En hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kultur System for Studerer svulstens mikromiljø og målrettet Drug terapier

Summary

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.  

Abstract

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Introduction

Nyere forskning har kreft gjort betydelige fremskritt i å identifisere genetiske mutasjoner, molekylære endringer og mulige behandlinger for en rekke av hjernesvulster. Til tross for denne utviklingen, hjernesvulster er fortsatt en av de beste årsakene til kreft relatert dødelighet for voksne og barn. Begrensende faktorer i hjernesvulst forskning omfatter begrenset tilgjengelighet av primære pasientprøver og cellelinjer og vanskeligheter med å replikere den unike og heterogene hjernen mikromiljøet i tilgjengelige eksperimentelle systemer. For mange hjernesvulster de vilkår som kreves for å opprettholde tumorceller over tid er ennå ikke kjent. Selv for hjernesvulster som kan dyrkes i cellesuspensjonen som neurosfærer, kan dyrkningsbetingelsene påvirke tumorcellene ^1,2. Faktisk, for tilsetning av basisk fibroblast vekstfaktor eller epidermal vekstfaktor stimulere proliferasjon og differensiering hemme kan endre genekspresjon ^1. Andre fremgangsmåter for tumorcellevekst sliktsom tumorutbredelse i mus via ortotopisk eller subkutan xenotransplantat av tumorceller er verdifulle analyser, men er begrenset av faktorer slik som tidspunktet for tumorutvikling (spesielt ved lave grad av tumorer), kostnad, og antallet tumorceller som kan injiseres og studert . Dermed dagens metoder for dyrking av menneskelige hjerne tumorceller er utilstrekkelig for å opprettholde visse krefttyper, og gir ofte kunstige miljøer som ikke tett etterligne in vivo tumor miljøer.

Forskjellige typer pediatriske hjernesvulster vokser i høyt spesialiserte steder i hjernen ^{[3, 4] og} dette gjenspeiler sannsynligvis distinkte microenvironmental krav til tumorvekst ^[5]. Denne protokollen beskriver et nytt system hvor cellene som er vanskelige å forplante seg i normale dyrkingsbetingelser kan dyrkes i et organotypiske hjerne mikromiljøet som etterligner in vivo-tumorvekstbetingelser. I denne kvantitative analysen, fluoresceinmerkethjernetumorceller blir platet ut på unge mus hjerne organotypiske skiver og overvåkes over tid. Denne analysen kan brukes til å undersøke effekten av mikromiljøet på tumorvekst, og for å teste nye medisinsk behandling i en klinisk relevant hjerne mikromiljøet.

Protocol

Etikk Uttalelse: Følgende prosedyre som involverer dyr fag ble gjort i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Dana-Farber Cancer Institutional Animal Care og bruk komité. Alle mennesker arbeidet ble gjennomgått av Institutional Review Board komiteer Brigham and Women Hospital og Dana-Farber Cancer Institute, og ved Stanford University for riktig bruk, som informerte samtykke er innhentet fra alle fag når det er nødvendig, og passende frafallelse av krav om samtykke ble oppnådd …

Representative Results

Denne delen eksemplifiserer den type resultater som kan forventes fra å utnytte hjernesvulst / organotypiske skive co-kultur for å undersøke regionale mikro preferanse samt å teste nye behandlingsformer. Vi viser at analysen er utformet for å gjenskape den mikromiljøet for hjernesvulster, som vevet organisering og proliferativ tilstand av skiven er opprettholdt (figur 3). Vi viser også at en økning i antall av tumorceller på skive over tid, kan delvis være forårsaket av migreringen av celler …

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan hjernetumorceller kan fluorescensmerkede og sådd ut på en sagittal hjernesnitt av en P6 mus og deretter overvåket i en uke i kultur. Dette hjernesvulst / organotypiske skive samkultur analysen kan anvendes for å bestemme effekten av regionale mikromiljøet på tumorcellenummer, og kan også brukes som et system for å måle effekten av nye medikamentbehandlinger på humane tumorvekst. Tidligere studier har brukt en lignende strategi for å vurdere rollen som hjernen mikro-miljø p…

Materials

HEPES	Invitrogen	17504044
Glucose	Invitrogen	17502048
Pennicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
HBSS	Life Technologies	14185-052
B-27	Life Technologies	17504-044
N2	Life Technologies	17502-048
Glutamax	Life Technologies	35050061
Neurobasal-A- Medium minus phenol red	Invitrogen	12349015
Low Melting Point Agarose	Promega	V2111
Slice Culture Inserts	Milipore	PICM0RG50
laminin	Invitrogen	23017015
Cm-DiI	Invitrogen	V22888
EDU (Labeling and Detection)	Life Technologies	c10337
Microspheres	Life Technologies	F-21010
Vibratome	Leica	N/A
Confocal Microscope	Nikon Eclipse Ni C2si	N/A
Image J software	N/A	N/A
5mm Cover Glasses	Fisher Scientific	64-0700 (CS-5R)