Abstract
Il comportamento di migrazione delle cellule direzionale in una corrente di campo elettrico diretto (dcEF) è indicato come electrotaxis. Il ruolo significativo fisiologico dcEF nel guidare il movimento delle cellule durante lo sviluppo embrionale, la differenziazione cellulare e la guarigione della ferita è stata dimostrata in molti studi. Applicando chip microfluidici a un saggio electrotaxis, il processo di indagine è abbreviato e errori sperimentali sono ridotti al minimo. Negli ultimi anni, i dispositivi microfluidici fatti di sostanze polimeriche (ad esempio, polimetilmetacrilato, PMMA, o acrilico) o polidimetilsilossano (PDMS) sono stati ampiamente utilizzati nello studio delle risposte delle cellule alla stimolazione elettrica. Tuttavia, a differenza dei numerosi passaggi necessari per fabbricare un dispositivo PDMS, la costruzione semplice e rapida delle micro acrilici fl truciolo uidic rende adatto sia prototipazione dispositivo e produzione. Tuttavia nessuno dei dispositivi riportati facilitare lo studio efficace della sostanza chimica simultanea e DCEF effetti sulle cellule. In questo rapporto, descriviamo la nostra progettazione e fabbricazione di un multicanale base acrilica a doppio campo elettrico (MDF) chip per studiare l'effetto concomitante di chimica e di stimolazione elettrica sulle cellule tumorali del polmone. Il chip MDF fornisce otto combinazioni di stimolazioni elettriche / chimiche in un singolo test. Il chip non solo riduce notevolmente il tempo richiesto sperimentale ma aumenta anche la precisione in electrotaxis studi.
Introduction
Il comportamento delle cellule aderenti muovono verso un anodo o catodo in una corrente di campo elettrico diretto (dcEF) è indicato come electrotaxis. Il comportamento electrotactic delle cellule svolge un ruolo significativo nella embriogenesi, rigenerazione dei nervi, e la guarigione della ferita. 1 Le cellule tumorali come le cellule tumorali della prostata di ratto, cellule del cancro al seno 2, 3 e del polmone di cellule di adenocarcinoma 4-8 hanno dimostrato movimento electrotactic sotto un dcEF applicato . L'EF fisiologica è stata misurata nei tessuti della ghiandola. 9,10 Electrotaxis è stata riportata anche in cellule tumorali ghiandola associate. 2,3 Nel loro insieme, le electrotaxis di cellule tumorali è considerata un fattore di metastasi. 11 Controllo della guida elettrica di le cellule tumorali sotto dcEF può essere un approccio potenziale per il futuro trattamento del cancro. Tuttavia, oggi, il meccanismo molecolare dettagliato della electrotaxis rimane controverso. Pertanto, un'indagine sulla influence di stimolazione elettrica sulla migrazione delle cellule del cancro può facilitare lo sviluppo di strategie per il trattamento del cancro.
Di recente, i dispositivi bio-microfluidica sono stati fabbricati per studiare le risposte cellulari a fluire forza di taglio, 12 gradienti chimici, 13 e stimoli elettrici 4 in vitro. La fabbricazione di dispositivi bio-microfluidica con polidimetilsilossano (PDMS) o polimetilmetacrilato (PMMA, noto anche come acrilico) ha ridotto con successo il tasso di fallimento di tali esperimenti. Inoltre, utilizzando dispositivi microfluidici base acrilica come prototipo per lo studio soggetti biologici è più semplice rispetto all'utilizzo di PDMS chip. Diverse funzioni nei dispositivi a base acrilica sono stati sviluppati per electrotaxis studio. Tuttavia, nessuno dei disegni precedenti sono in grado di testare contemporaneamente gli effetti di varie condizioni chimiche e il campo elettrico sulle cellule per electrotaxis studio. Così, abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidica-multichannel dual-campo elettrico (MDF)-chip contenente quattro canali indipendenti, cultura e otto differenti condizioni sperimentali in un unico chip.
Il chip MDF base acrilica, prima volta da Hou et al., 8 integra stimolazione elettrica e diversi canali isolati chimicamente. Questi canali isolati chimicamente possono essere utilizzati per la cultura diversi tipi di cellule in un esperimento. La dcEF nei canali viene prodotta da un alimentatore elettrico. Due campi elettrici indipendenti, uno con applicazione di forza del campo elettrico (EFS) e un altro con 0 EFS, sono condotte in ciascun canale chimicamente isolato. In questo modo, il chip fornisce EF coesistenti meglio controllato e stimolazione chimica. Inoltre, i risultati della simulazione numerica della diffusione chimica all'interno del chip MDF indicano che non si è verificata una contaminazione incrociata tra i canali, dopo un periodo sperimentale 24 hr. 8
Rispetto al device riportato da Li et al., 14 il chip MDF fornisce un'area culturale più grande, che permette ulteriori analisi biochimica delle cellule stimolate elettricamente. Inoltre, con grande area di osservazione del chip MDF, più cellule possono essere osservati nel test, per cui l'analisi della velocità di migrazione o di direzionalità delle cellule stimolate elettricamente è più accurata. I modelli di chip singolo canale di studi precedenti riportati da Huang et al. 4 e Tsai et al. 15 consentono solo un tipo di cellula o chimica da testare. Tuttavia, il chip MDF può essere usato per studiare gli effetti di varie sostanze chimiche su electrotaxis, nonché gli effetti della stimolazione elettrica su diversi tipi di cellule. In altre parole, il chip MDF consente lo studio di dose efficace delle dipendenze chimiche.
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Protocol
1. Progettazione e Realizzazione della MDF Chip
- Disegnare un individuo modello strato acrilico utilizzando il software commerciale, come AutoCAD, e salvare il modello.
- Rivedere la progettazione dei quattro strati acrilico modello foglio nella figura 1A e confermare le connessioni inter-strato.
- Realizzare tutte le lastre acriliche e il nastro biadesivo per ablazione laser utilizzando una incisione laser CO 2 (figure 1B, 2A, 2B e). 16
- Accendere il incisione laser e collegare la macchina al computer portatile di controllo.
- Eseguire il software commerciale e aprire il modello progettato nel passo 1.1 cliccando su "pattern file progettato."
- Posizionare un pezzo di foglio bianco acrilico o nastro biadesivo sul palco XYZ di incisione laser.
- Impostare il fuoco del raggio laser sulla superficie del foglio acrilico o nastro biadesivo con un auto-alignmenbastone t fornite dal produttore del incisione laser.
- Inviare il modello progettato per l'incisione laser per la lavorazione diretta del foglio acrilico o nastro biadesivo.
- Rimuovere la carta protettiva dalle lastre acriliche con pinze e saltare la superficie pulita con azoto.
- Impilare i fogli acrilici e collegare insieme sotto una pressione di 2 kg / cm 2 in un bonder termico per 45 min a 110 ° C per formare il / assemblea canale di stimolazione elettrica di flusso.
- Preparare il vetro di copertura microscopio come substrato di coltura cellulare nel chip.
- Mettere il vetro di copertura in una vaschetta di colorazione e riempire il vaso con una diluizione di dieci volte del detergente indicato nel listino materiale.
- Mettere il vetro di copertura e vaschetta di colorazione in un Steri-pulitore ad ultrasuoni e pulire il vetro di copertura per 15 minuti.
- Versare il detergente diluito fuori dalla vaschetta di colorazione, riempire il vaso con acqua distillata, e ripetere il punto 1.5.2 3 volte.
- Asciugare il vetro di copertura pulito soffiando con azoto prima di aderire al nastro biadesivo.
- Rispettare il vetro di copertura pulita per il / gruppo elettrico canale di stimolazione del flusso con il nastro biadesivo fantasia al punto 1.2.
- Rispettare 13 pezzi di adattatori acriliche alle singole aperture del livello 1 del assemblaggio di chip MDF con colla super. L'assemblaggio di chip MDF è quindi completa (Figura 2D).
- Sterilizzare il completo assemblaggio di chip MDF con 30 min di irradiazione UV prima dell'uso.
2. Impostazione del Sale bridge di rete del MDF Chip
- Prima dell'uso, sterilizzare tutti i tubi di plastica, dita i dadi, e tubi da microcentrifuga mostrati nella Figura 3B impostando un tempo di 15 min a 121 azienda ° C in autoclave.
- Collegare i tubi fluoroplastici (Figura 3B-i) al gruppo di chip MDF attraverso l'entrata mediae gli adattatori di uscita illustrati nella Figura 1A.
- Collegare la conicità Luer dell'ingresso medio e presa tubi di plastica in Figura 3B-i a 3 vie rubinetti.
- Prendere 2,5 ml di CO 2 PBS -equilibrated (PBS) usando una siringa da 3 ml e collegare la siringa al rubinetto a 3 vie del tubo di plastica di ingresso. Collegare una siringa vuota 3 ml al rubinetto a 3 vie del tubo plastico scarico. Le due siringhe sono così interconnessi attraverso il chip MDF.
NOTA: incubare il PBS in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore O / N di ottenere emissioni di CO 2 -equilibrated PBS. - Sigillare le aperture del blu e gli adattatori verdi (Figura 1A) sul foglio di PMMA Livello 1 con noci dito-stretto solidi bianchi (Figura 3B-iii).
- Riempire i canali del ponte del sale e le camere di coltura con il CO 2 -equilibrated PBS nella siringa descritto in configurazione punto 2.4. Evitarela formazione di bolle.
- Avanti, mettere la CO 2 -equilibrated PBS contenenti chip di MDF in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore per O / N incubazione. Questo permette l'aria disciolta nel nastro biadesivo per formare bolle nelle camere.
- Lavare via le bolle nei canali da un rapido flusso PBS nel canale utilizzando le due siringhe. Pompa PBS avanti e indietro se necessario.
- Scaricare l'PBS nei canali tramite il rubinetto a 3 vie collegato al tubo di uscita media.
- Usando una nuova siringa da 3 ml, prendere 2,5 ml di CO 2 -equilibrated Dulbecco modificato (DMEM) (vedi punto 3.5), e sostituire la siringa collegata alla presa con quello nuovo. Riempire i canali con il medium.
- Preparazione della rete ponte salino.
- Temporalmente rimuovere i dadi solido (Figura 3B-iii) sulle schede verdi (Figura 1A) e iniettare 3% caldo (> 70 ° C) agarosio nella bri saleDGE canale attraverso l'apertura nella adattatori verde (Figura 1A).
NOTA: Preparazione di agarosio caldo: Sciogliere 1.5 g di polvere di agarosio in 50 ml di PBS. Sterilizzare impostando un tempo di 20 min tenuta a 121 ° C in autoclave. - Arrestare iniettando l'agarosio quando il liquido riempie tre quarti della lunghezza del canale ponte salino.
- Sigillare i pori sulle schede verdi (Figura 1A) avvitando i dadi solidi (Figura 3B-iii) dopo l'iniezione agarosio.
- Sostituire i dadi solide sulle schede blu (Figura 1A) con i dadi tubolari traslucidi dita a tenuta (Figura 3B).
- Caricare il 3% preriscaldato agarosio nei dadi tubolari (Figura 3B-IV).
- Incorpora gli elettrodi Ag / AgCl (Figura 3B-V) nei dadi tubolari (Figura 3B-iv) primasolidificazione del agarosio.
- Temporalmente rimuovere i dadi solido (Figura 3B-iii) sulle schede verdi (Figura 1A) e iniettare 3% caldo (> 70 ° C) agarosio nella bri saleDGE canale attraverso l'apertura nella adattatori verde (Figura 1A).
- Dopo aver completato la configurazione della rete ponte salino, iniettare le cellule tumorali del polmone CL1-5 nelle camere di cultura, una camera per volta.
3. Preparazione delle cellule tumorali e Set Up per Electrotactic Experiment
- Cultura regolare di linea di cellule cancro ai polmoni CL1-5.
- Coltivare le cellule tumorali CL1-5 polmonari, ottenuti dalla Prof. Pan-Chyr Yang, 17 in mezzo completo in un pallone di coltura cellulare a 37 75T ° C in atmosfera di CO 2 5%. Il terreno completo è composto da DMEM e siero fetale bovino 10% (FBS). Sub-cultura delle cellule ogni 3 o 4 giorni. Le cellule utilizzate per l'esecuzione di esperimenti electrotaxis sono meno di 25 brani del sorgente originale.
- Aggiungere 2 ml di 0,25% tampone tripsina alle crescita esponenziale cellule CL1-5 e incubare per 2 minuti in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore per detachmen cellularit.
- Terminare il processo di distacco con 6 ml di DMEM 10% FBS e centrifugare le cellule a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Poi scartare il medio e sospendere il pellet cellulare con 5 ml di PBS.
