Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53340
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

Abstract

Bir doğru akım elektrik alanda (dcEF) kapsamında yönlü hücre göçü davranışı electrotaxis olarak adlandırılır. Embriyo gelişimi, hücre farklılaşması ve yara iyileşmesi sırasında hücre hareketi rehberlik fizyolojik dcEF önemli rolü birçok çalışmada gösterilmiştir. Bir electrotaxis tahlil mikroakışkan cips uygulayarak, soruşturma süreci kısalır ve deneysel hatalar en aza indirilir. Son yıllarda, mikroakışkan cihazlar polimerik maddeler (örneğin, polimetilmetakrilat, PMMA, veya akrilik) ya da polidimetilsiloksan (PDMS), yaygın olarak, elektrikli uyarılmaya verilen hücre yanıtları incelenmesinde kullanılmıştır yapılmıştır. Bununla birlikte, bir PDMS cihazı oluşturmak için gereken çok sayıda adımları farklı olarak, uidic çip fl akrilik mikro basit ve hızlı bir yapım aygıtı prototip ve üretim hem de uygundur. Oysa bildirilen cihazların hiçbiri aynı anda kimyasal ve DCE verimli çalışma kolaylaştırmakHücreler üzerindeki F etkileri. Bu raporda, bizim tasarım ve akciğer kanseri hücreleri üzerinde kimyasal ve elektriksel stimülasyon eşzamanlı etkisini araştırmak için akrilik bazlı çok kanallı çift elektrik alan (MDF) yonganın imalat açıklar. MDF yonga tek bir testle elektrik / kimyasal uyarılara sekiz kombinasyonları içerir. Çip ölçüde gerekli deneysel süresini kısaltır hem de electrotaxis çalışmalarda doğruluğu artırır.

Introduction

Bir doğru akım elektrik alanda (dcEF) altında anot ya da katot doğru hareket yapışan hücrelerin davranışı electrotaxis olarak adlandırılır. Hücrelerin electrotactic davranışı embriyojenez, sinir rejenerasyonu ve yara iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Bu tür sıçan prostat kanseri hücreleri, 2 göğüs kanseri hücrelerinin, 3 ve akciğer adenokarsinoma hücreleri 4-8 olarak 1 tümör hücreleri uygulanan dcEF altında electrotactic hareketi göstermiştir . Fizyolojik EF bezi dokularda ölçülmüştür. 9,10 Electrotaxis da bezi ile ilişkili tümör hücrelerinde bildirilmiştir. 2,3 kanser hücrelerinin electrotaxis metastaz faktörü olduğu kabul edilir, birlikte ele alındığında. 11 elektriksel yol kontrol dcEF altına kanser hücreleri kanser gelecekteki tedavisi için potansiyel bir yaklaşım olabilir. Ancak günümüzde electrotaxis ayrıntılı moleküler mekanizması hala tartışmalıdır. Bu nedenle, inf bir soruşturmakanser hücre göç elektrik stimülasyonu luence kanseri tedavisi için stratejiler geliştirilmesini kolaylaştırabilir.

Son zamanlarda, biyo-mikroakışkan cihazlar in vitro, 12 kimyasal geçişlerini, 13 ve elektrik uyaranlar 4 kesme kuvveti akış hücresel yanıtları eğitim için imal edilmiştir. (Aynı zamanda akrilik olarak da bilinen PMMA) polidimetilsiloksan (PDMS) veya polimetilmetakrilat kullanarak biyo-mikroakışkan cihazların imalatı başarıyla tür deneylerin başarısızlık oranı azalmıştır. Ayrıca, biyolojik konuları araştırmak için bir prototip olarak akrilik esaslı mikroakışkan cihazlar kullanarak PDMS yongaları kullanarak daha basittir. Akrilik bazlı cihazların çeşitli fonksiyonları electrotaxis çalışma için geliştirilmiştir. Ancak, önceki tasarımlara hiçbiri aynı anda electrotaxis çalışma için hücreler üzerinde çeşitli kimyasal koşulların etkilerini ve elektrik-alan test edebiliyoruz. Böylece, bir mikroakışkan cihaz mu geliştirdiltichannel çift elektrik alan (MDF) çip içeren dört bağımsız kültür kanalı ve bir çip sekiz farklı deneysel koşullar.

İlk Hou tarafından bildirilen akrilik esaslı MDF yonga, vd., 8 elektrik stimülasyonu ve çeşitli kimyasal izole kanalları bütünleştirir. Bu kimyasal olarak izole kanal, bir deney kültür hücreleri farklı kullanılabilir. Kanallarda dcEF bir elektrik güç kaynağı tarafından üretilir. İki bağımsız elektrik alanlar, uygulanan elektrik alan kuvveti (EFS) ve 0 EFS ile diğeriyle, her kimyasal izole kanalda yapılmaktadır. Bu şekilde çip daha kontrollü eşlik eden EF ve kimyasal uyarım içerir. Ayrıca, MDF çip içerisindeki kimyasal difüzyon sayısal simülasyon sonuçları çapraz kontaminasyon 24 saat deney süre sonra kanallar arasında meydana geldiğini göstermektedir. 8

Devi ile karşılaştırıldığındaLi tarafından rapor ce ve diğ., 14 MDF çip elektriksel olarak uyarılmış hücrelerin daha da biyokimyasal analiz için izin veren daha geniş bir kültür alanı içerir. Buna ek olarak, MDF çip büyük gözlem alanı ile daha fazla hücre test gözlemlenebilir, yani elektrikle uyarılan hücrelerin göç hızı ve yönetme analizi daha doğrudur. Huang ve ark., 4 ve Tsai ve ark., 15 tarafından bildirilen daha önceki çalışmalar, tek kanal çip tasarımı hücre ya da kimyasal yalnızca tek bir tip test edilmesini sağlar. Bununla birlikte, MDF çip electrotaxis çeşitli kimyasal etkilere, ve aynı zamanda farklı hücre tipleri üzerinde elektriksel uyarım etkilerini araştırmak için kullanılabilir. Diğer bir deyişle, MDF çip kimyasal doz bağımlılıkları etkin çalışma sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tasarım ve MDF Chip Fabrikasyon

  1. AutoCAD gibi ticari yazılımlar kullanarak bireysel akrilik tabaka model çizin ve desen kaydedin.
    1. Şekil 1A dört katmanlı akrilik levha desen tasarımı gözden ve inter-katmanlı bağlantıları onaylayın.
  2. Tüm akrilik levha ve CO2 lazer Çizici (Şekil 1B, 2A ve 2B) kullanılarak lazer ablasyon ile çift taraflı bant Üretiyor. 16
    1. Lazer Scriber açın ve kontrol dizüstü cihaza bağlayın.
    2. Ticari yazılımı çalıştırın ve tıklatarak adım 1.1 tasarlanan deseni açık "olarak tasarlanmış desen dosyasını."
    3. Lazer Scriber XYZ sahnede boş akrilik levha ya da çift taraflı bant bir parça yerleştirin.
    4. Bir otomatik Alignmen akrilik levha veya çift taraflı bant yüzeyinde lazer ışınının odak ayarlamaLazer Scriber üreticisi tarafından sağlanan t sopa.
    5. Akrilik levha ya da çift taraflı bant doğrudan işleme için lazer Scriber için tasarlanmış desen gönderin.
  3. Forseps kullanarak akrilik levhalardan koruyucu kağıdı çıkarın ve azot gazı ile yüzeyi temiz darbe.
  4. Akrilik levha Yığın ve 110 ° 45 dakika boyunca ısı ile birleştirme düzeninde 2 kg / cm2 bir basınç altında bir araya bağlamak Akış / elektriksel stimülasyon kanalı düzeneğinin oluşturulması için ° C.
  5. Çip hücre kültürü substrat olarak mikroskop kapak cam hazırlayın.
    1. Bir boyama kavanoza cam kapak koyun ve maddi listesinde deterjan on kat seyreltme ile kavanoza doldurun.
    2. Ultrasonik steri-temizleyici cam kapak ve boyama kavanoza koyun ve 15 dakika boyunca kapak camını temizleyin.
    3. , Boyama kavanoz seyreltilmiş deterjan dökün distile su ile kavanoz dolum ve adımı 1.5 tekrarlayın.2 3 kere.
    4. Çift taraflı bant onu kalarak önce azot gazı ile üfleme temizlenebilir cam kapak kurulayın.
  6. Adım 1.2 desenli çift taraflı bant ile akış / elektrik stimülasyonu kanal montaj temizlenmiş cam kapak yapıştırın.
  7. Süper yapıştırıcı ile MDF yonga düzeneğinin Layer 1 bireysel açıklıklar akrilik adaptörleri 13 adet uyun. MDF yonga düzeneği daha sonra tam (Şekil 2B) 'dir.
  8. Kullanmadan önce, UV ışınlama 30 dakika ile komple MDF yonga takımını sterilize edin.

MDF Chip Tuz Köprüsü Ağı 2. Kurulum

  1. Kullanmak 121 ° C'de 15 dakika bir tutma süresini ayarlayarak Şekil 3B'de gösterilen tüm plastik tüpler, parmak sıkı fındık ve mikrosantrifüj tüpleri sterilize önce Otoklavda ° C.
  2. Orta girişi aracılığıyla MDF yonga tertibatına floroplastik tüpleri (Şekil 3B-i) bağlayınve çıkış adaptörleri Şekil 1A gösterilmiştir.
  3. Şekil plastik borular, orta girişinin Luer konik bağlayın ve çıkış 3B-i 3-yollu stopcocks için.
  4. 3 ml şırınga kullanılarak CO2 -equilibrated fosfat tamponlu salin (PBS) 2.5 ml alın ve giriş plastik tüp 3-yollu şırınga bağlayın. Çıkış plastik tüp 3-yollu boş bir 3 ml şırınga bağlayın. İki şırınga böylece MDF çip sayesinde birbirine bağlanır.
    NOT: 37 PBS inkübe 5 ° C,% 2, -CO hücre kültürü inkübatörü O / N CO2 PBS -equilibrated elde edildi.
  5. Beyaz katı parmak sıkı fındık ile Katman 1 PMMA kağıda mavi açıklıklar ve yeşil adaptörleri (Şekil 1A) Seal (Şekil 3B-iii).
  6. CO 2 ile tuz köprüsü kanalları ve kültür odaları doldurun kurulum aşama 2.4 tarif şırınga içinde PBS -equilibrated. Önlemekkabarcıkların oluşması.
  7. Daha sonra, CO 2 koyun O / N inkübasyon için 37 ° C,% 5, -CO 2 hücre kültürü inkübatöründe MDF çip PBS içerikli -equilibrated. Bu çift taraflı bant içinde çözülmüş hava odaları kabarcıkları oluşturmak için olanak sağlar.
  8. İki şırınga kullanarak kanal hızlı PBS akışı ile kanallarda kabarcıkları uzak yıkayın. Ileri ve geri gerekirse PBS Pompa.
  9. Orta çıkış borusuna bağlanan 3-yollu yoluyla kanallarda PBS boşaltın.
  10. CO2 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) -equilibrated yeni bir 3 ml'lik şırınga kullanarak, 2.5 mi alır (adım 3.5) ve yenisiyle girişine bağlanmış bir şırınga değiştirin. Orta kanalları doldurun.
  11. Tuz köprüsü, ağın hazırlanması.
    1. Geçici olarak katı somunları (Şekil 3B-iii) yeşil adaptörleri üzerinde (Şekil 1A) kaldırmak ve (> 70 ° C) agaroz içine tuz bri sıcak% 3 enjekteYeşil adaptörleri (Şekil 1A) açıklıktan dge kanalı.
      Not: Sıcak agaroz hazırlanması: 50 ml PBS agaroz bir toz, 1.5 g çözündürülür. Otoklavda 121 ° C'de 20 dakikalık bir tutma süresi ayarı ile sterilize edin.
    2. Sıvı tuz köprüsü kanalın uzunluğu dörtte üçü dolduğunda agaroz enjekte durdurun.
    3. Agaroz enjeksiyondan sonra katı somunları (Şekil 3B-iii) vidalanarak yeşil adaptörleri (Şekil 1A) üzerine gözenekleri kapatın.
    4. Saydam tüp şeklindeki parmak sıkı fındık (Şekil 3B) mavi adaptörleri (Şekil 1A) katı somunları değiştirin.
    5. % 3 boru şeklindeki fındık (Şekil 3B-iv) içine agaroz önceden ısıtılmış yükleyin.
    6. Önce tüp şeklindeki fındık içine Ag / AgCl elektrotlar (Şekil 3B-v) (Şekil 3B-iv) gömAgaroz katılaşma.
  12. Tuz köprüsü ağının kurulumunu tamamladıktan sonra, bir seferde, kültür odalarına tek bölmeyi CL1-5 akciğer kanser hücrelerini enjekte edilir.

3. Kanser Hücrelerinin Hazırlanması ve Electrotactic Denemeye Kurma

  1. Akciğer kanseri hücre çizgisi CL1-5 düzenli kültürü.
    1. 37 ° C'de, bir 75T hücre kültürü şişesi içinde tam ortam Prof. Pan-Chyr Yang, 17'den elde edilen bir kültür CL1-5 akciğer kanseri hücreleri, % 5 CO2 atmosferinde ° C. Komple ortam DMEM ve% 10 cenin sığır serumu (FBS) oluşmaktadır. Alt-kültür hücreleri, 3 ila 4 gün. Electrotaxis deneyler için kullanılan hücrelerin özgün kaynağından en az 25 pasajlar vardır.
  2. Katlanarak büyüyen CL1-5 hücrelere% 0.25 tripsin tampon maddesi 2 ml ilave edilir ve 37 dakika inkübe 2 Hücre dekolmanı için 5 ° C,% 2, -CO hücre kültür inkübatörüt.
  3. % 10 FBS DMEM 6 ml ayrılması işlemi durdurun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g hücreleri santrifüj. Ardından orta atmak ve 5 ml PBS ile hücre pelet askıya.
  4. PBS hücrelerin sayısını. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g 1 x 10 6 hücreleri ve santrifüj alır.
  5. PBS atın. Önceden ısıtılmış CO2 -equilibrated DMEM ile süspanse ve 1 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlanır.
    NOT: 37 tam orta inkübe ° C CO 2 elde etmek için CO 2 hücre kültürü inkübatör O / N DMEM -equilibrated% 5.

4. Electrotactic Denemeye Kurma

  1. MDF yonga çıkışından, yonga içine hücreleri 1 × 10 6 / ml 0.3 ml, enjekte.
  2. Hücre kültürü inkübatör hücre numaralı seribaşı MDF yonga inkübe (37 ° ayarlanabilir 2-4 saat boyunca ° C'de ve% 5 CO2).
  3. MDF mikro Kurakışkan sistemi.
    1. Şeffaf indiyum kalay oksit cam (İTO) ısıtıcının üzerine MDF mikroakışkan sistemi takın. MDF yonga ve İTO cam arasındaki kırpılmış bir K-tipi termokupl ile MDF çip sıcaklığını ölçün. Bir oransal-integral-türev (PID) kontrolör ile İTO ısıtıcı kontrol edin. 37 MDF mikroakışkan sistem inkübasyon sıcaklığı ayarlayın PID kontrolörü ile ° C.
      NOT: İTO ısıtıcı imalat ve hücre kültürü ısıtma sisteminin kurulumu önceki raporlarda açıklanmıştır 18,19.
    2. Ters bir mikroskop bilgisayar kontrollü XYZ motorlu sahnede sıcaklık kontrollü MDF yonga takımını takın. Motorize kademe kullanılması adımında 5,1 tarif edilmektedir. Dört kanallı şırınga pompası ile girişler yoluyla kültür odalarına tam orta Pompa.
  4. 20 ul / saat akış hızında MDF yonga içine tam orta pompa. Out kültür atık(Şekil 3A'da "atık" olarak gösterilen) mikrosantrifüj tüpleri içinde toplanır sağlar.
  5. MDF çip, 37 ° C'de 16-18 saat boyunca inkübe hücreleri.
  6. Orta değiştirmek için, 10 dakika boyunca 20 ul / dakikalık bir akış hızında her bir kültür odasına, sırasıyla 50, 25, 5 ve 0 uM kinaz inhibitörü ihtiva eden bir ortam, pompa.
    Not: 10.6 mg kinaz inhibitörü steril su 3 ml ekleyerek Rho-ilişkili protein kinaz inhibitörü Y27632 bir 10 mM stok çözelti hazırlayın. % 10 FBS DMEM ortamı kullanılarak sırasıyla, 50, 25, 5 uM ila 10 mM stok solüsyonu ile seyreltilir.
  7. 37 ° C'de başka bir 60 dakika boyunca kinaz inhibitörü hücreleri inkübe edin. / Saat 20 ul orta akış hızını ayarlayın. Aynı kültür sıcaklığı kullanımı ve sonraki adımlarda, yukarıda tarif edilen akış oranı.
  8. Çip üzerinde Ag / AgCl elektrotlar aracılığıyla MDF çip bir DC güç kaynağı bağlamak için elektrik telleri kullanın.
  9. Seri bir ampermetre i bağlamakn elektrik devresi. MDF çip elektrik akımını izlemek için ampermetre kullanın.
  10. DC güç kaynağı açın ve V. 15 ila 19 güç kaynağı voltajını ayarlayarak 86,94 uA geçerli ampermetre ayarlamak
    Not: Ohm kanunu göz önüne alındığında bir toplu malzeme içinden akan elektrik akımı, örneğin, electrotactic odasında kültür ortamıdır, E = G / (σA eff), σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) 'dir Kültür ortamı, (0.07 mm yüksekliğinde x 3 mm genişlik için = 0,21 mm2) bir eff iletkenliği electrotactic bölmenin etkili kesit alanı ve 300 mV / mm oluşturmak için gerekli olan elektrik akımı (I) MDF çip EF 86,94 uA.

5. Toplama ve Hücre Görüntüleri Analizi

  1. MATLAB GUI programını kullanarak motorlu aşamasını kontrol. Mikroskobik monte MDF mikroakışkan sistemiylepe, motorlu sahne kullanarak gözlem bölgelerine çipi taşıyın.
  2. Dijital Tek lensli refleks (SLR) kamerayı kullanarak Tutanak hücre görüntüleri mikroskop üzerine monte edilmiş.
  3. 2 saat boyunca 15 dakika aralıklarla 4X objektif lens kullanarak mikroskopik resimleri al.
  4. Hücre migrasyon analizi.
    1. NIH ImageJ 1.47 V çalıştırın
    2. Hücrenin sentroid final pozisyonlarına ilk mesafeyi analiz edin.
    3. "Görüntü Sırası" "Dosya" → "Import" → gidin ve hücre göçü analizi için dokuz görüntüleri içe. İlk görüntü sıfır defa sonucudur, ve son görüntü 120 dakika sonucudur.
    4. → "Ölçümleri ayarla" "Analiz" gidin ve yanındaki kutunun "Centroid" onay
    5. "Serbest Seçimler" ikonuna tıklayın.
    6. İlk görüntüde seçili hücrelerin kenarına betimliyor.
    7. "Düzenle" ye gidin → "Seçim" → "Müdür Ekle"
    8. Dokuzuncu görüntüye gidin ve ilk görüntüde seçilen aynı hücrelerin kenarına betimliyor. Hücre pozisyonları sekizinci görüntülere ikinci kullanılarak izlenebilmektedir.
    9. → "Müdür Ekle" "Düzenle" → "Seçim" Git
    10. Tekrarlayın 90 ila 100 hücrelerden veri toplamak için 5.4.5 5.4.9 için yineleyin.
    11. Seçilen hücrelerin ilk ve son pozisyonlar sonucunu elde etmek için → "Tedbir" "Analiz" gidin.
      NOT: Geçiş hızı hr başına ortalama hücre hareketi uzunluğu olarak tanımlanır. Yönetme (anottan katoda) dcEF vektörü ve nihai konumunda bir hücrenin başlangıç ​​noktasından vektörü arasındaki açıdır kosinüsü olarak tanımlanır. Yönetme katoda doğru göç hücreler için anot doğru göç hücreler için -1 ve +1 olduğunu. Rastgele mi bir grup içinhücreler ızgara, yönetme 0. 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MDF cihazın imalat ve montaj

Akrilik bazlı MDF çip şematik bir diyagramı Şekil 1A 'de gösterilmiştir. Dört akrilik levhalar, tek cam kapak, 13 akrilik adaptörleri ve çift taraflı bant bir parça tamamlandı MDF yonga (Şekil 2D) montajında ​​kullanılmıştır. MDF cihazda sadece dört bağımsız kültür kanalı vardır. Ancak, on-chip tuz köprüsü ağ yongası sekiz segmentlerinde sekiz farklı deneysel koşullar yaratır. Üç tuz köprüleri, 79, 90 (Şekil 1A Katman 2 mavi kanal) ve uzunluğu 80 mm, görüntü gözlem karışmadan MDF çip ikinci tabakaya birleştirilmiştir. Bir 0 olan tuz köprüsü ağı ve kültür odaları arasındaki küçük gözenekler (mavi kübik Katmanlar 3 kanalları ve Şekil 1A 4),0,25 mm 2 kesit alanı, deney sırasında tuz köprüsü içine sıvı akışı minimize. MDF yongasının kültür alanı yaklaşık 74 mm 2 Her segmentte olduğunu. Bu gösteri, MDF cihazın hücre kültürü odaları 70 mikron kalınlığında çift taraflı bant ve cam kapak oluşmaktadır. Ancak, (örneğin, bir kollajen kaplama gereksinimi, düşük akım kesme veya kültür odasında büyük kültür ortamı hacmi) electrotaxis araştırma için gerekli olan farklı hücre kültür koşulları, kültür substratları ve bantlar hem kolayca değiştirilebilir olabilir eğer. Bu nedenle, hücrelerin çeşitli MDF çip içinde electrotaxis çalışma için kullanılabilir.

MDF mikroakışkan sistemi konfigürasyonu

MDF mikroakışkan sistem kurulum Şekil 3A gösterilmiştir. Şekil 3B'de gösterilen bileşenler u olanorta akış ve MDF mikroakışkan sistemde elektrik akımı ağı kurmak için sed. Şekil içi boş parmak sıkı (kırmızı ve yeşil) fındık ve Luer tapers (kahverengi) ile bağlantılı borular 3B-i MDF akış ağına orta taşımak için kullanılır. Şırıngalar Luer daralan bağlı olan ve dört kanallı pompa üzerine yerleşmiş edildikten sonra, boru hattı akış sistemi tamamlandı. Kültür ortamı ve atık boru hattı sistemi ile taşınmaktadır. Tüpler ve akrilik adaptörleri arasındaki bağlantı vidalı konektörler tarafından tespit edilir, çünkü, MDF, orta ağı PDMS sistemi can daha yüksek hidrolik basıncı tolere edebilir. Nedeniyle akrilik levha ve tüplerin aşırı düşük hava geçirgenliği, orta ağı ve dış ortam arasında herhangi bir temas engellendi. Bu nedenle, sistemin ortamın pH değeri, sabit kalır, ve hücreler, bir CO2 inkübatör dışında MDF mikroakışkan sistemi kullanılarak kültür edilebilir. MDF ch yanaip motorlu sahnede yüklü, time-lapse hücre görüntüleri sekiz ayrı bölümden alınabilir. Açık tabanlı bir mikrosantrifüj tüpleri (Şekil 3B-ii) Agaroz hacim kapasitesini arttırmak üzere saydam boru şekilli parmak geçirmez fındık (Şekil 3B-iv) monte edilmiştir. Bu şekilde, nispeten büyük elektrotlar daha uzun süreler için hücrelerin stabil elektriksel uyarımı sağlamak için agaroz içine sokulabilir.

MDF çip belirtilen akım elektrik alanın Üretimi

Her bölmenin voltajlı elektrik devresi bağlı chip edilen elektrodlar vasıtası ile ölçülebilir. Ancak, biz odasında gerilimi ölçmek vermedi. Aksine, biz tuz köprüsü ağı ve çip hücre kültürü odalarına elektrik alan simüle. Dört electrotactic odaları con seri vardıElektrik devrelerinde bağlanmalıdır. Bu şekilde, aynı elektrik akımı, bu bölmelerin her biri muhafaza edilmektedir. Ohm kanunu göre, EFS mikroakışkan cihaz odaları enine kesitinin alanı ile ilişkilidir. Ayrıca, tüm PMMA levhalar ve şeritler CO2 lazer Scriber tarafından imal edilmiştir. Çip montaj parçaları uyum hassas ve yonga yapısal kusurlar düşüktür. Böylece, her bir bölme EFS stabil kalmalıdır. Elektrik alan simülasyon sonuçları ilk yarısı 300 ve 0 mV / mm ile EFS homojen bir dağılım ve cihaz kültür odaları kalan yarısını göstermektedir (veriler gösterilmemiştir). Önceden, bizim laboratuvarda, Huang ve ark bildiriyor. ve Tsai ve diğ.,. ölçüm ve simulasyon EFS değerlerindeki fark% 4'den daha az olduğu gösterilmiştir 4,15 Bu sonuç sistem içinde ölçülen elektrik alan simüle değeri ile de karşılık gelen, göstermektedir. Bu Work, biz uzun bir deney için kararlı elektrik akımını sağlamak için büyük Ag / AgCl elektrotlar takılmış. MDF çip üzerinde uygulanan akım electrotaxis deneylerinde EF stimülasyon sadece 1,85 ± 0,19 sonra% 7 saat azalmıştır. Ayrıca, elektrik uyarımı en uzun süre bizim çalışmamızda 4 saat oldu. Böylece, giriş elektrik akımı electrotaxis test sırasında sabit kalır inanıyorum ve MDF yonga electrotactic odalarına elektrik alan seri bağlanmış ampermetre tarafından izlenir.

MDF mikroakışkan sistemi kullanılarak, akciğer kanser hücrelerinin electrotaxis İncelenmesi

Rho-bağlantılı sarmal bobin kinaz (rock) electrotactic düzenlenmesi Çin hamsteri yumurtalık (CHO), 20, endotel, 21 ve nöronal hücreler 22 da gösterilmiştir ancak, akciğer kanseri c araştırılmamıştırarşın. Bu nedenle, ROCK inhibitörü, Y27632, akciğer kanseri hücreleri electrotaxis üzerindeki etkisini incelemek için MDF mikroakışkan sistemine uygulandı. Şekil 4'te gösterildiği gibi, Y27632 tedavisi ile birlikte ya da elektrik uyarımı olmaksızın hücre göçü hızını değiştirerek herhangi bir etki göstermemiştir. Bununla birlikte, dcEF altında kanser hücrelerine Y27632 uygulanması (300 mV / mm) önemli ölçüde anodik göç azaltmıştır. 50-iM konsantrasyonunda, ROCK inhibitörü akciğer kanseri hücrelerinin anodik hareketini ortadan ama onların göç hızını etkilemedi. Ayrıca, uygulanan kimyasal konsantrasyonları ve yönetme indeksi (Şekil 4B) arasında doza bağımlı bir ilişki vardır. Bu sonuçlar MDF mikroakışkan sistem electrotaxis eğitim için güvenilir ve etkili olduğunu düşündürmektedir.

figür 1
Şekil 1. DesMDF çip IGN. (A) MDF çip şematik çizimi. MDF cihaz akrilik levhaların dört kat (72 × 50 mm), 13 akrilik adaptörleri (10 × 10 × 6 mm), çift taraflı bant ve cam kapak (24 × 60 mm) oluşur. Tabaka 2 akrilik levha kalınlığı 2 mm olan ve diğer üç tabaka, her biri 1 mm. Alt üç akrilik katmanlarında, tuz köprüsü ve orta akım ağları sırasıyla mavi ve kırmızı bloklar tarafından temsil edilmektedir. İlk akrilik levha tabakası içinde, yeşil akrilik adaptörleri agaroz enjeksiyon için kullanıldı. Mavi akrilik adaptörler Ag / AgCİ elektrotlara bir bağlantı olarak kullanılmıştır. MDF çip dört hücre kültür odaları vardır. Alan ve her bir hücre kültür odası yüksekliği sırasıyla 148 mm 2 (3 x 46 mm), 0,07 mm'dir. Katmanlar 3 ve 4 küçük mavi kanallar kültür odalarına tuz köprüsü ağa bağlanmak. Bu bağlantı kanalı kesiti 0,25 mm'dir ve ark., 8 telif 2014, American Institute of Physics). MDF cihazı düzeneğinin tüm bileşenlerinin (B) Fotoğraf, PMMA levha, akrilik adaptörleri, çift taraflı bant ve cam kapak içermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. MDF yonga imalat ve montaj işlemleri. (A) akrilik levha ve çift taraflı bant desenleri CO2 lazer işleme ile tarif edilmiştir. (B) Bireysel akrilik levha katmanları tasarım çizim göre CO2 lazer tarafından imal edilmiştir. (C) temizlenmiş akrilik levhas birlikte, termal birleştirme düzeninin kullanılarak bağlandı. (D) Tamamlanan MDF yonga montaj. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil electrotaxis çalışma için 3. Sistem. Electrotaxis deney için sistem (A) şematik diyagramı. MDF çipe bağlanmış tüpler orta infüzyon ve atık akışı için kullanılmıştır. Çip dcEF Ag / AgCl elektrotlar ve güç kaynağı ile gerçekleştirilmiştir. Aygıt kurulum mikroskop XYZ motorlu sahnede kuruldu. Çip Hücre görüntüleri ticari bir dijital SLR fotoğraf makinesi ile çekildi. (B) MDF mikroakışkan sistemde ortam akış ağ bileşenleri ve dcEF nesil Fotoğraf including (i) tüp konektörü, (ii) açık dipli mikrosantrifüj tüpleri, (iii) beyaz bir katı parmak sıkı somun, (iv) saydam tübüler parmak sıkı somun ve (v) Ag / AgCl elektrotlar. için tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümünü görüntüleyin.

Şekil 4,
Şekil (A) 'nın altında EFS akciğer kanseri hücre göçü ile ilgili Y27632 4. etkisi sıfır (B) 300 mV / mm. DcEF stimülasyonu Y27632 konsantrasyonu ile 1 saatlik ön-işlem sonrası uygulanmıştır. Elektrik stimülasyonu 2 saat süre ile devam etti. Yönetme ve hücre göçü hızı kantitatif analiz temsili bir deney consititute. 90-100 hücre veri analizi kullanılmıştır. * <0.001 P. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştirOrtalama (SEM). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz zor olması MDF yonga Layer 1 üzerine akrilik adaptörleri kalarak sürecini bulundu. Süper yapıştırıcı sadece 1 ila 2 ul uygulama sıkıca MDF çip üzerine adaptörü uyması yeterlidir. Tutkal Büyük miktarlarda süper yapıştırıcı ve bağlı başarısızlık tamamlanmamış bir polimerleşmesinde sonuçlandı. Akrilik adaptörleri sıkıca MDF çip üzerine yapıştırılır Bir kez, mikroakışkan sistemde sıvı kaçağı nadiren meydana geldi. Buna ek olarak, vakum odasının içine O / N inkübasyon çift taraflı bant / cam kapak veya çift taraflı bant / akrilik levha arayüzü arasında sıkışan havayı kaldırmak için yardımcı oldu. Sonuç olarak, bu süreç MDF yonga kültür odasının kararlılığını artırır.

Tuz köprüsü ağının hazırlanması sırasında% 3 agaroz Sıcaklık kontrolü çok önemlidir. Agaroz sıcaklığı enjeksiyonu sırasında yeterince yüksek değilse, agaroz hızla şırınga içinde katılaşmaya ve yapamam olacaktuz köprüsü ağı içine enjekte edilebilir. Ayrıca, agaroz enjeksiyon sırasında, bu tuz köprüsü ağındaki herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için önemlidir. Kabarcıkların görünümü büyük ölçüde ağının elektrik geçiş direncini artırır ve deneysel neden olmaktadır. Agaroz enjeksiyon sırasında katılaşır kez ek olarak, tamamen tuz köprüsü kanalında sıvı akışını bloke edemez. Bunun gibi, kimyasallar daha sonra kolayca diğer kanallar içine sızabilir. En iyi yaklaşım ağına sıcak agaroz enjekte ve daha sonra agaroz tuz köprüsü kanalları içinde katılaşmaya izin vermektir.

Hücre enjeksiyon electrotaxis deneyde önemli bir işlemdir. Kültür odası içinde, hücre ekimi için bir hücre yeterli sayıda olduğundan emin olmak için, hücrelerin aşırı sayıda enjekte edilir. Bu yaklaşımda, hücre çıkışından enjekte edilmiştir. Enjeksiyon hızı kültür odası içinde düzgün olmayan bir hücre dağılımı önlemek için daha yavaş ve olmalıdır. İlave olarak, buMDF çip izole kanallar, enjeksiyon bir anda en az bir kanal yapılmalıdır. Bu nedenle, tam hücre enjeksiyon işlemi zaman alıcıdır. Gelecekte, ek bir hücre enjeksiyonu kanalını oluşturmak için gerekli olacak geleni dört kültür odalarına anda implant hücreleri. Bu yeni işlem örnek hacmi, enjeksiyon için gerekli hücrelerin sayısını ve işlem süresini azaltır.

Mikroakışkan cihaz imalatı için malzeme olarak PDMS yerine akrilik kullanarak çeşitli avantajları vardır. Akrilik tabanlı aygıt bir kuluçka olmadan ısıtıcı üzerinde doğrudan çalıştırılabilir. Sistem herhangi bir CO 2 kaynağı gerektirdiğinden, hücreler ısıtıcı ile düzenli inverted mikroskop üzerinde akrilik esaslı biyo-mikroakışkan çip yetiştirilebilir. Bu bir kuluçka dışında çip hücre görüntüleri kaydetmek için kolaydır. Biz sisteminde hücre görüntüleri kaydetmek için yaygın olarak kullanılabilir ticari dijital SLR fotoğraf makinesini kullandı. Ayrıca, yumuşakKameranın programlanabilir kontrol için gerekli ware da kolayca kullanılabilir. Bu hücrelerin time-lapse görüntüleme kolaylıkla programlanabilir hale getirir. Bu nedenle, biyo-mikroakışkan otomatik kayıt görüntü sistemi bina maliyeti ticari sistemin çok daha düşüktür. PDMS tabanlı çipini kullanan Buna karşın, sistem, bir CO2 kuluçka makinesi içinde çalıştırılabilir. Böylece, ekstra görüntü kayıt cihazları inkübatör operasyon için satın alınmalıdır. Bu tür ekipmanlar nispeten hacimli, pahalı ve hücre kültürü inkübatöründe sınırlı alanlarda önemli bir kısmını kaplar. Bir başka yönden, PDMS çip imalat işlemi ile karşılaştırıldığında, uidic çip fl akrilik mikro kolay ve hızlı bir imalat cihazı prototip ve üretim için uygundur. Olarak Ayrıca, PDMS tabanlı bir aygıt ile karşılaştırıldığında, akrilik esaslı mikroakışkan çip, yapısal olarak daha stabil ve karmaşık bir üç boyutlu mikro-akışkan ağ sistemi oluşturmak için daha uygundurBu çalışmada MDF çip ile seslendirdi. MDF çip on-chip tuz köprüsü ağı kolayca PDMS tabanlı bir aygıt üretilen edilemez. Bu ağ sistemi mikroakışkan çip toplam boyutunu en aza indirir ve electrotaxis araştırma daha kolay ve hızlı hale getirir.

MDF çip içinde, her izole kanalda sadece iki elektrik alan güçlü (EFS, 0 ile 300 mV / mm) oluşturulur. Bununla birlikte, Huang tarafından rapor edilen MDF çipi ve çoklu alan electrotactic çip, et al., 4 pay hücre kültürü bölgede benzer kanal tasarımı. MDF çip kültür odasının şekil değiştirerek, çoklu EFSs da MDF çip üzerinde oluşturulabilir. Bu modifikasyonların ile, birden fazla EFSs ve birden fazla kimyasal aynı testte kullanılabilir. Bu duruma göre, bir yüksek veri akışı tarama sistemi cihazı kullanılarak electrotaxis araştırmak için oluşturulabilir.

Sadece bir deneyde, MDF çip etkilerini test edebilenFarklı dcEF altındaki hücrelerde kimyasal ya da farklı hücre tipleri üzerinde elektriksel uyarım etkileri. Hatta önemli ölçüde cihazın boyutunu arttırmadan MDF çipinde 20 izole paralel kanal uygulamak mümkün olabilir. 8 bir deneyde, bu çalışmada gösterildiği gibi, hücre göçü yönetme arasında bir doza bağlı olarak belirgin bir korelasyon elde Y27632 (Şekil 4). Dört kanallı MDF yonga açıkça kanser hücrelerinin electrotaxis eğitim için etkili bir yaklaşım sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM medium Gibco,Invitrogen, USA 12800-017
Fetal Bovine Serum Gibco,Invitrogen, USA 16000-044
Trypsin Gibco,Invitrogen, USA 25200-072
PBS Basic Life BL2651
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical Co 10005583
agarose LONZO, USA SeaKem LE AGAROSE
syringe Terumo 3 ml with Luer taper
3-way stopcock Nipro with Luer taper
PMMA (acrylic) HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan thickness 1mm, 2mm
acrylic adaptor KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan 1/4-28 port, 10x10x6 mm customized
nut Thermo Fisher Scientific Inc. UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Microscope cover glass Deckgläser, Germany 24x60 mm
double-sided tape 3M PET 8018
super glue 3M Scotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 detergent Franklab, France TFD4
ultrasonic steri cleaner LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonder KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan customized
CO2 laser scriber LTT group, Taiwan ISL-II
proportional-integral-derivative (PID) controller JETEC Electronics Co., Japen TTM-J40-R-AB,
K-type thermocouple TECPEL TPK-02A
4-channel syringe pump KdScientific, USA 250P
DC power supply GWInstek, Taiwan
X-Y-Z motor stage TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan customized
inverted microscope Olympus, Japan CKX41
digital SLR camera Canon, Japan 60D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  2. Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
  3. Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
  4. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  5. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
  6. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
  7. Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
  8. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
  9. Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
  10. Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
  11. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
  12. Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
  13. Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
  14. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  15. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
  16. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
  17. Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
  19. Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
  20. Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
  21. Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
  22. Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).

Tags

Biyomühendislik Sayı 106 Akrilik mikroakışkan electrotaxis akciğer adenokarsinom eşzamanlı kimyasal / elektriksel etki polimetilmetakrilat PMMA
Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J.… More

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (106), e53340, doi:10.3791/53340 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter