Abstract
Adaptif bağışıklık, T hücreleri ve antijen sunan hücreler ("APC 'ler') arasındaki dinamik etkileşimler ile düzenlenir 'immünolojik sinaps" olarak adlandırılır. Bu samimi hücre-hücre arayüzleri içinde MHC / Ag-TCR, F-aktin, yapışma ayrık alt hücresel kümeleri ve sinyal molekülleri oluşturur ve hızla pişmanlık. Bu dinamikler, kritik verimlilik ve geliştirmek bağışıklık tepkilerinin kalitesi hem belirleyicileri ve dolayısıyla patolojik bağışıklık karşı koruyucu olması düşünülmektedir. Fizyolojik APC 'ile immünolojik sinaps mevcut anlayış elde görüntüleme çözünürlüğü yetersizliği ile sınırlıdır. Yapay alt tabaka modelleri (örneğin, düzlemsel lipid bilayers) mükemmel çözünürlük sunan ve son derece değerli araçlar olmuştur rağmen, doğal olmayan fizyolojik ve oversimplified bulunmaktadır. Vasküler ve lenfatik endotel hücreleri 'yarı mesleğinin önemli bir çevresel doku (veya stroma) bölmesi olarak ortaya çıkmıştırEl APC'ler '. (Profesyonel APC 'moleküler makinelerin çoğu ifade) Bu APC'Ier neredeyse düzlemsel hücre yüzeyini oluşturan benzersiz özelliğe sahiptir ve (floresan protein gazetecilere, gibi) kolayca transfectable vardır. Burada temel bir yaklaşım tarif edilecektir yeni ve geliştirilmiş bir görüntüleme ve temel antijenik sinyal süreçlerinin sorgulanmak üzere fizyolojik 'düzlemsel hücresel APC modeli' olarak endotel hücreleri uygulamak.
Introduction
T lenfositleri majör histokompatibilite kompleksi (MHC) bağlı verimli peptit antijeni (Ag) tanıma yeteneği ile karakterize adaptif bağışıklık sisteminin bir dalı vardır, T hücre reseptörlerinin (TCR'ler) 1 ile molekülleri. Naif lenfositler kurucu göç ve profesyonel Ag sunan hücreler '(ZPT; örneğin, dendritik hücreler) tarama bellek / efektör T hücreleri etkin bir periferik dokularda APC' ve potansiyel hedef hücrelerin son derece geniş bir yelpazede anket gerekir iken, lenf düğümleri içinde.
Bir APC üzerindeki soydaş Ag ilk muhasebeleştirilmesi aşağıdaki min, bunların göç tutuklama ve özel bir samimi hücre-hücre arayüzü olarak adlandırılan 'immünolojik sinaps' oluşmaya başlar lenfosit (IS). Sürekli (yani 30-60 dk) temas yükseltmek ve 2-7 sinyalizasyon sürdürmek için gerekli olan IS. Gelişmekte olan çalışmalar IS içinde, sürekli oluşumu ve hızlı r olduğunu tespitgücü ve immün yanıtları 2-7 sonuçlanan kalitesini belirlemek (örneğin, MHC / Ag-TCR, F-aktin, yapışma ve sinyal molekülleri içeren) ayrık alt hücresel sinyal mikro-kümelerin emodeling. Ancak, bu sürecin dinamik detaylar ve düzenleyici mekanizma tam olarak 8,9 anlaşılmaktadır. Bu son derece gerekli zamanmekansal görüntüleme sınırı APC yüzeylerin düzensiz topolojileri ve hücre-hücre etkileşimi uçakları kötü kontrollü yönlendirme, sorunları ile ilgili teknik zorlukları büyük ölçüde kaynaklanmaktadır 8-10 (Figure1A) yaklaşır.
Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics Şekil 1. Fizyolojik Planar hücre APC Modeli. Şematik bir T hücresi ve professio arasındaki immünolojik sinaps geleneksel görüntüleme göstermektedir nal APC (A) ve T hücresi ve bu yeni endotel düzlemsel APC modelinde (C) ile karşılaştırıldığında, geleneksel bir düzlemsel lipid iki katmanlı APC modeli (B). , Dramatik, yani mekansal (z görüntüleme düzey çözünürlük ~ 1 mikron) ve temporal (ödün; Profesyonel ZPT fizyolojik immünolojik sinaps sağlar, ancak (çözünürlük ~ 0.2 mikron Optimum xy görüntüleme düzlemine göre yani) kötü amaçlı hücre-hücre arabirimi sunar ihtiyacı nedeniyle defalarca görüntüleme çözünürlüğü) tüm z görüntüleme uçakları ile tarayın. Iki tabakalı modelleri Optimal zamanmekansal görüntüleme çözünürlüğü sağlar düzlemsel topoloji var, ama aynı zamanda son derece, fizyolojik olmayan ve sert basitleştirilmiştir. Bu endotel hücre modeli fizyolojik bir ortamda optimum mekansal ve zamansal görüntüleme çözünürlüğü sağlamak için klasik bir APC fizyolojik substrat ile lipit bilayers düzlemsel topolojisini birleştirir.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Önceki çalışma kısmen uygun xy görüntüleme paralel olan tek bir planına T hücresi aktivasyonu aracılığı ile yüzey sabitleme örneğin, uygun uzaysal çözünürlük (sağlar geliştirmek düzlemsel alt-tabaka bir model (yani, lipid çift tabakaları ve antikor-kaplı yüzeyler), bu engeller etrafından olan düzlem) 11-15 (Şekil 1B). Bu modeller, dinamik aktin / TCR sinyalizasyon mikro kümelerin 7,11-14 keşif dahil olmak üzere T hücrelerinin antijenik sinyalizasyon, kontrol moleküler / hücre içi dinamikleri önemli bilgiler kolaylaştırmıştır. Bununla birlikte, bu modeller doğal basitleştirilmiş edilir, yanı sıra, katı (Şekil 1B) (3-boyutlu bir topolojik özelliklerin geliştirilmesi / çalışma engelleyen). Bu nedenle, phy böyle bulguları ilişkilendirmek nasıl belirsizdirsiologic hücre-hücre immün gözetim.
Hala understudied rağmen, damar ve lenfatik endotel hücreleri büyük olarak ortaya çıkmaktadır (yani ~ 1000 kat tüm profesyonel APC'lerce daha numaraları, daha fazla) 'yarı profesyonel' APC '16-18 periferik bölmesi. (Örneğin, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1; fakat CD80 ve CD86) Bu hücreler, MHC-I-, MHC-II-ve ko-stimülatör moleküllerin çok sayıda dile ve stratejik olarak Onlar özel nöbetçi işlevleri 16-18 hizmet kan doku arayüzünde konumlandırılmış. Daha önceki çalışmalar, endotel hücrelerinin etkili bir efektör / bellek ama saf olmayan, T hücrelerini 19-25 yeniden stimüle edebilirler. Bu nedenle, endotelyal hücreler gibi T hücresi aktivasyonu, farklılaşması, hafıza ve tolerans 16,17,26 yerel etkisi gibi periferik dokular içinde adaptif bağışıklık tepkilerinin, efektör aşamasında özel APC rol oynaması olasıdır. Criin vitro yetiştirilen ola- rak, endotel hücreleri neredeyse düzlemsel hücre yüzeylerine formu (floresan protein muhabir olan, örneğin) kolayca transfekte bulunmaktadır. Bu özellikler, hücre-hücre etkileşimleri 19,27 sırasında topolojik dinamiklerin yüksek uzaysal çözünürlüklü görüntüleme için idealdir. Böylece endotel hücreleri tepkileri (Şekil 1C) 19,20 antijen tanıma sürücü ve düzenleyen moleküler / hücre içi biçimlenme mekanizmalarının çalışma için belirgin uygun bir fizyolojik 'düzlemsel hücresel APC' model olarak hizmet olabilir.
Daha önce yapışma ve transendoteliyal göç 27 sırasında lökosit-endotel etkileşimi detaylarını incelemek için (plazma zarı ve sitoplazmada floresan protein üreticileri ile endotelin hücrelerin transfeksiyonu dahil) tamamlayıcı görüntüleme tekniklerini kurulan lökositler aktif, dinamik tarafından endotel yüzeyine soruşturma olduğunu gösterdi Ekleme birmikronaltı ölçek d retraksiyonu, aktin-zengin silindirik çıkıntılar (~ çap ve derinlikte 200-1,000 nm) invadosome benzeri çıkıntılar (yani, 'ILPS') 27,28 olarak nitelendirdi. Bu görüntüleme yaklaşımları daha da bildirilen 19,20 olarak T hücre-endotelyal immünolojik sinaps yüksek uzaysal çözünürlüklü görüntüleme için ilk yöntemler geliştirmek endotel APC fonksiyonunun yararlanmak ve ayrıca burada açıklamak için protokollerin oluşturulması ile birlikte genişletilmiştir. Bu yeni düzlemsel hücresel APC modelinden elde edilen bir merkez bulgu T hücresi ILPS ilk Ag algılama teşvik ve sonraki sinyalizasyon sürdürülmesi hem işlev olmasıdır. Nitekim, (stabilize ve kalsiyum akı başlangıç yanıt tahakkuk eden) TCR ve aktif sinyal gibi PKC-Q, ZAP-70, fosfotirosinin ve HS1 düşündüren moleküllerde gösteri zenginleştirme birden ILPS'nin diziler. Bu nedenle, ILPS TCR-sinyal mikro üç boyutlu fizyolojik eşdeğer temsil etmek gibi görünüyordüzlemsel iki tabakalı modellerinde görülen kümeler. Bu yaklaşım, bu nedenle, hassas ortaya / raporlar, moleküler ve mimari (ve biyomekanik zımni) dinamikleri aksi saptanabilir değil.
Burada açıklanan yöntem adaptif bağışıklık tepkilerinin temel mekanizmaları sorgulamak için yeteneğimizi geliştirmek amacıyla profesyonel APC ve yapay APC substrat modelleri arasında köprü için yararlı olacaktır. Burada odaklama CD4 + efektör Th1-tipi / hafıza hücresinin aktivasyonuna iken, aşağıda ele alındığı gibi, bu temel yaklaşım, hali hazırda, T hücre türleri ve Ag'lerin geniş bir çalışma için modifiye edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan tüm deneyler birincil insan T hücreleri ve piyasada mevcut birincil insan endotel hücreleri, insan denekleri (dermal veya akciğer mikrovasküler EC) yapacağı her türlü araştırma protokolü kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış olması gerekir ve yazılı onam temin edilmelidir ile yürütülmektedir Her kan bağışı. Bu protokolü kullanarak yapılan deneyler Beth İsrail kadın papaz Tıp Merkezi IRB tarafından onaylanmıştır.
1. Hazırlanması İnsan CD4 + Th1 Efektör / Bellek T Hücreleri
- Alkol ile silin ven, vericinin koluna turnike uygulayın ve iğneyi. Yavaşça EDTA'lı vacutainer içine kanın 15 ml çizin. Kan çizilmiş edildiğinde, iğneyi çıkarmadan önce turnike çöz. Hemen iğne çıkarıldığında steril gazlı bez ile yara basınç uygulayın.
- 50 ml'lik bir tüp kan transferi. 1 seyreltisi (nihai hacim 30 mi) bir 1: at oda sıcaklığında RPMI-1640 ekleyin. Dikkatle seyreltik Bindirmebu, oda sıcaklığında Ficoll-Paque gibi lenfositlerin önceden süzüldü izolasyon ortamında 15 ml içeren, iki 50 ml'lik tüplere d, kan.
- Sallanan kepçeli rotor içinde 1.200 x g'de 30 dakika süre ile oda sıcaklığında gradyanı santrifüjleyin. (RPMI-1640 içinde 500 mi, 50 mi FCS, 5 ml penisilin / streptomisin), T hücresi ortamı hazırlar santrifüj bulunuyor.
- Santrifüj 50 ml tüp çıkarılması üzerine dört kat dikkat edilmelidir: kırmızı kan hücrelerinin bir pelet alt, Paque, beyaz kan (lenfositler dahil) hücreleri ve plazma içeren bir hücre tabakası. Dikkatli bir şekilde 50 ml Falcon tüpüne pastör pipet ve transfer akyuvar tabakayı kaldırmak.
- (20 ml kadar) RT RPMI-1460 eklenmesi ve 1200 x g'de 5 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüj edilerek beyaz kan hücre tabakasını yıkayın. T hücre ortamı, 1 ml beyaz kan hücrelerini yeniden süspanse edin. 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 250 ul T hücre ortamına 1 ml hücre süspansiyonu 5 ul ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipet ile karıştırılır.
- 25 ul seyreltik ekleme25 ul% 0.4 Tripan mavisi d hücre süspansiyonu. Standart bir hemasitometre her iki tarafında karışımın 10 ul ekle.
- Düşük güç ışık mikroskobu hemasitometre yerleştirin. 10X objektif kullanılarak Tripan mavi boya dışlanan ve hemasitometre her iki tarafında orta meydanda mevcut olan yaşayan hücrelerin sayısını.
- Hücre konsantrasyonunu hesaplamak için, 100 (seyreltme faktörü) 2 kareler ortalamasını çarpın ve sonra çarpma tarafından 10 4 hücre / ml sayı vermek.
- T hücre ortamı içinde 0.5 x 10 6 hücre / ml nihai konsantrasyon ayarlayın. 1 ug bir son konsantrasyon ekleme / hücrelere bakteriyel süperantijenler stafilokok enterotoksin B (SEB) ve toksik şok sendromu toksini 1 (TSST) her biri ml. 72 saat (37 ° C ve% 5 CO2) Kültür CD4 + T hücre popülasyonu genişletmek.
- Pelet T hücreleri (1200 xg, 5 dk) ve T hücre ortamı içinde 0.5 x 10 6 hücre / ml'de tekrar süspansiyoninsan IL-15 (20 ng / ml) eklenmesi. Transfer T150 balonuna lenfosit. Gerektiği gibi tam orta IL-15 / 24-48 saat her bölünmüş hücreleri genişletmek için devam (medya renklerine göre, yani, ortam hafif sarı pembe döner zaman) sonra. 15 güne kadar için ortaya çıkan lenfosit nüfus koruyun.
NOT: Tasarım gereği, bu protokol etkinleştirmek ve özellikle genişletmek SEB ve TSST reaktif olan CD4 + T hücrelerinin alt kümesi ve daha sonra Th1-benzeri efektör / bellek fenotip doğru onları götürmek olacaktır. Diğer beyaz kan hücreleri hayatta ve hali hazırda akış sitometrisi ile tespit edilebilir şekilde adım 1,10, hücrelerin en az% 95 CD4 +, CD45RO + T hücreleri, 19 olacak şekilde, bu koşullar altında büyüyebilir başarısız. Arzu edildiği takdirde, daha fazla saflaştırma hali hazırda ticari olarak temin edilebilen bir antikor / manyetik boncuk esaslı pozitif ya da negatif seçim kitleri ile elde edilebilir.
2. İlköğretim İnsan Endotel Hücre Kültürü Başlangıç
<ol>3. Genel Yarma ve Endotel Hücreleri Genişleme
- ~ 90-95 confluency hücreleri büyütün. Bu 2-5 gün sürebilir. Bölme için,medya kaldırmak ve PBS ile durulayın. PBS çıkarın ve taze 1x tripsin minimum hacimde (T25 için 0.5 ml veya T75 için 1.5 ml) ile değiştirin. Yavaşça tripsin ile tüm yüzeyini kapsayacak şekilde girdap. 37 ° C'de inkübe edin ~ 5 dakika ° C. Düşük güç ışık mikroskobu kullanılarak plaka hücrelerin dekolmanı izleyin.
- Hücrelerin büyük çoğunluğu yuvarlak veya müstakil görünür olduğunda, önceden ısıtılmış tam EGM-2 orta (katma tripsin hacmine kıyasla, yani) 5 birimi ekleyin ve hafifçe tüm hücreleri ayırmak için balonun yüzeyi üzerine pipetle.
- 1.6-1.7 tarif edildiği gibi, bir hemositometre ile endotel hücreleri sayın. Santrifüj hücreleri (5 dk, 1200 xg) pelet. Süpernatantı. Önceden ısıtılmış tam bir EGM-2 MV maddesiyle ml başına 0.500.000 hücreleri konsantrasyonu ayarlayın.
- Bakım için uygun FN kaplı yemekleri veya şişelere hücrelerin hacimde aktarın. Yavaşça girdap ve inkübatör koyun. Kaplamanın 6-12 saat içinde ortam değiştirin. Medya shoHer 48 saat sonra yaklaşık olarak değiştirilebilir ULD.
4. Endotelyal HÜCRE NAKLİ
Not: Primer endotelyal hücreleri, en yaygın kimyasal ve elektroporasyon gibi yöntemler ile transfeksiyon dirençli bulunmaktadır. Aşağıda tarif edilen transfeksiyon Nükleer bazlı yöntem nispeten yüksek transfeksiyon verimi (~% 50-70) sağlar. Etkili bir alternatif bir yöntem, uygun viral vektörler (Malzeme Tablo yorumlara bakınız) neden olduğu enfeksiyona kullanımıdır.
- (Steril koşullar ya da örneğin Delta-T plakaları gibi bir mikroskop kültür plakaları içinde, PBS içinde fibronektin (FN) 20ug / ml,% 90-95 confluency.Coat bir nihai yoğunluk için HLMVECs ya HDMVECs bir T25 veya T75 şişeleri (gerektiğinde) hazırlayın (2.1) yukarıda tarif edildiği gibi) ile aşama 6, bir 24-yuvalı hücre kültürü plakasının (bir oyuk içine yerleştirilen bir adım 5) ya da 12 mm yuvarlak cam lameller.
- Her bir 24 çukuruna mikroskobu kültürü tam EGM-2 kültür ortamı 1 ml platesor 0,5 ml ilave edilir ve plakalar dengeyenemlendirilmiş bir 37 ° C /% 5 CO2 inkübatör.
- Hasat ve adım oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1200 x g'de hücrelerin gerekli hacmi (numune başına 0.500.000 hücre) 3.1-3.3.Centrifuge olarak endotel hücreleri sayın. Örnek başına 100 ul RT nükleer transfeksiyon solüsyonu dikkatle hücre pelletini.
- 1-5 mikrogram DNA ile hücre süspansiyonu 100 ul birleştirin. Sertifikalı küvetin içine hücre / DNA süspansiyonu aktarın; Numune hava kabarcığı olmadan küvetin alt kapağı gerekir.
Not: (translasyon sonrası palmitoilleme için bir sinyal içerir neuromodulin 20 N-terminal amino asit ile), hücre zarı YFP veya DsRed hedef yapılar (tek başına zar-YFP, tek başına ya da zar-DsRed), tek başına kullanılan ya da ile birlikte transfekte sitoplazmik hacimsel işaretleyici (örn zara-YFP ve çözünür DsRed). Floresan protein belirteçleri birçok permütasyon kullanılabilir. - Kapakla küvet kapatın. Ile küvet yerleştirinHücre / DNA Elektroporatör bir küvet tutucu içine süspansiyon ve elektroporasyon programı S-005 uygulanır. Program bittiğinde sahibinin dışarı küvet alın.
- Küvete ön dengelenmiş kültür ortamı ~ 500 ul ekleyin ve hafifçe nükleer transfeksiyon kitinde plastik transferi pipet kullanarak küvete hücre süspansiyonu çıkarın.
- Mikroskop kültür plakaları kullanılarak deneyler önceden ısıtılmış medya (Adımlar 4,2-4,3) içeren iki yemekler arasında eşit olarak tek reaksiyonu hücre süspansiyonu bölümlemek için. 24 kuyu / plaka, bölüm 3 kuyu arasında eşit tek reaksiyonu deneyler için.
- 12-16 saat sonrası transfeksiyon tekrar nemlendirilmiş bir 37 ° C /% 5 CO 2 inkübatör inkübe hücreleri ve Ortam 4-6 saat değiştirebilir, ve.
5. Canlı Hücre Görüntüleme ve Analiz
- Hazırlama Endotel
- Gün 0: Bir nucleofe yoluyla zara-YFP ve çözünür DsRed primer HLMVECs Co-transfekteolarak ction teknolojisi canlı hücre görüntüleme kültürü plakaları üzerine adım 4 ve levha tarif edilmiştir.
- Gün 1: MHC-II ekspresyonu indükte etmek için, IFN-y (100 ng / ml) ihtiva eden taze ortam ile orta değiştirin. 2. günde, mevcut ortama 20 ng / ml TNF-a ilave edilerek transfekte edilmiş hücreleri stimüle eder.
- Gün 3, 1 ug endotelyumu kuluçkaya / bakteriyel süperantijenlerin her 37 ° stafilokok enterotoksin B (SEB) ve toksik şok sendromu toksini 1 (TSST) ml Hemen deneylerden önce 30-60 dakika süreyle ° C. '-ag' Kontrol koşulları için bu adımı atlayın.
- Lenfositleri hazırlanması
- Aşama 5.1.3 paralel olarak, tampon A 20 mM Hepes ile takviye (fenol kırmızısı içermeyen HBSS), pH 7.4 ve% 0.5 v / v, insan serum albümini, 37 önceden ısıtılmış hazırlık ° C. Kültürlü lenfositlerin bir örneğini alın ve bir hemasitometre (Adım 1,12-1,17) ile sayılarak yoğunluğunu belirler.
- 1 ile numune başına Santrifüj 2000000 hücreleri15 ml konik bir tüp içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g. Aspire medya ve Tampon 2 ml yavaşça tekrar süspansiyon hücre pelet hiçbir hücre kümeleri kalır bir şekilde.
- 1 mM'lik bir stok konsantrasyonu yapmak için DMSO içinde Fura-2 kalsiyum boya ve tekrar süspansiyon taze bir kısım çıkarın.
- (2 uM son konsantrasyon), T hücresi süspansiyonuna Fura-2 stok çözeltisi 2 ul eklenir, tüpün kapağı ve boyanın eşit bir dağılım sağlamak için tersini tüp hemen karıştırın. 37 ° C'de inkübe edin 30 dakika boyunca ° C.
- Adım 5.2.2 deki gibi santrifüj. Aspire Tampon-A ve taze Tampon-A 20-40 ul yavaşça ama iyice tekrar süspansiyon lenfositler.
- Canlı hücre Görüntüleme Kurulum ve Devralma
Not: sistemleri çok çeşitli dik olarak ters ışık mikroskobu ile canlı hücre flüoresanı görüntüleme için kullanılabilir. Temel gereksinimler bir floresan ışık kaynağı ve filtreler, bir CCD kamera, motorlu filtre anahtarlama ve kepenkleri, ısıtmalı sahne (ya da Microsc dahilope monte ısıtmalı odacık) ve otomatik görüntü elde etmek için yazılım. Bu protokol, yüksek sayısal açıklık, yüksek büyütme (yani, 40X, 63X) immersiyon yağı lensler gerekli uzaysal çözünürlük elde etmek için gereklidir. Özel bakım tüm gerekli 340/380 nm uyarma dalga boyları ile uyumlu olarak Fura-2 tabanlı kalsiyum görüntüleme için uygun floresan kaynağı ve lens seçiminde dikkat edilmelidir. (Standart yeşil ve kırmızı floresans filtre setleri ile uyumlu) alternatif bir yaklaşım olmayan ratiomentic kalsiyum duyarlı boyalar ile birlikte kullanılabilir (örneğin, Fluo-4, Rhod-3), bu doğru, kalsiyum akışı miktarını belirlemek ve göreceli sağlayamaz se / kantitatif okuma.- Mikroskop sistemi açın (operasyon, mikroskop, CCD kamera, filtre tekerleği ve xenon lamba için PC).
- Belirlenen yazılımını açın.
- Otomatik çok kanallı time-lapse görüntüleme için kurmak mikroskop / yazılım. Reklamın sıralı satın Dahilifferential girişim kontrast (DIC), standart yeşil floresan, standart kırmızı floresan ve standart 340 ve 380 nm uyarma Fura-2 görüntüler. 10-30 sn ve 20-60 dk ~ bir toplam süresi edinimi için aralığını ayarlayın.
- Fura-2 görüntüleme için poz sürelerini ayarlayın.
- Taze objektif yağ ekleyin ve ısıtma sahne adaptör üzerine Tampon-A sadece 0.5 ml içeren bir mikroskop çanak montajı ve hemen 37 dengelenmeye açmak ° C (~ 2-3 dakika sürer).
- 20 ul pipet kullanarak monte mikroskop çanak odasına Fura2 yüklü lenfositleri ekleyin.
- Parlak bir alan görüntüleme açın. Eyepieces ışık yolu seçin. Miscoscope çanak alt ile temas hedefi getirmek için kaba odak düğmesini kullanın. Çanak alt kısmında yerleşmiş T hücreleri üzerinde odaklanmak için mercek ve ince odak düğmesini kullanınız.
- En az 10 hücre ihtiva eden bir alanı seçmek için xy sahne denetimlerini kullanın. Önlemekaşırı kalabalık olan bu görüntüleme eserler yaratacak şekilde alanlar ve hücre kümeleri.
- Parlak alandan Anahtarı ışık kaynağı floresan için. CCD kamera mercek görüntüleme geçin. Set satın alma parametreleri (örneğin, maruz kalma süresi, dedektör kazanç ve binning). Fura2-340 ve Fura2-380 görüntü dinlenme program tekniği kullanılarak (genellikle ~ 200-1,000 milisaniye aralığında, her biri için benzer poz süresi ile başlayan).
- Her lenfosit için Fura2-340 / Fura2-380 hesaplamak için Adım 5.4.1 açıklanan yöntemleri kullanın. , Fura2-340 ve Fura2-380 pozlama süreleri ayarlama görüntüleri elde ve ortalama değerler 1'e yakın dek oranları hesaplama tekrarlanan yineleme gerçekleştirin.
- Mem-YFP ve DsRed için poz sürelerini ayarlayın.
- Bir miscroscope çanak ile adım 5.3.3.1 kullanılan mikroskop çanak değiştirin transfekte aktif ve SAG tedavi (veya işlenmemiş; kontrol) içeren hücre kültürü inkübatör (Merdivenleri 4.5 den HLMVECs veya HDMVECs.1). Hızla ortamını çıkarın önceden ısıtılmış Tampon-A ~ 1 ml ilavesi ile bir kez durulama atılabilir bir transfer pipeti kullanarak. Aspire edin ve daha sonra tampon A-0.5 ilave edin.
- Parlak floresan pozitif transfektan endotel hücreleri mevcut ve iyi biçimlendirilmiş hücrelerarası kavşaklar ile sağlıklı göründükleri alanları belirleyin.
- Mem-YFP ve DsRed için satın alma parametreleri (örneğin, maruz kalma süresi, dedektör kazanç ve binning) ayarlayın. Her kanalda ortalama floresan sinyal yoğunluğu% 25 ve dedektörün dinamik aralık% 75 arasında düştüğünü emin olunuz.
- Fura-2 görüntüleme için poz sürelerini ayarlayın.
- Canlı hücre görüntüleme deney.
- Düzeninizle görüntülerin çeşitli aralıklarla görüntü elde etme başlayacak ve yakalamak için otomatik yazılımını kullanın.
- Satın alma sırasında küçük bir hacme (P-5 ucu sokarak mikroskop çanak görüntüleme alanının merkezine (adım 5.2 dan itibaren) konsantre Fura-2 yüklenmiş lenfositlerin ~ 5 ul uygulayınveya P-20) yakın yavaş yavaş objektif ve çıkartılması merkezine ortama pipet.
- Lenfositler görüntüleme alanına yerleşmek gibi, odak ince ayarlamalar T hücre endotelin hücre arayüzü (immünolojik sinaps) odak düzleminde korunur emin olun. 40 ve 63X amacı ile, ~ alan başına 10-20 hücre optimum bulunmaktadır. Daha az hücre görüntüleme alanı adımı yineleyin 5.3.4.2 görülmektedir edin.
- Deney istenen gözlem aralığı yarıştırılır sonra, maksimum kalsiyum akışı / Fura-2 sinyal sinyali uyardığı 2 uM'lik bir son konsantrasyona kadar (5.3.4.2 gibi tekniği kullanılarak) görüntüleme devam hemen miscoscope çanak içine, doğrudan iyonomisin pipetle (örn kalibrasyon aracı, analiz 5.4 bakınız.).
- Deney istenen gözlem aralığının 5.3.4.4after alternatif yarıştırılır olarak hemen Tampon-A aspire ve 0.5 ml sabitleme çözeltisinin (PBS içinde% 3.7 Formaldehit) 5 dakika için en ile değiştirinRT, PBS ile üç kez çalkalayın. Sonra 6. adıma geçin.