- Contare il numero di cellule in PBS. Dai 1 x 10 6 cellule e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Eliminare il PBS. Sospendere le cellule con preriscaldata CO 2 -equilibrated DMEM e regolare la densità delle cellule di essere 1 x 10 6 cellule / ml.
NOTA: incubare il terreno completo in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore O / N per ottenere la CO 2 -equilibrated DMEM.
4. Impostare per Electrotactic Experiment
- Dalla presa del chip MDF, iniettare 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, delle cellule nel chip.
- Incubare il chip MDF cellule testa di serie nell'incubatrice coltura cellulare (fissato a 37 ° C e 5% CO 2) per 2-4 ore.
- Configurazione di MDF microSistema fluidica.
- Installare il sistema microfluidica MDF su un calorifero trasparente di indio e stagno vetro ossido (ITO). Misurare la temperatura del chip MDF con una termocoppia di tipo K ritagliato tra il chip MDF e vetro ITO. Controllare il riscaldatore ITO con un controller proporzionale-integrale-derivativo (PID). Impostare la microfluidica temperatura del sistema di incubazione MDF a 37 ° C con il regolatore PID.
NOTA: La fabbricazione del riscaldatore ITO e la messa a punto del sistema di celle di riscaldamento cultura sono descritte nelle relazioni precedenti 18,19. - Montare l'assemblaggio di chip MDF temperatura controllata sul XYZ palco motorizzato controllato dal computer su un microscopio invertito. L'uso dello stadio motorizzato è descritta nel passaggio 5.1. Pompare il terreno completo nelle camere di cultura attraverso le prese con una pompa a siringa a quattro canali.
- Installare il sistema microfluidica MDF su un calorifero trasparente di indio e stagno vetro ossido (ITO). Misurare la temperatura del chip MDF con una termocoppia di tipo K ritagliato tra il chip MDF e vetro ITO. Controllare il riscaldatore ITO con un controller proporzionale-integrale-derivativo (PID). Impostare la microfluidica temperatura del sistema di incubazione MDF a 37 ° C con il regolatore PID.
- Pompa terreno completo nel chip MDF ad una portata di 20 l / h. I rifiuti cultura dal fuorilascia viene raccolto nei tubi microcentrifuga (indicati come "rifiuti" in Figura 3A).
- Incubare le cellule per un altro 16-18 ore a 37 ° C nel chip MDF.
- Per sostituire il mezzo, pompare il terreno contenente 50, 25, 5, 0 e inibitore chinasi pM, rispettivamente, in ciascuna camera di coltura ad una portata di 20 l / min per 10 min.
NOTA: Preparare una soluzione madre 10 mm di Rho-associata proteina chinasi inibitore Y27632 con l'aggiunta di 3 ml di acqua sterile per l'inibitore della chinasi 10,6 mg. Diluire la soluzione madre 10 mm a 50, 25 e 5 micron, rispettivamente con il 10% FBS DMEM. - Incubare le cellule della chinasi per altri 60 min a 37 ° C. Impostare la portata media di 20 l / h. Utilizzare la stessa temperatura della cultura e portata sopra descritto nei punti successivi.
- Utilizzare cavi elettrici per collegare un alimentatore CC al chip MDF tramite gli elettrodi Ag / AgCl sul chip.
- Collegare in serie un amperometro in il circuito elettrico. Utilizzare l'amperometro per controllare la corrente elettrica nel chip MDF.
- Accendere l'alimentazione in corrente continua e regolare la corrente di 86.94 μA amperometro regolando la tensione di alimentazione compresa tra 15 e 19 V.
NOTA: Considerando la legge di Ohm, E = I / (σA eff), dove I è la corrente elettrica che scorre attraverso il materiale sfuso, cioè, il terreno di coltura nella camera electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) è il conducibilità del terreno di coltura, A eff (= 0.21 mm 2 per una larghezza 3 mm x 0,07 mm di altezza) è l'area della sezione trasversale efficace della camera electrotactic, e la corrente elettrica (I) necessario per generare una 300 mV / mm EF nel chip MDF è 86.94 μA.
5. Acquisizione e analisi di cellule Immagini
- Controllare il palco motorizzato con un programma MATLAB GUI. Con il sistema microfluidico MDF montato sul microscope, spostare il chip alle regioni di osservazione usando il tavolino motorizzato.
- Immagini di cellule registrare utilizzando una fotocamera digitale reflex (SLR) montata sul microscopio.
- Prendere immagini microscopiche utilizzando una lente obiettivo 4X ad intervalli di 15 minuti per 2 ore.
- Analisi migrazione cellulare.
- Eseguire NIH ImageJ 1.47 V.
- Analizzare la distanza dagli iniziali alle posizioni finali del baricentro della cellula.
- Vai su "File" → "Importa" → "Sequenza d'immagini", e importare le nove immagini per l'analisi migrazione cellulare. La prima immagine è il risultato del tempo zero, e l'ultima immagine è il risultato di 120 min.
- Andare su "Analizza" → "Imposta misure" e selezionare la casella accanto a "Centroide"
- Fare clic sull'icona "a mano libera selezioni".
- Descrivere il bordo delle celle selezionate nella prima immagine.
- Vai su "Modifica" → "Selezione" → "Aggiungi a Manager"
- Vai all'immagine nono e raffigurano il bordo delle stesse celle selezionate sulla prima immagine. Le posizioni delle celle possono essere rintracciate utilizzando la seconda all'ottavo immagini.
- Vai su "Modifica" → "Selezione" → "Aggiungi a Manager"
- Ripetere i passaggi da 5.4.5 a 5.4.9 per raccogliere i dati da 90 a 100 celle.
- Vai "Analisi" → "Measure" per ottenere il risultato delle posizioni iniziale e finale delle celle selezionate.
NOTA: La velocità di migrazione è definita come la lunghezza media movimento cellulare per ora. La direzionalità è definita come il coseno, dove è l'angolo tra il vettore del dcEF (dall'anodo al catodo) e il vettore dal punto di partenza di una cella per la sua posizione finale. La direzionalità è -1 per cellule migranti verso l'anodo e uno per le cellule migrano verso il catodo. Per un gruppo di casualmente migrata cellule, la direzionalità è 0. 2
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Representative Results
Fabbricazione e montaggio del dispositivo MDF
Un diagramma schematico del chip MDF base acrilica è mostrato nella Figura 1A. Quattro strati acrilici, un vetro di copertura, 13 adattatori acrilici, e un pezzo di nastro biadesivo sono stati utilizzati per l'assemblaggio del chip MDF completato (Figura 2D). Ci sono solo quattro canali indipendenti di cultura nel dispositivo MDF. Tuttavia, la rete ponte salino on-chip crea otto diverse condizioni sperimentali nelle otto segmenti del chip. Tre ponti salini (i canali blu nello strato 2 di figura 1A), 79, 90, e 80 mm di lunghezza, sono stati accoppiati al secondo strato del chip MDF senza interferire con l'osservazione dell'immagine. I piccoli pori (canali cuboide blu in strati 3 e 4 di figura 1A) tra la rete ponte salino e le camere di coltura, che hanno un 0.25 Mm 2 area della sezione trasversale, minimizzato il flusso del fluido nel ponte salino durante l'esperimento. L'area culturale del chip MDF è circa 74 mm 2 in ciascun segmento. In questa dimostrazione, le camere di coltura cellulare del dispositivo MDF sono composti di spessore nastro e copertura in vetro a doppia faccia 70 micron. Tuttavia, se le diverse condizioni di coltura cellulare (ad esempio, un requisito di rivestimento di collagene, taglio basso flusso, o grande cultura del volume medio della camera di coltura) è necessario per la ricerca electrotaxis, sia i substrati di coltura ed i nastri potrebbero essere facilmente sostituiti. Pertanto, vari tipi di cellule possono essere utilizzate per electrotaxis studio all'interno del chip MDF.
Configurazione del sistema di microfluidica MDF
La configurazione del sistema microfluidica MDF è illustrato in Figura 3A. I componenti mostrati nella Figura 3B sono used per stabilire il flusso medio e la rete di corrente elettrica nel sistema microfluidica MDF. I tubi collegati con le dita i dadi cavi (rosso e verde) e conicità Luer (marrone) in figura 3B-i vengono utilizzati per il trasporto medio alla rete di flusso MDF. Dopo le siringhe sono stati collegati ai coni luer e regolati sulla pompa a quattro canali, il sistema di flusso conduttura era completa. Il terreno di coltura e rifiuti vengono trasportati attraverso il sistema di tubazioni. Poiché la connessione tra i tubi e gli adattatori acrilici sono fissati da connettori avvitati, la rete media MDF può tollerare pressione idraulica superiore può il sistema PDMS. A causa della estrema bassa permeabilità all'aria delle lastre acriliche e tubi, qualsiasi contatto tra la rete medio e l'ambiente esterno è bloccato. Pertanto, il valore pH del mezzo nel sistema rimane stabile, e cellule può essere coltivato utilizzando il sistema microfluidico MDF fuori di un incubatore CO 2. Dal momento che il ch MDFIP è installato su un palco motorizzato, immagini di cellule time-lapse possono essere prelevati da otto sezioni individuali. I tubi microcentrifuga a fondo aperto (Figura 3B-ii) sono montati sulle dita i dadi tubolari traslucidi (Figura 3B-iv) per aumentare la capacità di volume di agarosio. In questo modo, relativamente grandi elettrodi possono essere inseriti nel agarosio per fornire stimolazione elettrica stabile alle cellule per periodi di tempo più lunghi.
Generazione di campo elettrico in corrente continua indicata nel chip MDF
La tensione di ciascuna camera può essere misurata tramite gli elettrodi impiantati nel chip circuito elettrico collegato. Tuttavia, non abbiamo misurato la tensione nella camera. Piuttosto, abbiamo simulato il campo elettrico nella rete ponte salino e le camere di coltura cellulare del chip. Quattro camere electrotactic erano in serie concollegato a circuiti elettrici. In questo modo, la stessa corrente elettrica viene mantenuta in ciascuna di queste camere. Secondo la legge di Ohm, l'EFS correla con l'area della sezione trasversale delle camere nel dispositivo microfluidico. Inoltre, tutte le lastre in PMMA e nastri sono stati fabbricati dalla incisione laser CO 2. L'allineamento dei pezzi di assemblaggio di chip è preciso e difetti strutturali del chip sono minime. Così, i EFS in ciascuna camera dovrebbero rimanere stabili. I risultati della simulazione campo elettrico mostrano una distribuzione omogenea di EFS con 300 e 0 mV / mm nella prima metà e le rimanenti due metà delle camere di coltura nel dispositivo (dati non mostrati). In precedenza, i rapporti dal nostro laboratorio, Huang et al. e Tsai et al., hanno dimostrato che la differenza di misura ei valori EFS simulati era inferiore al 4%. 4,15 Questo risultato dimostra che, nel nostro sistema, il campo elettrico misurato corrisponde bene con il valore simulato. In questo work, abbiamo inserito elettrodi grandi Ag / AgCl per fornire corrente elettrica stabile per un lungo esperimento. La corrente applicata sul chip MDF diminuito solo 1,85 ± 0,19% dopo 7 ore di stimolazione EF negli esperimenti electrotaxis. Inoltre, il periodo più lungo di stimolazione elettrica è stato di 4 ore nel nostro studio. Pertanto, riteniamo che la corrente elettrica in ingresso rimane stabile durante electrotaxis test, e il campo elettrico nelle camere electrotactic del chip MDF sono monitorati dal l'amperometro collegato in serie.
Indagine dei electrotaxis di cellule tumorali polmonari utilizzando il sistema microfluidica MDF
Il regolamento electrotactic di Rho-associata coiled-coil chinasi (ROCK) è stata dimostrata in ovariche di criceto cinese (CHO), 20 endoteliale, 21 e 22 cellule neuronali ma non è stato ancora indagato per il cancro del polmone cells. Pertanto, l'inibitore ROCK, Y27632, è stato applicato al sistema microfluidico MDF per studiare l'effetto sui electrotaxis di cellule tumorali. Come mostrato in Figura 4, il trattamento di Y27632 ha mostrato alcun effetto nel modificare la velocità di migrazione delle cellule con o senza stimolazione elettrica. Tuttavia, l'applicazione di Y27632 alle cellule tumorali sotto dcEF (300 mV / mm) ha ridotto significativamente la loro migrazione anodica. Alla concentrazione di 50 micron, l'inibitore ROCK eliminato il movimento anodica delle cellule tumorali del polmone, ma non ha influenzato la loro velocità di migrazione. Inoltre, c'era una correlazione dose-dipendente tra le concentrazioni chimiche applicate e l'indice di direzionalità (Figura 4B). Questi risultati suggeriscono che il sistema microfluidico MDF è affidabile ed efficiente per studiare electrotaxis.
Figura 1. Design del chip MDF. (A) Schema del chip MDF. Il dispositivo di MDF è costituito da quattro strati di lastre acriliche (72 × 50 mm), 13 adattatori acrilici (10 × 10 × 6 mm), nastro biadesivo, e un vetro di copertura (24 × 60 mm). Lo spessore della lastra acrilica Layer 2 è 2 mm e gli altri tre strati sono ciascuno 1 mm. Nei tre strati acrilici inferiori, il ponte salino e reti di flusso medie sono rappresentate dai blocchi blu e rosso, rispettivamente. Nel primo strato strato acrilico, adattatori acrilici verdi sono stati utilizzati per l'iniezione di agarosio. Adattatori acriliche sono state usate come il collegamento agli elettrodi Ag / AgCl. Ci sono quattro camere di coltura cellulare nel chip MDF. La zona e l'altezza di ciascuna camera di coltura cellulare sono 148 mm 2 (3 × 46 mm) e 0,07 mm rispettivamente. I piccoli canali blu sugli strati 3 e 4 si collegano alla rete ponte salino alle camere di coltura. La sezione trasversale di questi canali di connessione è di 0,25 mm
Figura 2. MDF processi di fabbricazione di chip e di assemblaggio. (A) I modelli del foglio acrilico e nastro biadesivo sono stati descritto da lavorazione laser CO 2. (B) I singoli strati di fogli acrilici sono stati fabbricati da un laser CO 2 secondo il disegno di progetto. (C) Il foglio acrilico pulitas sono stati legati insieme utilizzando un bonder termico. (D): Completa assemblaggio di chip MDF. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Sistema di electrotaxis studio. (A) Schema del sistema per l'esperimento electrotaxis. I tubi collegati al chip MDF stati usati per infusione medio efflusso rifiuti. Il dcEF nel chip è stata condotta attraverso l'Ag / AgCl elettrodi e alimentazione. La configurazione del dispositivo è stato installato sul palco del motore XYZ di un microscopio. Le immagini delle cellule nel chip sono state scattate da una macchina fotografica reflex digitale commerciale. (B) fotografia dei componenti della rete di flusso del mezzo e la generazione dcEF nel sistema microfluidica MDF, including (i) il connettore del tubo, (ii) microprovette aperti a fondo, (iii) solido noce dito-stretto bianco, (iv) il dado dito tenuta tubolare trasparente, e (v) elettrodi Ag / AgCl. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Effetto di Y27632 sulla migrazione delle cellule del cancro del polmone alle EFS di (A) zero e (B) 300 stimolazione mV / mm. DcEF stato applicato dopo un pretrattamento 1 ora con la concentrazione indicata di Y27632. La stimolazione elettrica è durato per 2 ore. L'analisi quantitativa della direzionalità e la velocità di migrazione delle cellule consititute un esperimento rappresentativo. 90-100 cellule sono stati utilizzati nell'analisi dei dati. * P <0,001. I dati sono espressi come media ± errore standardla media (SEM). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo trovato il processo di aderire adattatori acrilico su livello 1 del chip MDF di essere ingannevole. L'applicazione di appena 1 o 2 ml di colla super è sufficiente per aderire saldamente all'adattatore sul chip MDF. Grandi quantità di colla comportato un polimerizzazione incompleta del super colla e mancato adempimento. Una volta che gli adattatori acrilici erano saldamente rispettati sul chip MDF, perdite di liquido nel sistema microfluidico raramente verificato. Inoltre, O / N incubazione all'interno della camera a vuoto ha contribuito a rimuovere l'aria intrappolata tra il nastro biadesivo / vetro di copertura o biadesivo interfaccia fogli nastro / acrilico. Di conseguenza, questo processo aumenta la stabilità della camera di coltura nel chip MDF.
Il controllo della temperatura di agarosio al 3% durante la preparazione della rete ponte salino è importante. Se la temperatura del agarosio non è sufficientemente elevato durante l'iniezione, l'agarosio si solidificare rapidamente all'interno della siringa e non puòessere immesso nella rete ponte salino. Inoltre, durante l'iniezione agarosio, è importante evitare la formazione di bolle nella rete ponte salino. La comparsa di bolle aumenta notevolmente la resistenza elettrica della rete e porta al fallimento sperimentale. Inoltre, una volta che l'agarosio solidifica durante l'iniezione, non può bloccare completamente il flusso di liquido nel canale ponte salino. Come tali, le sostanze chimiche possono facilmente fuoriuscire in altri canali. L'approccio migliore è quello di iniettare agarosio caldo nella rete e per poi consentire l'agarosio solidificare all'interno dei canali del ponte del sale.
Iniezione delle cellule è un processo critico nell'esperimento electrotaxis. Per garantire un numero sufficiente di cellule per la semina di cellule nella camera di coltura, abbiamo iniettato numero eccessivo di cellule. In questo approccio, le cellule sono state iniettate dalla presa. La velocità di iniezione deve essere lenta e anche per evitare una distribuzione non uniforme delle cellule nella camera di coltura. Inoltre, poiché laI canali sono isolati nel chip MDF, l'iniezione deve essere fatto un canale alla volta. Così, il processo di iniezione cellula completa richiede tempo. In futuro, sarà necessario creare un canale di iniezione di cellule aggiuntivo che può cellule implantari simultaneamente in tutti i quattro camere di coltura. Questo nuovo processo ridurrà volume del campione, il numero di cellule necessario per l'iniezione, e il tempo di funzionamento.
Ci sono diversi vantaggi nell'utilizzo acrilico anziché PDMS come il materiale per la realizzazione del dispositivo microfluidico. Un dispositivo a base acrilica può essere utilizzato direttamente su una stufa senza un incubatore. Dal momento che il sistema non richiede di CO 2 di alimentazione, le cellule possono essere coltivate in un chip bio-microfluidica a base acrilica su un microscopio invertito regolare con il riscaldamento. È facile registrare immagini cellulari nel chip di fuori di un incubatore. Abbiamo utilizzato un commerciale reflex digitale ampiamente disponibili per registrare le immagini di cellule del sistema. Inoltre, il software necessaria per il controllo programmabile della telecamera è anche facilmente disponibile. Questo rende time-lapse imaging delle cellule facilmente programmabile. Pertanto, il costo di costruzione del sistema di registrazione automatica immagine bio-microfluidico è molto inferiore a quella di un sistema commerciale. Al contrario, quando si utilizza un chip basato PDMS, il sistema deve essere azionato in un incubatore CO 2. Così, apparecchi registrazione immagine in più deve essere acquistato per il funzionamento in incubatrice. Tale attrezzatura è costosa, relativamente ingombranti, e occupa una grande porzione dello spazio limitato nell'incubatrice coltura cellulare. In un altro aspetto, rispetto al processo di fabbricazione di chip PDMS, la fabbricazione semplice e rapido delle micro acrilici fl truciolo uidic è adatto sia per prototipazione dispositivo e produzione. Inoltre, rispetto al dispositivo PDMS basata, il chip microfluidico base acrilica, è strutturalmente più stabile e più adatto per la costruzione di un complicato sistema di rete microfluidica tridimensionale, come eraeseguita con il chip MDF in questo studio. La rete bridge on-chip di sale nel chip MDF non può essere facilmente prodotto in un dispositivo basato PDMS. Questo sistema di rete riduce al minimo la dimensione totale del chip microfluidica e rende electrotaxis la ricerca più facile e veloce.
All'interno del chip MDF, abbiamo generato solo due punti di forza del campo elettrico (EFS, 0 e 300 mV / mm) in ciascun canale isolato. Tuttavia, il chip MDF e multi-chip di campo electrotactic, come riportato da Huang et al., 4 condividono un disegno simile canale nella regione coltura cellulare. Modificando la forma della camera di coltura nel chip MDF, EFS multipli possono anche essere generati sul chip MDF. Con queste modifiche, multiple EFS e più sostanze chimiche possono essere utilizzati nello stesso test. Di conseguenza, un sistema di screening ad alta produttività potrebbe essere creato per indagare electrotaxis utilizzando il dispositivo.
In un solo esperimento, il chip MDF è in grado di testare gli effettidiverse sostanze chimiche sulle cellule sotto dcEF o le influenze di stimolazione elettrica su diversi tipi di cellule. Può anche essere possibile attuare 20 isolato canali paralleli nel chip MDF senza aumentare significativamente le dimensioni del dispositivo. 8 Come dimostrato in questo lavoro, in un esperimento, si è ottenuta una correlazione dose-dipendente significativa tra la direzionalità della migrazione cellulare e Y27632 (Figura 4). Il chip in MDF con quattro canali offre chiaramente un approccio efficace per studiare electrotaxis nelle cellule tumorali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
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