Vi presenterer en protokoll for å skape celle-basert signalstoffet fluorescerende konstruerte journalister (CNiFERs) for optisk deteksjon av volumetrisk neurotransmitter utgivelsen.
Cell-baserte nevrotransmitter fluorescerende konstruerte journalister (CNiFERs) gi et nytt verktøy for nevrologer til optisk oppdage utgivelsen av nevrotransmittere i hjernen in vivo. En spesifikk CNiFER er opprettet fra et humane embryonale nyrecelle som stabilt uttrykker en bestemt G protein-koblet reseptor, som kobler til G q / 11 g proteiner, og en FRET basert Ca 2+-detektoren, TN-XXL. Aktivering av reseptoren fører til en økning i den FRET signal. CNiFERs har nM følsomhet og en tidsmessig respons sekunder fordi en CNiFER klone benytter native reseptoren for en bestemt nevrotransmitter, f.eks D2R for dopamin. CNiFERs er direkte implantert i hjernen, slik at de kan avføle neurotransmitterfrigjørelse med en romlig oppløsning på mindre enn ett hundre um, noe som gjør dem ideelle for å måle volumet overføring in vivo. CNiFERs kan også brukes til å screene andre rusmidler for potensiell kryssreaktivitet i vivo. Vi har nylig utvidet familien til CNiFERs å inkludere GPCR som par til G i / o G-proteiner. CNiFERs er tilgjengelige for påvisning av acetylkolin (ACh), dopamin (DA) og norepinefrin (NE). Gitt at en GPCR kan brukes til å skape en ny CNiFER, og at det finnes omtrent 800 GPCR i det humane genom, vi beskriver her den generelle fremgangsmåten for å utforme, å realisere, og teste alle typer CNiFER.
For å forstå hvordan nerveceller kommuniserer i hjernen, er det nødvendig å ha en metode for å måle frigivelsen av nevrotransmittere in vivo. Det er flere veletablerte teknikker for måling av nevrotransmittere in vivo. En vanlig brukt teknikk er mikrodialyse, hvor en kanyle er satt inn i hjernen og et lite volum av spinalvæske blir samlet opp og analysert ved hjelp av væskekromatografi og elektrokjemisk deteksjon en. Mikrodialyse har en romlig oppløsning i størrelsesorden noen få diametere på sonden, f.eks, ~ 0,5 mm for en 200 um diameter mikrosonde. Den tidsmessige oppløsning av denne teknikken, er imidlertid langsom på grunn av samplingsintervaller som vanligvis varer i ~ 5 min eller lengre en. Videre er analyser ikke gjøres i sanntid. En annen teknikk er rask scanning syklisk voltametri (FSCV), som bruker en karbon-fiber sonde som settes inn i hjernen. FSCV har utmerket temporal oppløsning (subsecond), høy følsomhet (nanomolar), og romlig oppløsning med sonde diameter på 5 til 30 mikrometer. Imidlertid er FSCV begrenset til sendere som frembringer en karakteristisk oksydasjon og reduksjon profil med spenning på et karbon potensiometrisk sonde 2.
En tredje teknikk for å måle signalstoffer er direkte gjennom genetisk kodet nevrotransmitter (NT) biosensorer 3. Med denne metoden blir et fusjonsprotein laget som inneholder en ligand-bindende domene til en transmitter koblet til en fluorescens-resonans energioverføring (FRET) -basert par av fluoroforer 4 eller en permutert GFP 5. I motsetning til de to foregående fremgangsmåter, er disse biosensorer genetisk kodet og uttrykkes på overflaten av en vertscelle, slik som en nevron, gjennom produksjon av transgene dyr eller akutt med bruk av virale midler for å infisere celler. Hittil har genetisk kodet biosensorer er kun utviklet for detekteringg glutamat og GABA 3-5. Begrensninger med disse teknikkene har vært den lave følsomhet, i nM område, og den manglende evne til å utvide deteksjons til det store antall sendere, f.eks klassiske nevrotransmittere, nevropeptider og neuromodulatorer, som signalerer via G protein-koblede reseptorer (GPCR). Faktisk er det nesten 800 GPCRs i det menneskelige genom.
For å møte disse manglene, har vi utviklet et innovativt verktøy til optisk måling utgivelsen av noen nevrotransmitter som signaliserer gjennom en GPCR. CNiFERs (cellebasert nevrotransmitter fluorescerende konstruert journalister) er klonale HEK293 celler konstruert for å uttrykke en bestemt GPCR at når stimulert, utløser en økning i intracellulært [Ca 2+] som er oppdaget av en genetisk kodet FRET baserte Ca 2+ sensor, TN-XXL. Således CNiFERs omforme nevrotransmitter-reseptorbinding til en endring i fluorescens, noe som gir en direkte og real-time optisk rEAD-out av lokale neurotransmitter aktivitet. Ved å benytte den native reseptoren for en gitt nevrotransmitter, CNiFERs beholde den kjemiske spesifisitet, affinitet og tidsmessige dynamikken i endogent uttrykte reseptorer. Til dags dato, har vi laget tre typer CNiFERs, en for detektering av acetylkolin ved hjelp av M1-reseptoren, en for å detektere dopamin ved hjelp av D2-reseptoren, og en for å detektere noradrenalin ved hjelp av α1a reseptoren 6,7. Den CNiFER teknologien er lett utvidbar og skalerbar, slik at det er mottakelig for alle typer GPCR. I denne Jove artikkelen beskriver vi og illustrere metodikken for å designe, realisere, og test in vivo CNiFERs for alle bruksområder.
Opprettelsen av CNiFERs gir en innovativ og unik strategi for optisk måling frigivelse av nevrotransmittere i hjernen in vivo. CNiFERs er ideell for måling extrasynaptic utgivelse, dvs. volum ledning, for nevrotransmittere. Viktigere, hver CNiFER besitter egenskapene til det native GPCR, noe som gir et fysiologisk optisk måling av endringer i nivåene av nevrotransmittere i hjernen. Hittil har CNiFERs blitt opprettet for å oppdage acetylkolin (M1-CNiFER) 6, dopamin (D2-CNiFER) 7</su…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker B. Conklin (University of California, San Francisco) for å gi G qi5 og G qs5 cDNA A. Schweitzer for å få hjelp med elektronikken, N. Taylor for å få hjelp med screening av kloner, Ian Glaaser og Robert Rifkin for korrektur og Olivier Griesbeck for TN-XXL. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler gjennom det amerikanske National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) og "Neuroscience relatert til narkotika av misbruk "trening stipend gjennom NIDA (DA007315).
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |