Мы представляем протокол для создания на основе клеток нейромедиатором флуоресцентных сконструированные репортеров (CNiFERs) для оптического детектирования объемного высвобождения нейромедиаторов.
Клеточная нейромедиатор флуоресцентных сконструированные репортеры (CNiFERs) обеспечивают новый инструмент для нейробиологов , чтобы оптически обнаружить высвобождение нейротрансмиттеров в головном мозге в естественных условиях. Конкретный CNiFER создается из человеческой эмбриональной клетки почки , которые стабильно экспрессирует специфический G-белком рецептор, который соединен с G Q / 11 г белков и лобзиком на основе Ca 2+ -detector, TN-XXL. Активация рецептора приводит к увеличению сигнала разъедать. CNiFERs имеют чувствительность нм и временную характеристику секунды , потому что клон CNiFER использует нативный рецептор для определенного нейротрансмиттера, например, D2R для дофамина. CNiFERs непосредственно имплантировали в мозг, что позволяет им чувствовать высвобождение нейромедиаторов с пространственным разрешением менее ста мкм, что делает их идеальными для измерения объема передачи в естественных условиях. CNiFERs также могут быть использованы для скрининга других препаратов для потенциального перекрестной реактивности в VIVO. Недавно мы расширили семейство CNiFERs включить GPCRs , что пара к G I / O G белков. CNiFERs доступны для обнаружения ацетилхолин (АХ), допамин (DA) и норэпинефрина (NE). Принимая во внимание, что любой GPCR может быть использован для создания романа CNiFER и что есть примерно 800 GPCRs в геноме человека, мы опишем здесь общую процедуру разработки, реализовать и протестировать любой тип CNiFER.
Для того, чтобы полностью понять , как нейроны общаются в головном мозге, необходимо иметь метод измерения высвобождение нейротрансмиттеров в естественных условиях. Есть несколько хорошо зарекомендовавшие себя методы измерения нейротрансмиттеров в естественных условиях. Одно из наиболее часто используемым методом является микродиализ, в котором полая игла вставлена в мозг и небольшой объем цереброспинальной жидкости собирают и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием и 1. Микродиализ имеет пространственное разрешение порядка нескольких диаметров зонда, например, ~ 0,5 мм для зондового диаметром 200 мкм. Временное разрешение этого метода, однако, является медленным из – за интервалами между измерениями , которые обычно длятся ~ 5 минут или дольше 1. Кроме того, анализы не производятся в режиме реального времени. Другой метод является быстрое сканирование циклической вольтамперометрии (FSCV), которая использует углеродного волокна зонд, который вставляют в мозг. FSCV имеет отличную темпоральная разрешение (субсекундных), высокая чувствительность (нмоль) и пространственное разрешение с зондами диаметром от 5 до 30 мкм. Тем не менее, FSCV ограничивается передатчиками , которые производят характерное окисление и профиль снижения питание подано на потенциометрического датчика углерода 2.
Третий способ для измерения нейротрансмиттеры непосредственно через генетически закодированы нейромедиаторов (NT) биосенсоров 3. С помощью этого метода, слитый белок создается , который содержит лиганд-связывающий домен для передатчика , соединенного с флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) основе пары флуорофоров 4 или перестановкой GFP 5. В отличие от предыдущих двух методов, эти биосенсоры генетически закодированы и экспрессируется на поверхности клетки-хозяина, такой как нейрон, через получения трансгенных животных или остро с использованием вирусных агентов, чтобы инфицировать клетки. На сегодняшний день генетически кодируемые биосенсоры были разработаны только для detectinг глутамата и ГАМК 3-5. Ограничения с помощью этих методик были низкая чувствительность, в диапазоне нМ, и невозможность расширить обнаружения для большого числа передатчиков, например, классических нейромедиаторов, нейропептидов и нейромодуляторов, которые передают сигналы посредством G-белками (GPCR , ). На самом деле, существует около 800 GPCRs в геноме человека.
Для устранения этих недостатков, мы разработали инновационный инструмент для оптического высвобождения мера любого нейротрансмиттера, который сигнализирует через GPCR. CNiFERs ( на основе клеток нейромедиатором флуоресцентных сконструированные репортеры) являются клоновых клетки НЕК293 , сконструированные для экспрессии конкретного GPCR , что при стимуляции, вызывает увеличение внутриклеточного [Са 2+] , который определяется генетически кодируемой FRET основе датчика Ca 2+, TN-XXL. Таким образом, преобразование CNiFERs нейромедиатора связывание рецептора в изменение флуоресценции, что обеспечивает оптическую р прямой и в режиме реального времениСвинец-из местной активности нейромедиаторов. Используя нативный рецептор для данного нейромедиатора, CNiFERs сохраняют химическую специфичность, сродство и временной динамики эндогенно выраженных рецепторов. На сегодняшний день мы создали три типа CNiFERs, один для обнаружения ацетилхолин с помощью рецептора M1, один для обнаружения допамина используя рецептор D2, и один для обнаружения норадреналина с использованием 6,7 – рецептора α1a. Технология CNiFER легко расширяемая и масштабируемая, что делает его доступным для любого типа GPCR. В этой статье Jove, мы опишем и проиллюстрировать методологию разработки, реализации и испытания в естественных условиях CNiFERs для любого применения.
Создание CNiFERs обеспечивает инновационный и уникальную стратегию для оптического измерения высвобождения нейромедиаторов в головном мозге в естественных условиях. CNiFERs идеально подходят для измерения внесинаптических высвобождения, т.е. объема проводимости, для нейротранс?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Б. Конклин (Калифорнийский университет, Сан – Франциско) за предоставление qi5 г и G qs5 А. кДНК Швейцера за помощь с электроникой, Н. Тэйлор за помощь скрининга клонов, Ян Glaaser и Роберт Рифкин для корректуры и Оливье Griesbeck для TN-XXL. Эта работа была поддержана исследовательских грантов через Национальный институт США по борьбе со злоупотреблением наркотическими средствами (NIDA) (DA029706; DA037170), Национального института биомедицинской визуализации и биоинженерии (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) и "Neuroscience связанных с наркотиками гранта Злоупотребление "тренировочной через NIDA (DA007315).
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |