscope schaal (via techniek in 5.3.4.2) tot een eindconcentratie van 2 uM tot maximale calcium flux / Fura-2 signaleringssignaal induceren (dwz , een middel van kalibratie, zie analyse 5.4.).
- Als alternatief voor de gewenste waarneming interval experiment 5.3.4.4after wordt geconcurreerd onmiddellijk zuig het buffer-A en vervangen door 0,5 ml fixatief (3,7% formaldehyde in PBS) gedurende 5 min bijRT, gevolgd door spoelen driemaal met PBS. Ga dan naar stap 6.
- Analyse van live-cell imaging
NB: Na het opslaan van verworven bestanden, kunnen ze direct worden geanalyseerd of voor analyse uitgevoerd door een grote verscheidenheid van off-line beeldanalyse software applicaties. ImageJ is een bijzonder waardevol, zeer veelzijdig pakket dat is vrij beschikbaar en compatibel met vrijwel elke acquisitie software pakket. Het ontwerp van de beeldvormende experimenten stappen 5,1-5,3 beschreven zal hoge ruimtelijke en temporele resolutie dynamiek van interacties tussen lymfocyten en endotheliale APC in de afwezigheid en aanwezigheid van verwante SAg opleveren. Bijna onbeperkt analyses mogelijk zijn bij de aanpak van beeldgegevens van cellulaire morfometrische / signalering dynamiek. De specifieke doelstellingen in dit protocol beschreven zijn gecoördineerd kwantificeren lymfocytenmigratie en signalering (dwz, kinetiek en de niveaus van de intracellulaire calcium flux), samen met dynamischeal veranderingen in de immunologische synaps architectuur met focus op specifieke kenmerken (dwz POPs / podo-prints). De volgende zijn voorbeelden van afzonderlijke standaard en niet-standaard (dat wil zeggen, speciaal voor deze experimenten / vragen) analyses.- Meet Lymphocyte Calcium flux
- Selecteer de eerste Fura2-340 (340 nm EX-510 nm EM) en Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) beelden die voor toevoeging van lymfocyten werden verworven. Gebruik deze als achtergrond beelden en digitaal af te trekken ze uit de alle van de beelden in de tijdreeksen voor de respectievelijke kanaal.
- Voor elk tijdstip maakt een digitaal beeld verhouding van de achtergrond afgetrokken Fura2-340 en de achtergrond afgetrokken Fura2-380 afbeeldingen (dwz 340 nm EX-510 nm EM-background / 380 nm-510 nm EX EM-achtergrond).
- Kies de juiste software tekenprogramma. Klik op het scherm om een cirkelvormig gebied van i te trekkenBELANG (ROI) rond elke lymfocyt. Deze zullen een pixel gemiddelde verhouding voor elk van lymfocyten en tijd te genereren.
- Plot de berekende verhouding als functie van de tijd met een geschikte toepassing (bijvoorbeeld spreadsheetprogramma). Bereken gemiddelde calcium flux voor het experiment door het optellen van de verhouding tussen waarden van alle lymfocyten per veld en die waarde te delen door het totale aantal lymfocyten voor elk tijdstip
- Voeren lympocyte migratie volgen analyse.
- Analyseren cel T-cel migratie met behulp van een geschikte mobiele tracking software applicatie (bijvoorbeeld ImageJ) met de DIC kanaal van elke video. Met behulp van ImageJ Cell Tracking Plugin, te identificeren in elk frame het zwaartepunt van elke cel handmatig door erop te klikken in elke progressieve frame.
- Gebruik de resulterende seriële xy coördinaten (dwz, sporen van de migratie paden) naar de gemiddelde snelheid (totale afstand gemigreerd / totaal interval o berekenenf imaging) en de kronkeligheid (totale afstand gemigreerd / het lineaire end-to-end afstand tussen de cellocatie in de eerste en laatste beeld).
- Cross-correleren deze parameters met calcium flux (5.4.1) dynamiek op een cel-by-cel basis.
- Beoordeel de Podo-print / ILP Dichtheid binnen de IS
- Tellen totaal aantal ILP gevormd in elke T-cel wordt gedefinieerd intervallen (bijvoorbeeld 5 min na toevoeging van T-cellen). Deze kunnen worden geïdentificeerd discrete micron-schaal fluorescente membraan-YFP ringen die co-lokaliseren met donkere kringen in cytoplasma DsRed op de endotheliale APC op de plaats van lymfocyten hechting.
- Cross-correleren de resulterende 'ILP indexen' met calcium flux (5.4.1) dynamiek op een cel-by-cel basis.
- Meet de Podo-print / ILP levens.
- Voor elke podo-print / ILP in een bepaalde IS berekenen zijn levens als het laatste tijdstip waarop een ILP zichtbaar was - het tijdstip waarop dat podo-print / ILP fieerst verscheen. Gemiddeld ILP levens zowel per IS.
- Cross-correleren deze levens met calcium flux (5.4.1) dynamiek op een cel-by-cel basis.
- Beoordeel de temporele relatie tussen de eerste ILP vorming en calcium flux.
- Voor elk van lymfocyten identificeren tijdstip (frame) waarmee calcium eerst boven de uitgangswaarde 19.
- Voor elk van lymfocyten identificeren van de tijdstip waarop de eerste podo-print / ILP verschijnt.
- Voor elke lymfocyt berekent een 'offset time' door het aftrekken van de initiële calciumflux tijdstip van die van de eerste podo-print / ILP. Het gemiddelde van de waarden van alle lymfocyten in een veld. Positieve waarden geven de ILP vorming voorafgaat calciumflux terwijl negatieve getallen geven het tegenovergestelde.
Opmerking: Deze experimenten kunnen gemakkelijk onder fysiologisch relevante laminaire schuifstroom uitgevoerd met in de handel verkrijgbaar parallelle wandstromingsfiltratie imaging kamers beschreven 19.
- Meet Lymphocyte Calcium flux
6. Vaste-cell imaging en analyse
- Vaste eindpunt T-cel-endotheel IS vorming en kleuring
- Bereid T cellen zoals beschreven in 1. Bereid endotheelcellen (- / + SAg) zoals in stap 5,1 (transfectie stap 5.1.1 is optioneel). Neem een monster van gekweekte lymfocyten en bepalen van de dichtheid van tellen met een hemocytometer (Deel 1).
- Breng een lymfocytenkweek volume gelijk aan ten minste 3 x 10 5 lymfocyten / monster een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 3 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet lymfocyten in buffer-A (stap 5.2.1) concentratie van 6 x 10 5 lymfocyten / ml.
- Verwijder de endotheelcellen uit de celkweek incubator (verdergaat één monster tegelijk) achtereenvolgens aspireren media en vervangen door 0,5 ml van lymfocyt suspensie (3 x 10 5 lymfocyten / monster) en vervanging 37 ° C incubator.
- Na geschikte incubatie tijden, zoals hierboven vermeld, aspireren medium van de putten en voeg voldoende fixeeroplossing (3,7% formaldehyde in PBS) om het monster volledig te bedekken (bijvoorbeeld in 24 well plaat ~ 300-500 pi). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
- Spoel monster 3 maal met PBS. Vlek door het toevoegen van primair antilichaam gedurende 60 minuten bij RT (zie lijst). Als het primaire antilichaam is gericht op een intracellulair eiwit, een extra permeabilisatie stap moet worden uitgevoerd door toevoegen van voldoende permeabilisatie oplossing (0,01% Triton X-100 in PBS) aan het monster gedurende 1 min bij kamertemperatuur volledig bedekken. Spoel monster 3 maal met PBS. Voeg het juiste secundaire antilichamen (soms gelijktijdig fluorescerende phalloidin) gedurende 60 min bij RT.
- Monteer de ronde glazen dekglaasje op beeldvorming dia. Vaste eindpunt T-cel-endotheel IS formatie en kleuring. Om te beginnen beeldvorming plaats de beeldvorming dia met monsters op de microscoop podium en selecteer de 63x oliedoelstelling. Solliciteer verse immersie olie.
- Gebruik de bright-field imaging-modus en oculaire lenzen om de focal plane lokaliseren. Schakelen naar epifluorescentie en via de oculaire lenzen inspecteren monster. Selecteer een veld van belang. Overschakelen naar de laser-scanning mode.
- De snelkoppeling-scan en werken in een zo groot gebied mogelijk individueel laservermogen en versterking van ieder kanaal in op het signaal, zodat idealiter de specifieke signaalintensiteit bereikt optimaliseren ten minste ~ 25% en ten hoogste 75% van het dynamisch bereik van de detectoren.
- Handmatige focusregeling, snel door de Z-as en identificeren van de boven- en ondergrenzen van snijden (gewoonlijk alle informatie moet worden opgenomen in een dikte van ~ 15 urn). Selecteer de Z-as snijdikte in het bereik van ~ 0,2-1,0 micrometer.
- Tot slot, zoom / gewas het veld beeldvorming om de specifieke regio van belang en het gedrag scan. Naast het hebben van zeer licht en specifieke fluorescentie signaal in de steekproef, het verwerven van een hoge resolutie 3D-beeldvorming vereist herhalingen van scannen en het maken van aanpassingen aan acquisitie parameters. Het doel is om maximale xy en z-as resolutie, zonder noemenswaardige foto-bleken te verkrijgen.
- Kwalitatief analyseren de topologie van 3D-topologie van het IS door het uitvoeren van digitale 3D-reconstructie van de resulterende optische secties door middel van een geschikte softwaretoepassing (bijv Afbeelding J). Door soortgelijke toepassingen kwantitatief fluorescentiesignaal distributie te beoordelen (bv co-lokalisatie en correlatieve fluorescentie-intensiteit line-scan analyse van Pearson en orthogonale bekijken).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een nieuwe imaging benadering middels endotheliale cellen en het combineren van de resolutie voordelen van de vlakke lipide dubbellagen model met de fysiologische complexiteit en vervormbaarheid van professionele APC werd ontwikkeld (figuur 1). Figuur 2 geeft voorbeelden van normale migratie, calcium flux en topologische dynamiek waargenomen met dit aanpak. Aangezien SAg op endotheel, SAg-specifieke CD4 + Th1 lymfocyten snel verspreiden, polariseren en lateraal migreren via endotheliale oppervlak (Figuur 2A) zonder calcium flux (niet getoond). Binnen ~ 5-10 min deze lymfocyt initiëren transmigratie over het endotheel. In aanwezigheid van SAg laden op endotheel lymfocyten symmetrisch verdeeld met een "gebakken ei topologie, initiëren aanhoudende (dwz gedurende 30-60 min) intracellulair calcium flux (figuur 2B; Film 1) gedurende welke zij vertonenweinig of geen migratie (figuur 2C).
Figuur 2. Levende-Cell Analyse van T-cel activering en migratie en immunologische Synapse Topologie endotheliale APC. (A) panelen tonen een voorbeeld van tijdreeksen beeldvorming van T cel migratie op endotheel in afwezigheid van SAg. Bovenste paneel toont DIC beelden. De beginpositie van de migratie van T-cellen wordt aangegeven door de rode stippellijn. Onderste paneel toont invaginations gevormd op het endotheel van de migratie van T-cellen. Pijlen geven vorming van voorbijgaande ringen (~ 0,5-1 micrometer diameter) van membraan-YFP fluorescentie gevormd als gevolg van T-cel generatie 'invadosome uitsteeksels (POPs) tegen het endotheliale oppervlak APC (zie D). (B) toont een voorbeeld van een soortgelijke serie in aanwezigheid van SAg-loaded endotheel (links; zie ookovereenkomstige Film 1) en kwantitatieve spoor van de dynamische veranderingen in calciumniveau (rechts). Pijlen geeft initiële POPs formatie die correleert met de inleiding van calcium flux (i) en daaropvolgende stabilisatie van meerdere POPs die correleert met een hoge calcium flux (ii). (C) experimenten A en B werden onderworpen aan het volgen analysecel. DIC afbeeldingen op links tonen representatieve T cel migratie paden over de duur van 10 minuten (rood sporen). Grafiek rechts toont de berekende migratie snelheden in de afwezigheid en aanwezigheid van SAg. (D) Dynamische analyse van immunologische synaps topologie (gewijzigd van 19). Schematisch (i) illustreert een gevoelige endotheliale cel / APC 'topologie verslaggever systeem', bestaande uit membraan-gerichte-YFP en oplosbare cytosolische RFP. Actine-gemedieerde ILP die uitsteken in de endotheliale celoppervlak genereren cilindervormig invaginaties (een soort cellulaire foot-print, aangeduid als een 'podo-print') giving tot geknikt membraan die ringen van membraan-YFP fluorescentie verschijnen (bijvoorbeeld, de wanden van de cilinder bekeken en face). Cytosol verplaatsing en uitsluiting op deze loci verschijnen als donkere kringen van cytosolische RFP. DIC en fluorescentiebeelden in (ii) tonen een voorbeeld van een dergelijke analyse de aanwezigheid van SAg (zie eveneens corresponderende film 2). Een enkele initiële podo-print / ILP ontwikkelt zich tot een reeks van> 20 gestabiliseerd POPs meer dan 15 min. Blauwe doos op 15 min (iii) geeft een hoge resolutie weergave van een enkele podo-print / ILP waarbij een ring van membraan-YFP overlapt met een gebied van uitgesloten cytosolische RFP. Binnen de stippellijn (iv) toont een kwantitatieve lijn scan analyse van de fluorescentie-intensiteiten. Schaal bars = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zoals eerder vastgestelde, lymfocyten activEly sonde het oppervlak van het endotheel door uitbreiding actine en HS1 (a cortactin homoloog) verrijkte en WASp- en uitsteeksels src-afhankelijke zogenaamde "invadosome uitsteeksels; (POPs; elke ~ 0,5-1 micrometer diep in diameter) 27,28. Transfectie van membraan gerichte fluorescentie eiwit (FP) is aangetoond dat gevoelige reporters voor subcellulaire topologische dynamiek cel-celoppervlakken. Daarmee is aangetoond dat heldere ringen van fluorescente membraan-FP zijn indicatief voor membraan buigen tijdens T-cel-endotheliale wisselwerking als gevolg van T-cel POPs uitsteeksels. Hier wordt getoond, en in eerdere studies 19,20, dat terwijl kleine clusters van POPs vorm omzet en snel (dwz levensduur van ~ 10-30 sec) bij zijdelingse migratie van T-cellen op endotheel in afwezigheid van SAg (figuur 2A ), worden ze zeer stabiel (dat wil zeggen levensduur van ~ 30 min) en accumuleren in dichte arrays in aanwezigheiddoorzakking (figuur 2B). Verder onderzoek van de POPs en calcium initiatie kinetiek ("Offset time ') blijkt dat POPs voorafgaan calcium-signalering suggereert zij helpen bij de MHC-II / Ag herkenningsproces (figuur 2Bii). Daarnaast stabiliseerde POPs arrays vormen in verhouding tot de maximale calcium flux (figuur 2Bii). Het idee dat de ringen membraan fluorescentie overeenkomen met T-cel uitsteeksels drijven discrete invaginatie spots in endotheliale APCs wordt bevestigd door het aantonen dat deze ringen in alle gevallen correleert ruimtelijk en kinetisch met zones verplaatste / uitgesloten cytoplasma (gerapporteerd door oplosbare DsRed; Figuur 2D en Movie 2).
Figuur 3 geeft voorbeelden van vaste eindpunt confocale imaging studies. Na 10 min van co-incubatie bij aanwezigheid van SAg ISS gevormd tussen T-cellen en endotheliale APCs werden afgebeeld door fixatie, immuno fluorescentie kleuring en confocale microscopie. Deze studies analyse van de subcellulaire distributie dynamiek van kritische moleculen en signalering activiteiten binnen IS'en in het bijzonder met betrekking tot POPs. Specifiek cytoskelet / cytoskelet regulator (actine, HS1 Figuur 3A), antigeenpresentatie / herkenning (CD3 / MHC-II Figuur 3B) adhesie (ICAM-1, LFA-1, taline Figuur 3C) en antigene signalisatie (PKC Q Figuur 3D) worden gezien als mede-verrijkt in Podo-prints / ILP. Digitale reconstructie van confocale serial-sectie z-stacks levert aanvullend bewijsmateriaal aan die weergegeven in figuur 2D, dat de T-cel-endotheel endotheel IS heeft een discreet 3-dimensie architectuur onderbroken door T-cel ILP uitsteekt in de APC oppervlak (Figuur 3Aii, Ci, iii, D). (Figuur 3Civ).
Figuur 3. Vaste-Sample Analysis Moleculaire Distribution Dynamiek in T-cel-endotheelcellen immunologische Synapses. Lymfocyten werden geïncubeerd op SAg geladen endotheel gedurende 30 minuten en gefixeerd en gekleurd. In aangegeven panelen endotheelcellen werden pre-getransfecteerd om membraan-YFP of -DsRed uiten. (A) Representatieve beeldvorming toon actine (i) en HS1 (a cortactin homoloog ii) co-verrijkt aan de omtrek van de immunologische synaps micro-clusters die correleren met het midden van endotheliale fluorescente ringen membraan-YFP (dwz ' podo-prints; zie figuur 2D) bevestigt dat T-cel POPs zijn verantwoordelijk voor het uiterlijk van podo-prints. Een zijaanzicht (ii. 90 ° Projectie) illustreert dat POPs vertegenwoordigen 3-dimensionale uitsteeksel in de z beeldvlak (gewijzigd van 19). (B) Representatieve verrijking van T-cel TCR (i) en endothEliel MHC-II (ii) binnen de immunologische synaps, tonen discrete subcellulaire verdeling naar de ILP / podo-prints. (C) (i) Vertegenwoordiger co-verrijking van ICAM-1 en LFA-1 in Podo-prints en ILP, respectievelijk van de IS. (i) toont een 3-D reconstructie van digitale confocale secties van de IS 60 ° gedraaid (bovenste panelen) en 90 ° (orthogonaal aanzicht, onderste panelen). (ii) Toont een ingezoomde weergave van de IS en gezicht. (iii) toont een orthogonale dwarsdoorsnede van de doos gebied (ii) (gemodificeerd van 19). (iv) Vertegenwoordiger co-verrijking van talin (een integtin / actine linker eiwit) en actine in IS POPs. (D) Vertegenwoordiger co-verrijking van de TCR signalering molecuul PKC-Q met actine in IS POPs. Elk paneel toont een eigen gezicht bekijken (linksonder gedeelte) en twee afzonderlijke orthogonale uitzicht (90 ° Projectie). Uiterst links en rechts panelen gebruik zijn replica's van hun respectieve naburige panelen, geprojecteerd met een regenboog fluorescence intensiteit schaal (gewijzigd van 19). Schaal bars = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1:. Leef-Cell Dynamic beeldvorming van T-cel Calcium Signaling en immunologische Synapse Topologie Time-lapse Live-cell imaging van fura2 geladen CD4 + Th1 lymfocyten interactie met endotheel uiten membraan-YFP en geladen met SAg, overeenkomstig figuur 2B. Linker paneel toont de intracellulaire calcium niveaus (regenboog: koele kleuren, lage calcium; warme kleuren hoog calcium) in T-cel. Rechter paneel uit membraan-YFP fluorescentie op het oppervlak van de endotheliale APC. Lymfocyten worden gezien initiëren spreiding en ILP formatie (zoals gezien via fluorescent ringen mem-YFP kanaal, dat wil zeggen, 'podo-prenten; Zie Figuur 2Bi), gevolgd door inductie van een langdurige (30-60 min) intracellulair calcium flux, die evenredig is met de vorming van perifere arrays van POPs / podo-prints analoog aan TCR / actine optreedt 'signaleren micro-geclusterd' die worden gezien in het vlakke dubbellaag APC-modellen (zie figuur 2Bii). Het interval tussen beeldjes is 20 sec. Klik hier om deze video te bekijken.
Film 2: Leef-Cell Dynamic Imaging van immunologische Synapse Topologie viFluorescent Reporters in Endotheliale APCs. Time-lapse live cell imaging van CD4 + Th1 lymfocyten (DIC, links) interactie met endotheel co-expressie membraan-YFP (groen) en oplosbare cytosolische DsRed (rood) en geladen met SAg, overeenkomend met Figuur 2D. Rechter paneel toont samenvoegen van DIC, membraan en cytoplasma signalering. De gecombineerde signalen van membraan en cytoplasma fluorescentie gevoelig melden vorming en de herinrichting van meerdere ~ 0,2-1 micrometer schaal oppervlak invaginaties (podo-prints), die het gevolg zijn van arrays T-cel indringende met ILP uitsteeksels. Klik hier om deze video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortom, dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen als i) weinig bestudeerd fysiologische APC's en ii) als een nieuw type 'vlakke cellulaire APC model'. Wat het eerstgenoemde is geworden steeds duidelijk zijn dat niet-hematopoietische perifere (of "stromale") APCs spelen cruciale, niet-redundante functies (bijv tegenover hematopoietische APCs) de vormgeving adaptieve immuunreacties 16-18. Onder dergelijke 'semi-professioneel "APC's, vasculaire en lymfatische endotheelcellen (die sterk overtreffen professionele APC's) behoren tot de beste gewaardeerde 16-18. Echter, de details van de signalering gebeurtenissen en hun gekoppeld immunologische synapsen blijven grotendeels niet onderzochte. De hierin beschreven werkwijzen verschaffen een basis voor het bevorderen van begrip in deze nieuwe omgeving. Bijvoorbeeld, de toepassing van deze benaderingen voor het bestuderen van IS'en gevormd op endotheliale uit verschillende weefsels waarvan bekend is dat afzonderlijke Adaptiv vertonene immunologische functie (bijvoorbeeld, lever en lymfatische endotheel) kunnen bijzonder leerzaam.
Beduidend, helpt deze methode om de kloof tussen de professionele APC's en kunstmatige APC substraat modellen om de mogelijkheid om fundamentele mechanismen van adaptieve immuunreacties ondervragen verbeteren overbruggen. Overwegende vlakke APC substraten (dwz lipidendubbellagen-antilichaam gecoat glas) zorgen voor een optimale beeldvorming (dat heeft geleid tot veel kritische inzichten 7,11-14), dergelijke modellen zijn inherent beperkt. Als alternatief, de details van fysiologische cel-cel scannen dynamiek hebben tot nu toe diep verduisterd door oriëntatie-imaging gerelateerde onderwerpen 8-10. De imaging-mogelijkheden voorzien in de huidige aanpak te overwinnen deze hindernis voor een unieke normaal niet waarneembare driedimensionale subcellulaire architectuur en snelle herinrichting van een fysiologische APC-T-cel-interface. Deze bieden mogelijkheden voor nieuw begrip van antigene signaling.
Bijvoorbeeld, de waardering die T cellen vormen POPs verrijkt met TCR, actine en signaalmoleculen (bijvoorbeeld figuur 2D, figuur 3), suggereren dat deze waarschijnlijk vertegenwoordigt de fysiologische 3-dimensionale tegenhangers de vlakke TCR signalering micro-clusters waargenomen op kunstmatige APC substraten 6,7,12-14,29-31. Dit houdt in dat onder fysiologische instellingen, lymfocyten kan POPs als discrete subcellulaire '3D-reactie volumes' met 'signalosome'-achtige eigenschappen die versterken in dienst en in stand signalering door zich te concentreren belangrijke moleculen / activiteiten 32,33. Bovendien is de aanwezigheid van significante biomechanische inputs (dwz cel- krachtuitoefening) en bezienswaardigheden als ILP uitsteeksel tegen de APC kan worden afgeleid uit de beeldvorming. Dit is triviaal als mechanische krachten in toenemende mate gezien als kritische facilitators van antigene signalering, terwijl precies hoe dergelijke krachtengeopenbaarde blijft onduidelijk 14,34-37.
De algemene relevantie van dit model als redelijke vervanging voor professionele APCs wordt ondersteund door ons direct bewijs dat soortgelijke ILP arrays te zien in synapsen gevormd op EC en DCs (en in mindere mate B-cellen) voor analoge beeldvormingsbenaderingen werden toegepast (bv gebruik van dezelfde fluorescentie makers en controle van de IS vlakoriëntatie vliegtuig 19). Niettemin dient te worden overwogen dat de relatieve biomechanische eigenschappen van EC versus professionele APC membraanoppervlakken onbekend zijn en dat verschillen in deze parameter kan beïnvloeden details van IS topologie en antigene respons.
De sleutel tot de hierin beschreven aanpak is sterk gerelateerd aan de resolutie voordelen. Dit op zijn beurt sterk gerelateerd aan de sterkte van het fluorescentiesignaal. Aldus is het essentieel om bijzondere aandacht te besteden optimaliseren transfectie en kleuring van fluorescent verslaggevers en imaging parameters / techniek (bv, belichtingstijd, focus, etc ...). Wat de eerstgenoemde, het protocol voor levende-cel studies die hier beschreven zijn beperkt tot transfectie van generieke membraan en cytoplasma markers die topologische veranderingen op de T-cel-APC-interface in real time (bijvoorbeeld figuur 2, Film 1 rapporteren, 2). Bovendien kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast om meer geavanceerde analyse met gelijktijdig inbrengen / beeldvorming verder reporters in het endotheel (bijvoorbeeld fluorescerend eiwit hebben MHCI / II en adhesie, co-stimulatoire en co-remmende moleculen en biosensoren voor het signaleren en biomechanische dynamiek). Helaas algemene beperking is dat lymfocyten zijn notoir moeilijk te transfecteren. Dit sluit comfortabel gebruik van fluorescente eiwitten (bijvoorbeeld gelabeld met TCR, PKC-Q, etc.) in T-cellen voor live cell imaging.
Terwijlhet huidige protocol omvat activering van de menselijke effector / geheugen CD4 + Th1 soort lymfocyten door middel SAg (een veel gebruikte model), veel bredere mogelijkheden bestaan. Zoals eerder aangetoond 19,20 Deze benadering gemakkelijk aanpasbaar aan een breed scala van andere instellingen, zoals reacties van andere CD4 + subsets en activatie van CD8 + lymfocyten doden reacties. Door isolatie van lymfocyten en endotheelcellen uit bestaande TCR-transgene stammen is deze werkwijze ook gemakkelijk aanpasbaar aan reacties op specifieke peptide-antigenen 19,20 bestuderen. Tenslotte wordt de huidige aanpak beperkt tot onderzoek effector / geheugen-T-cellen. Echter, transfectie van endotheelcellen met de essentiële co-stimulerende moleculen (CD80 / 86, normaal niet tot expressie op endotheel) zou mogelijk maken studie van naïeve cel priming dynamiek in dit model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
- Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
- Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
- Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
- Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
- Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
- Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
- Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
- Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
- Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
- Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
- Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
- Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
- Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
- Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
- Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
- Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
- Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
- Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
- Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
- Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
- Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
- Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
- Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
- Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).