- Canlı hücre Görüntüleme Analizi
NOT: edinilen dosyaları kaydettikten sonra, doğrudan analiz edilebilir veya off-line görüntü analiz yazılımı geniş bir uygulama çeşitli analiz için ihraç etti. ImageJ hemen her kazanım yazılım paketi ile serbestçe kullanılabilir ve uyumlu bir özellikle değerli, çok yönlü bir pakettir. Adımlar 5,1-5,3 açıklanan görüntüleme deney tasarımı lenfositler ve endotel APC yokluğunda ve soydaş sarkmaya varlığı arasındaki etkileşimin yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük dinamiklerini verecektir. Hücresel morfometrik / sinyal dinamiklerinin görüntüleme verileri ele alırken neredeyse sınırsız analizler mümkündür. Bu özel protokol açıklanan özel amaçları koordineli lenfosit göçü ve dinamik birlikte (yani kinetik ve hücre içi kalsiyum akı seviyelerini) sinyal ölçmek için vardırarkadaşları özgü özellikleri (örneğin, ILPS / Podo-baskı) odaklanarak immünolojik sinaps mimarisinde değişir. Ayrı standart ve standart dışı olan aşağıdaki örnekler analiz (yani, bu deneyler / sorular için özel olarak geliştirilen).- Lenfosit Kalsiyum akı ölçün
- Lenfositlerin eklenmesinden önce iktisap edilmiş ilk Fura2-340 (340 nm EX-510 nm EM) ve Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) görüntüleri seçin. Ilgili her kanal için zaman serilerinde tüm görüntüleri onları çıkarmak dijital arka plan resimleri olarak kullanın ve.
- Her zaman noktası için arka plan çıkarılır Fura2-340 ve arka plan çıkarılır Fura2-380 görüntüleri (yani 340 nm EX-510 nm EM-arka / 380 nm EX-510 nm EM-arka) bir dijital oranı görüntü oluşturun.
- Uygun yazılım çizim aracı seçin. I dairesel bölgesini çizmek için ekranda tıklayınHer lenfosit etrafında (YG) nterest. Bunlar her lenfosit ve zaman dilimi için bir piksel ortalama oran değerini üretecektir.
- Uygun bir yazılım uygulaması (örneğin, hesap tablosu programı) kullanılarak zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplandı oranı çizilir. Alan başına lenfositlerinin bütün değerlerin oranım toplanmasıyla ve her bir zaman noktası için lenfositlerin sayısı ile bu değer bölünmesi ile deney için ortalama kalsiyum akısını hesaplayın
- Lenfosit göç izleme analiz yapmak.
- Her videodan DIC kanalını kullanarak uygun bir hücre izleme yazılımı uygulamasını (örneğin, ImageJ) kullanılarak hücre T hücre göçü analiz edin. ImageJ Hücre Takip Plugin kullanarak, el ile her ilerici çerçeve içinde üzerine tıklayarak her çerçeve içinde her hücrenin merkezini belirlemek.
- Ortaya çıkan seri xy koordinatları kullanın (örneğin, göç yolları izleri) ortalama hızı (toplam mesafe göç / toplam aralığını hesaplamak için of görüntüleme) ve eğrilik (toplam mesafe) / ilk ve son görüntüde hücre konumu arasındaki doğrusal uçtan uca mesafe göç etti.
- Bir hücre tarafından hücre bazında kalsiyum akı (5.4.1) dinamikleri ile bu parametreler Çapraz korelasyon.
- IS içinde Podo-print / TDP Yoğunluk değerlendirin
- Her T hücresi içerisinde oluşturulabilir İLP toplam sayısını tanımlandığı gibidir aralıklarla (örneğin, T hücreleri 5 dakika sonrası ekleme). Bunlar lenfosit yapışma bir yerinde endotelyal APC üzerinde sitoplazmik DsRed karanlık çevrelerin ile lokalize co ayrık mikron ölçekli floresan membran YFP halkaları tespit edilebilir.
- Bir hücre tarafından hücre bazında kalsiyum akı (5.4.1) dinamikleriyle ortaya çıkan 'ILP endeksleri' Çapraz korelasyon.
- Podo-print / ILP ömürleri ölçün.
- Verilen her Podo baskı / ILP için bir ILP görünür iken son kez noktası olarak ömürlerini hesaplamak IS - zaman noktasını o zaman Podo baskı / TDP fibirinci görünüyordu. Ortalama ILP IS hem başına yaşam süreleri.
- Bir hücre tarafından hücre bazında kalsiyum akı (5.4.1) dinamikleri ile bu yaşamlar Çapraz korelasyon.
- İlk TDP oluşumu ve kalsiyum akı arasındaki zamansal ilişkiyi değerlendirmek.
- Her lenfosit için kalsiyum ilk başlangıçta 19 üzerinde yükselir hangi zaman noktasını (çerçeve) belirlemek.
- Her lenfosit için ilk Podo baskı / ILP görünen hangi zaman noktasını belirlemek.
- Her lenfosit için başlangıç Podo baskı / İLP o gelen ilk kalsiyum akı zaman noktasını çıkarılarak bir 'offset zamanı' hesaplayın. Bir alandaki tüm lenfositlerin için değerlerinin ortalamasını alın. Pozitif değerler negatif sayılar tersini gösteriyor, oysa TDP formasyonu kalsiyum akışı öncesinde göstermektedir.
Not: 1 tarif edildiği gibi bu deneyler hali hazırda ticari olarak temin edilebilir, paralel duvar akış görüntüleme odaları kullanılarak fizyolojik olarak ilgili kesme laminer akışı altında gerçekleştirilebilir9.
- Lenfosit Kalsiyum akı ölçün
6. Sabit hücre Görüntüleme ve Analiz
- Sabit uç T hücre-endotelyal oluşumu ve boyanması IS
- 1'de tarif edildiği gibi endotel hücrelerinin T hücrelerini hazırlamak hazırlanması (- / + SAG) Aşama 5,1 olarak (transfeksiyon, Aşama 5.1.1 opsiyoneldir). Kültürlü lenfositlerin bir örneğini alın ve bir hemasitometre (Bölüm 1) ile sayılarak yoğunluğunu belirler.
- 3 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj en az 3 x 10 5 lenfositler / örnek bir lenfosit kültür hacmi eşdeğer aktarın. Süpernatantı ve Tampon A-lenfosit pelet (Aşama 5.2.1) 6 x 10 5 lenfosit / ml konsantrasyonu tekrar süspansiyon.
- Hücre kültürü inkübatöründe endotel hücreleri çıkarın ve arka arkaya aspirat ortamı (her seferinde bir örnek işlem) ve lenfosit süspansiyonu (3 x 10 5 lenfositler / numune) içinde 0.5 ml ile değiştirin ve 37 yerine C ıncubator.
- Uygun kuluçka sürelerinden sonra, yukarıdaki kuyulardan aspire orta kaydetti ve (24 plaka ~ 300-500 ul, örneğin) numuneyi tamamen karşılamak için yeterli Sabitleme Çözüm (PBS içinde% 3,7 formaldehit) ekleyin. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- PBS numune 3 kez durulayın. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca birincil antikor eklenerek leke (listesine bakınız). Birincil antikor bir hücre içi protein yönlendirilir, ek permeabilization aşama tamamen oda sıcaklığında 1 dakika boyunca numune karşılamak için yeterli besleyici çözeltiyi (PBS içerisinde% 0.01 Triton X-100) eklenmesi ile yapılması gerekmektedir. PBS numune 3 kez durulayın. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca (ve bazı durumlarda eş zamanlı flüoresan falloidin olarak) uygun bir ikincil antikor ekleyin.
- Bir görüntüleme slayt yuvarlak cam lamel monte edin. Sabit uç T hücre-endotelyal oluşumu ve Boyama IS. Mikroskop sahnede örnekleri içeren görüntüleme slayt görüntüleme yeri başlayacak ve 63X yağ seçinamaç. Taze daldırma yağı sürün.
- Odak düzlemi bulmak için aydınlık alan görüntüleme modu ve göz mercekleri kullanın. Epifloresans geçin ve göz mercekleri vasıtasıyla numune kontrol edin. Ilgi alanı seçin. Lazer tarama moduna geçin.
- Hızlı tarama modunu kullanma ve mümkün olan en geniş alanın tek tek, ideal olarak, belirli bir sinyal yoğunluğu ulaştığı şekilde sinyal optimize etmek lazer gücü ve her kanalın kazancını ayarlamak çalışan ~% 25 ve dinamik aralık fazla% 75, en az dedektörlerin.
- Manuel odak kontrolleri kullanarak, hızlı bir şekilde Z ekseni üzerinden tarama ve kesit üst ve alt limitlerini (genellikle tüm bilgilerin ~ 15 mikron kalınlığında içinde bulunan olmalıdır) belirlemek. ~ 0.2-1.0 um aralığında Z ekseni kesit kalınlığı seçin.
- Son olarak, yakınlaştırma / ilgi ve davranış tarama belirli bir bölgeye görüntüleme alanını kırpar. Çok parlak ve spesifik floresan si olan ek olaraknumunede gnal, yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme edinme tarama ve satın alma parametreleri ayarlamalar yapma yineleme gerektirir. Amaç Kayda fotoğraf beyazlatma olmadan maksimum xy ve z-ekseni çözünürlüğü, elde etmektir.
- Niteliksel uygun bir yazılım uygulamasından (örn Resim J) üzerinden ortaya çıkan optik bölümlerin dijital 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapılarak IS 3D topoloji topoloji analiz. Benzer uygulamalar sayesinde kantitatif floresan sinyal dağılımını değerlendirmek (örneğin, Pearson co-lokalizasyon ve bağlaşık floresan yoğunluğu hat-tarama analiz ve ortogonal inceleyen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotel hücreleri kullanılarak ve fizyolojik karmaşıklığı ve profesyonel APC'lerin deformabilitesi ile düzlemsel lipid bilayers modelin çözünürlüğü avantajlarını birleştiren bir roman görüntüleme yaklaşımı (Şekil 1) geliştirilmiştir. 2 ile bu gözlenen tipik göç, kalsiyum akı ve topolojik dinamikleri örnekleri sağlar Şekil yaklaşım. Endotel üzerindeki sarkma yokluğunda, SAG-spesifik CD4 + Th1 lenfositler hızla polarize, yaymak ve kalsiyum flukslama olmadan endotel yüzeyinde (Şekil 2A) üzerinde göç yanal (gösterilmemiştir). ~ 5-10 dakika içinde, bu limfosit endotel tabaka boyunca bir transmigrasyonu başlatır. Endotel üzerine SAG yükleme varlığında, bir "kızarmış yumurta 'topolojisi ile simetrik olarak yayılır lenfositler (örneğin, 30-60 dakika boyunca) hücre içi kalsiyum akısı (Şekil 2B; Film 1) temin başlatır sergiledikleri ve bu süre içindeaz ya da hiç göç (Şekil 2C).
T hücre aktivasyonu ve Göç ve Endotel APC'lerin İmmünolojik Sinaps Topolojisi. (A) Paneller Şekil 2. Canlı Hücre Analizi sarkma olmadan endotel üzerinde T hücre göçünün zaman serisi görüntüleme bir örneğini gösterir. Üst Panel DIC görüntüleri gösterir. Göç T hücresinin ilk konum kırmızı noktalı çizgi ile gösterilir. Alt Panel göç T hücresi tarafından endotel üzerinde oluşturulan invajinasyonları gösterir. Oklar endotelyal APC yüzeyine 'invadosome benzeri çıkıntılar' (ILPS'nin) (D) T hücre oluşmasının bir sonucu olarak oluşan zara-YFP floresans geçici halkaları (~ 0,5-1 um çapında) oluşumunu göstermektedir. (B) SAG-yüklü endotel (sol mevcudiyetinde benzer bir dizi örnek gösterir; Ayrıca bakınızSinema 1) ve kalsiyum düzeyleri (sağda) dinamik değişikliklerin kantitatif iz tekabül eder. Oklar yüksek kalsiyum akısı (ii) ile ilişkilidir, kalsiyum akısı (i) başlatılmasıyla ilişkili ilk ILPS'nin oluşumu ve birden fazla ILPS'nin sonraki stabilizasyon gösterir. A ve B (C) Deneyler izleme analizleri hücre tabi tutuldu. 10 dakika (kırmızı izleri) süresi boyunca sol gösterisi temsilcisi T hücre göç yolları üzerinde DIC görüntüleri. Sağdaki grafikte yokluğunda SAG huzurunda hesaplanan göç hızları gösterir. (D) (19 değiştirilmiş) immünolojik sinaps topoloji dinamik analizi. (I) membran hedefli-YFP ve çözülebilir sitozolik RFP oluşan hassas endotelyal hücre / APC 'topoloji muhabiri sistemi' göstermektedir şematik. Silindir şeklindeki invajinasyonları oluşturmak endotel hücre yüzeyine çıkıntı Aktin-aracılı ILP g (hücresel ayak baskı türü, bir 'Podo-print' olarak adlandırılan)zar-YFP floresans halkalar gibi görünen keskin bükülmüş zarı Hobileri artış (yani, yüzüne en inceledi silindirin duvarları). Bu lokuslardaki sitozol deplasman ve dışlama sitozolik RFP olarak koyu halkaları görünür. DIC ve (ii) SAG huzurunda böyle analizin bir örnek göstermek floresan görüntüleri (ayrıca Sinema 2 mukabil bakınız). Tek bir başlangıç Podo baskı / ILP> 20 15 dakika boyunca ILPS'nin stabilize bir diziye gelişir. Zar-YFP bir halka hariç sitozolik RFP bir bölge örtüştüğünü sayede 15 dakika (iii) Mavi kutu tek Podo baskı / İLP yüksek çözünürlüklü görünüşünü göstermektedir. Kesikli çizgi (iv) floresan yoğunlukları kantitatif çizgi tarama analizini göstermektedir. Ölçek çubukları = 5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Daha önce belirlenmiş olduğu gibi, lenfosit actively prob uzanan aktin ve HS1 (bir cortactin homolog) tarafından endotel yüzey bakımından zenginleştirilmiş ve WASp- ve src bağımlı çıkıntılar 'invadosome benzeri çıkıntılar olarak adlandırılan; (ILPS'nin her biri ~ çapında derin 0,5-1 um) 27,28. Membran hedefli floresans proteini (FP) transfeksiyonu hücre-hücre yüzeylerinde hücre içi topolojik dinamik için çok hassas bir muhabir sağlamak için gösterilmiştir. Bu şekilde, bu flüoresan zara-AP bu parlak halkalar T hücresi ILPS'nin uzantıların bir sonucu olarak, T hücresi-endotelyal etkileşim sırasında bükülme zarın göstergesidir gösterilmiştir. Burada gösterilen ve önceki çalışmalarda 19,20, o küçük hızla ILPS form ve ciro kümeler (yani, 10-30 sn ~ ömürleri) sarkma olmadan endotel üzerine T hücrelerinin yanal göçü sırasında (Şekil 2A ise ), bunlar son derece kararlı (yani ~ 30 dak ömürleri) ve varlığında yoğun diziler içine birikir haleEğilme (Şekil 2B). Ayrıca, ILPS ve kalsiyum başlatma kinetik analizi, ILPS kalsiyum sinyalizasyon önce olduğunu göstermektedir onlar MHC-II / Ag tanıma işlemi (Şekil 2Bii) yardımcı düşündüren ('zamanı Offset'). Buna ek olarak, ILPS'nin dizileri maksimum kalsiyum akısının (Şekil 2Bii) ile orantılı meydana stabilize edilmiştir. Fikir zar floresan halkalar endotel APClerde ayrık invajinasyon noktalar sürüş T hücre çıkıntılar uygun, her durumda bu halkalar çözünür DsRed tarafından bildirilen yerinden / dışlanan sitoplazmanın bölgeleri (uzaysal ve kinetik korelasyon gösteri ile teyit edilir; Şekil 2D ve Movie 2).
Şekil 3 sabit uç nokta konfokal görüntüleme çalışmaları örnekleri sağlar. T hücreleri ve endotel APC 'arasında oluşan SAG ISS mevcudiyetinde birlikte kuluçkaya 10 dakika sonra i tespit ile görüntülendimmuno-floresan boyama ve konfokal mikroskopi. Bu çalışmalar ILPS özellikle ilgili ISS içinde kritik moleküllerin hücre içi dağıtım dinamiklerinin analizi ve sinyal aktiviteler sağlar. Özellikle, iskelet / sitoskeletal düzenleyici (aktin, HS1 Şekil 3A) antijen sunumu / tanıma (CD3 / MHC-II, Şekil 3B) adhezyon (ICAM-1, LFA-1, talin Şekil 3C) ve antijenik sinyal (PKC -Q; Şekil 3D) Podo baskılar / ILP içinde birlikte zenginleştirilmiş görülmektedir. Konfokal seri bölüm z-yığınlarının Dijital rekonstrüksiyonu, T hücre-endotelyal endotelyal APC yüzeyinde çıkıntılı T hücresi ILP noktalanan bir ayrık 3 boyutlu mimari (Şekil 3Aii, Ci etti IS Şekil 2D'de gösterilen tamamlayıcı kanıt sağlar iii, D). (Şekil 3Civ).
T hücre-endotel hücre İmmünolojik Sinapslar Moleküler Dağıtım Dynamics Şekil 3. Sabit Numune Analizi. Lenfositler 30 dakika boyunca SAG-yüklü endotel üzerinde kuluçkaya sabit ve lekeli. Belirtilen panellerde endotelyal hücre zan-YFP veya -DsRed ifade önceden transfekte edildi. (A) Örnek görüntüleme göstermektedir aktin (i) ve HS1 (a cortactin homologu, ii) endotelyal flüoresan zara-YFP halkalar (örneğin, 'merkezi ile ilişkili mikro-kümeleri immünolojik sinaps periferinde ko-zenginleştirilmiş Podo-baskılar '; T hücre ILPS Podo-baskı görünümünü sorumlu olduğunu teyit) Şekil 2D bakın. Bir yan görünüm (ii. 90 ° Projeksiyon) ILPS (19 değiştirilmiş) z görüntüleme düzleminde 3 boyutlu çıkıntı temsil ettiğini göstermektedir. (B), T hücresi TCR (i) ve endoth temsili zenginleştirmeElial MHC-II (ii) immünolojik sinaps içinde ILP / Podo-baskılar ayrı hücre içi bölümleme göstermektedir. Sırasıyla, IS-Podo baskılar ve İLP bölgesindeki ICAM-1 ve LFA-1 (C) (i) Örnek eş zenginleştirme. (I) konfokal bölümlerinin bir 3-boyutlu sayısal yeniden 60 ° (üst panel) ve 90 ° (düşük paneller ortogonal bir görünüşünü) döndürüldüğünde gösterir. (ii) yüzün en DİR bir Yakınlaştırılmış görünümü gösterir. (iii) (ii) (19 ile değiştirilmiş) kutulu bölgenin bir ortogonal kesitsel bir görünüşünü gösterir. in Talin (bir integtin / aktin bağlayıcı protein) ve aktin (iv) Örnek eş zenginleştirme ILPS'nin IS. (D) 'de aktin TCR sinyal molekülü PKC-Q Örnek eş zenginleştirme ILPS'nin IS. Her panel en yüz görünümü (sol alt kısmı) ve iki ayrı dik görünümleri (90 ° Projeksiyon) gösterir. Uzak sol ve sağ paneller kendi, ilgili komşu panellerin çoğaltır vardır kullanın, bir gökkuşağı fluorescenc kullanılarak tahmin(19 değiştirilmiş) e yoğunluğu ölçeği. Ölçek çubukları = 5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1:. T hücresi Kalsiyum Sinyali Canlı Hücre Dinamik Görüntüleme ve İmmünolojik Synapse Topoloji endotel membran YFP ifade ve 2B Şekil karşılık, SAG yüklü etkileşim Fura2 yüklü CD4 + Th1 lenfosit Time-lapse canlı hücre görüntüleme. T hücresinde;: Sol panel, hücre içi kalsiyum düzeyini (sıcak renkler, yüksek kalsiyum serin renkler, düşük kalsiyum gökkuşağı) gösterir. Endotelial, APC'nin yüzeyinde Sağ panel gösterilen membran YFP floresans. Lenfositler yayma ve İLP formasyonu başlatmak için görülür (Mem-YFP kanal flüoresan halkalarla görüldüğü gibi, yani, 'Podo baskılar'; Şekil 2BI bakınız) sürekli (30-60 dakika) hücre içi kalsiyum akısının indüksiyonu ile, ardından TCR / aktin benzer ILPS / Podo-baskı periferik diziler oluşumu ile orantılı oluştuğu düzlemsel iki tabakalı APC modelleri (Şekil 2Bii bakınız) olarak görüldüğünü 'mikro-kümelenmiş sinyal'. Çerçeveler arasındaki aralık 20 saniyedir. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 2: Immunological Synapse Topoloji vi Canlı Hücre Görüntüleme Dinamikendotel ile etkileşim endotel ZPT. CD4 + Th1 lenfosit Time-lapse canlı hücre görüntüleme (DIC, sol) bir Floresan Gazeteciler karşılık, zar-YFP (yeşil) ve çözünebilir sitozolik DsRed (kırmızı) co-ifade ve SAG yüklü Şekil 2D. Sağ paneli DIC, membran ve sitoplazma sinyallemesinin birleştirme gösterir. Membran ve sitoplazmik floresan kombine sinyaller hassas çoklu oluşumunu ve yeniden biçimlenme rapor ~ ILP çıkıntılar ile sondalama diziler T hücresi kaynaklanan 0,2-1 mikron ölçekli yüzey invajinasyonları (Podo-baskılar). Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genel olarak, bu protokol i) understudied fizyolojik APC'ler olarak endotel hücreleri soruşturma yöntemleri açıklar ve ii) 'düzlemsel hücresel APC modeli' yeni bir türü olarak. Eski ile ilgili olarak, giderek adaptif immün yanıtları 16-18 şekillenmesinde (hematopoetik APC'lerin karşılaştırıldığında, yani), periferal olmayan hematopoetik (ya da 'stromal') APC'Ier kritik olmayan gereksiz roller oynadığı takdir haline gelmiştir. Böyle 'yarı profesyonel' APC ', vasküler ve (çok profesyonel APC fazla gelmek) lenfatik endotel hücreleri arasında en 16-18 takdir arasındadır. Ancak, sinyalizasyon olaylar ayrıntıları ve bunların birleştiğinde immünolojik sinaps ölçüde soruşturulmadan kalıyor. Burada tarif edilen yöntemler gelişmekte olan bu alanda anlayışı ilerletmek için bir temel oluşturmak. Örneğin, farklı bir Adaptiv sergiledikleri bilinmektedir, farklı doku endotel üzerinde oluşturulmuş ISS çalışma için bu yaklaşımlardan uygulanmasıe immünolojik fonksiyonu (örneğin karaciğer ve lenfatik endotelin) özellikle öğretici olabilir.
Anlamlı, bu yöntem adaptif bağışıklık tepkilerinin temel mekanizmaları sorgulamak yeteneğini geliştirmek amacıyla profesyonel APC'lerce ve yapay APC substrat modelleri arasındaki uçurumu kapatmaya yardımcı olur. Düzlemsel (yani lipid bilayers, antikor kaplı cam) APC yüzeylerde Oysa, bu tür modellerin doğal sınırlıdır (birçok kritik anlayışlar 7,11-14 yol açmıştır) optimum görüntüleme sağlamak. Alternatif olarak, fizyolojik hücre-hücre tarama dinamikleri detayları bugüne kadar derinden yönlendirme ile ilgili görüntüleme sorunları 8-10 tarafından gizlenmiş oylandı. Geçerli bir yaklaşımla sağlanan görüntüleme yetenekleri benzersiz aksi saptanamayan üç boyutlu hücre içi mimari ve fizyolojik APC-T hücre arayüzü hızlı biçimlenme ortaya çıkarmak için bu engeli aşmak. Antijenik signalin yeni anlayış için bu teklif potansiyelig.
Örneğin, T hücreleri (örneğin, Şekil 2B, Şekil 3) TCR, aktin ve sinyal molekülleri ile zenginleştirilmiş ILPS'nin oluşturan kazanması bu muhtemelen, mikro-küme sinyal düzlemsel TCR'ye 3 boyutlu karşı parça üzerinde gözlenen fizyolojik olarak öne sürmek Suni APC 6,7,12-14,29-31 yüzeylerde. Bu fizyolojik ayarları altında, lenfositler yükseltmek 'signalosome' benzeri özelliklere sahip ayrı hücre içi' 3D reaksiyon hacimleri 'olarak ILPS istihdam ve önemli moleküller / etkinlikleri 32,33 yoğunlaşarak sinyal sürdürmek olabileceğini ima eder. Ayrıca, manzaraları anlamlı biyomekanik girdiler (yani, hücre-hücre kuvvet uygulaması) varlığı APC karşı TDP çıkıntı görüntüleme anlaşılmaktadır olabilir eğer. Mekanik kuvvetlerin giderek antijenik sinyalizasyon kritik kolaylaştırıcı olarak inceledi gibi tam olarak nasıl böyle güçler ise bu, nontrivialtezahür 14,34-37 belirsizliğini koruyor.
Profesyonel APC'lerce için makul bir vekil olarak bu modelin genel alaka benzer ILP dizileri benzer görüntüleme yaklaşımları istihdam edildiğinde (B hücreleri ve bir dereceye kadar) EC ve DC'ler üzerinde oluşan sinaps görülebilir ki bizim doğrudan gösteri tarafından desteklenmektedir (örn Aynı floresan yapıcılar ve BS düzlem oryantasyon düzleminin 19) kontrolü kullanın. Bununla birlikte, profesyonel APC membran yüzeylerinde karşı AT'nin göreli biyomekanik özellikleri bilinmemektedir olduğunu ve bu parametrede farklılıklar IS topoloji ve antijenik cevapların ayrıntıları etkileyebileceğini dikkate alınmalıdır.
Burada tarif edilen bir yaklaşım anahtarı çözünürlüğü yararları kuvvetle ilişkilidir. Bu da floresans sinyalinin gücü oldukça ilgilidir. Böylece, bu Floresan transfeksiyonunu ve boyama optimize özel dikkat önemlidiryüzde muhabirleri ve görüntüleme parametreleri / teknik (örneğin, maruz kalma süresi, odak, vs ...). Eski ile ilgili olarak, burada açıklanan canlı hücre çalışmaları için protokolü, genel membran ve gerçek zamanlı olarak, T hücresi-APC arayüzünde topolojik değişiklikleri (örneğin, Şekil 2, Film 1 rapor sitoplazmik belirteçlerin transfeksiyonu ile sınırlıdır 2). Buna ek olarak, bu protokol kolaylıkla endotel (in eş zamanlı olarak tanıtan / görüntüleme daha muhabir daha karmaşık analiz için modifiye edilebilir, örneğin, floresan protein-etiketli MHCI / II ve sinyal ve biyomekanik, yapıştırma, ko-stimülatör ve yardımcı önleyici moleküller ve biyosensörler dinamiği). Ancak ne yazık ki, genel bir sınırlama lenfositler bildiği transfekte etmek zor olmasıdır. Bu floresan proteinlerle canlı hücre görüntüleme için T hücrelerinin (örneğin, TCR'ye etiketli, PKC-Q, vs.) uygun kullanılmasını engellemektedir.
SüreGeçerli protokol sarkma (yaygın olarak kullanılan bir model) ile insan efektör / bellek CD4 + Th1 tipi lenfositlerin aktivasyonunu içerir, çok daha geniş olanaklar mevcuttur. Daha önce 19,20 gösterdiği gibi bu yaklaşım bu diğer CD4 + ve CD8 + alt-lenfosit öldürme tepkilerinin aktivasyonu tepkiler olarak diğer ayarlar, geniş bir dizi kolayca uyarlanabilir. Mevcut TCR-transgenik türlerinden lenfositler ve endotel hücrelerinin izolasyonu ile bu yöntem, belirli bir peptit antijenlerine 19,20 yanıtları üzerinde çalışmak da kolayca uyarlanabilir. Son olarak, mevcut bir yaklaşım, efektör / bellek T hücrelerinin incelenmesi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, esas ortak uyarıcı moleküller (CD80 / 86, normal endotel üzerinde eksprese olan), bu modelde, naif hücre prime dinamikleri çalışması için izin verebilir ile endotelyal hücrelerin bir transfeksiyonu yapılmayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
- Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
- Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
- Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
- Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
- Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
- Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
- Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
- Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
- Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
- Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
- Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
- Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
- Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
- Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
- Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
- Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
- Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
- Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
- Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
- Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
- Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
- Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
- Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
- Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).
