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Bioengineering

एक multichannel दोहरे बिजली क्षेत्र microfluidic चिप का उपयोग कर लंग कैंसर कोशिकाओं के Electrotaxis अध्ययन

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53340
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

Abstract

एक प्रत्यक्ष वर्तमान बिजली क्षेत्र (dcEF) के तहत दिशात्मक सेल प्रवास के व्यवहार electrotaxis के रूप में जाना जाता है। भ्रूण के विकास, सेल भेदभाव, और घाव भरने के दौरान सेल आंदोलन का मार्गदर्शन में शारीरिक dcEF की महत्वपूर्ण भूमिका कई अध्ययनों में प्रदर्शन किया गया है। एक electrotaxis परख करने के लिए microfluidic चिप्स को लागू करके, जांच प्रक्रिया छोटा है और प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम से कम कर रहे हैं। हाल के वर्षों में, microfluidic उपकरणों polymeric पदार्थ (जैसे, polymethylmethacrylate, PMMA, या एक्रिलिक) या polydimethylsiloxane (PDMS) व्यापक रूप से बिजली की उत्तेजना के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में इस्तेमाल किया गया है से बना है। हालांकि, एक PDMS डिवाइस के निर्माण के लिए आवश्यक कई कदम के विपरीत, uidic चिप FL एक्रिलिक सूक्ष्म की सरल और तेजी से निर्माण डिवाइस प्रोटोटाइप और उत्पादन दोनों के लिए उपयुक्त बनाता है। अभी तक रिपोर्ट उपकरणों में से कोई भी एक साथ रासायनिक और डीसीई के कुशल अध्ययन की सुविधाकोशिकाओं पर एफ प्रभाव। इस रिपोर्ट में, हम हमारे डिजाइन और फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं पर रासायनिक और बिजली की उत्तेजना की समवर्ती प्रभाव की जांच करने के लिए एक ऐक्रेलिक आधारित मल्टीचैनल दोहरे बिजली क्षेत्र (एमडीएफ) चिप के निर्माण का वर्णन है। एमडीएफ चिप एक टेस्ट मैच में इलेक्ट्रिकल / रासायनिक stimulations के आठ संयोजन प्रदान करता है। चिप बहुत आवश्यक प्रयोगात्मक समय shortens लेकिन यह भी electrotaxis अध्ययन में सटीकता बढ़ जाती ही नहीं।

Introduction

एक प्रत्यक्ष वर्तमान बिजली क्षेत्र (dcEF) के तहत एक anode या कैथोड की ओर बढ़ रहा पक्षपाती कोशिकाओं के व्यवहार electrotaxis के रूप में जाना जाता है। कोशिकाओं के electrotactic व्यवहार भ्रूण, तंत्रिका उत्थान, और घाव भरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस तरह के चूहे प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं, 2 स्तन कैंसर की कोशिकाओं, 3 और फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं 4-8 के रूप में एक ट्यूमर कोशिकाओं को एक आवेदन dcEF तहत electrotactic आंदोलन से पता चला है । शारीरिक एफई ग्रंथि के ऊतकों में मापा गया है। 9,10 Electrotaxis भी ग्रंथि से जुड़े ट्यूमर कोशिकाओं में सूचना दी गई है। 2,3 कैंसर कोशिकाओं के electrotaxis एक मेटास्टेसिस कारक माना जाता है, साथ में ले ली। 11 के बिजली के मार्गदर्शन को नियंत्रित करना dcEF के तहत कैंसर की कोशिकाओं को कैंसर के भविष्य के उपचार के लिए एक संभावित दृष्टिकोण हो सकता है। बहरहाल, आज, electrotaxis की विस्तृत आणविक तंत्र विवादास्पद बना हुआ है। इसलिए, संसाधनों की एक जांचकैंसर सेल प्रवास पर बिजली की उत्तेजना के luence कैंसर के इलाज के लिए रणनीति के विकास की सुविधा कर सकते हैं।

हाल ही में, जैव microfluidic उपकरणों इन विट्रो में, 12 रासायनिक ढ़ाल, 13 और बिजली उत्तेजनाओं 4 कतरनी बल प्रवाह करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए निर्मित किया गया है। (यह भी एक्रिलिक के रूप में जाना जाता है PMMA,) polydimethylsiloxane (PDMS) या polymethylmethacrylate का उपयोग कर जैव microfluidic उपकरणों के निर्माण को सफलतापूर्वक इस तरह के प्रयोगों की विफलता की दर में कमी आई है। इसके अलावा, जैविक विषयों की जांच के लिए एक प्रोटोटाइप के रूप में एक्रिलिक आधारित microfluidic उपकरणों का उपयोग कर PDMS चिप्स का उपयोग की तुलना में आसान है। एक्रिलिक आधारित उपकरणों में विभिन्न कार्यों electrotaxis अध्ययन के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, पिछले डिजाइनों में से कोई भी एक साथ electrotaxis अध्ययन के लिए कोशिकाओं पर विभिन्न रासायनिक परिस्थितियों का प्रभाव और बिजली के क्षेत्र परीक्षण करने में सक्षम हैं। इस प्रकार, हम एक microfluidic युक्ति-म्यू विकसितltichannel दोहरे बिजली क्षेत्र (एमडीएफ) चिप युक्त चार स्वतंत्र संस्कृति चैनलों और एक चिप में आठ विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों।

पहले होउ द्वारा रिपोर्ट ऐक्रेलिक आधारित एमडीएफ चिप, एट अल।, 8 बिजली की उत्तेजना और कई रासायनिक पृथक चैनलों एकीकृत करता है। ये रासायनिक पृथक चैनलों एक प्रयोग में संस्कृति के लिए कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चैनलों में dcEF एक बिजली बिजली की आपूर्ति द्वारा निर्मित है। दो स्वतंत्र बिजली क्षेत्र, एप्लाइड बिजली क्षेत्र की ताकत (EFS) और 0 EFS के साथ एक दूसरे के साथ, प्रत्येक रासायनिक पृथक चैनल में आयोजित की जाती हैं। इस तरह, चिप बेहतर नियंत्रित coexisting एफई और रासायनिक उत्तेजना प्रदान करता है। इसके अलावा, एमडीएफ चिप के अंदर रासायनिक प्रसार के संख्यात्मक अनुकरण से परिणाम कोई पार संदूषण एक 24 घंटा प्रयोगात्मक अवधि के बाद चैनलों के बीच हुआ है कि संकेत मिलता है। 8

देवी की तुलनाली द्वारा रिपोर्ट सीई एट अल।, 14 एमडीएफ चिप विद्युत प्रेरित कोशिकाओं के आगे जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है जो एक बड़ा संस्कृति क्षेत्र प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, एमडीएफ चिप के बड़े अवलोकन क्षेत्र के साथ और अधिक कोशिकाओं की परीक्षा में मनाया जा सकता है, तो विद्युत प्रेरित कोशिकाओं के प्रवास गति या directedness के विश्लेषण में ज्यादा सटीक है। हुआंग एट अल। 4 और साई एट अल। 15 द्वारा रिपोर्ट पिछले अध्ययनों के एकल चैनल चिप डिजाइन सेल या रासायनिक का ही एक प्रकार का परीक्षण करने की अनुमति देते हैं। हालांकि, एमडीएफ चिप electrotaxis पर विभिन्न रसायनों के प्रभाव, के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के विभिन्न प्रकारों पर बिजली की उत्तेजना के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दूसरे शब्दों में, एमडीएफ चिप रासायनिक खुराक निर्भरता के कुशल अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

1. डिजाइन और MDF चिप का निर्माण

  1. ऐसे ऑटोकैड के रूप में वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक व्यक्ति एक्रिलिक परत पैटर्न ड्रा, और पैटर्न बचाने के लिए।
    1. चित्रा 1 ए में चार परत एक्रिलिक पत्र पैटर्न की डिजाइन की समीक्षा और अंतर-परत कनेक्शन की पुष्टि करें।
  2. सभी एक्रिलिक शीट और एक सीओ 2 लेजर खुरचने का औजर (आंकड़े 1 बी, 2 ए, और 2 बी) का उपयोग लेजर पृथक से दो तरफा टेप बनाना। 16
    1. लेजर खुरचने का औजर पर मुड़ें और नियंत्रित लैपटॉप के लिए मशीन से कनेक्ट।
    2. वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर चलाने और क्लिक करके 1.1 चरण में डिजाइन पैटर्न खोलने "डिजाइन पैटर्न फ़ाइल।"
    3. लेजर खुरचने का औजर के xyz मंच पर खाली एक्रिलिक पत्र या दो तरफा टेप का एक टुकड़ा रखें।
    4. एक ऑटो alignmen साथ एक्रिलिक पत्र या दो तरफा टेप की सतह पर लेजर बीम का ध्यान केंद्रित सेट करेंलेजर खुरचने का औजर के निर्माता द्वारा प्रदान की टी छड़ी।
    5. एक्रिलिक शीट या डबल पक्षीय टेप के प्रत्यक्ष मशीनिंग के लिए लेजर खुरचने का औजर करने के लिए डिज़ाइन पैटर्न भेजें।
  3. संदंश का उपयोग एक्रिलिक चादरों से सुरक्षात्मक अखबार निकालें और नाइट्रोजन गैस के साथ साफ सतह झटका।
  4. एक्रिलिक शीट हो चुकी है और 110 पर 45 मिनट के लिए एक थर्मल bonder में 2 किलो / 2 सेमी के दबाव के तहत उन्हें एक साथ बांड प्रवाह / बिजली की उत्तेजना चैनल विधानसभा बनाने के लिए सी °।
  5. चिप में सेल संस्कृति सब्सट्रेट के रूप में माइक्रोस्कोप कवर ग्लास तैयार करें।
    1. एक धुंधला जार में कांच कवर रखो और सामग्री की सूची में सूचीबद्ध डिटर्जेंट की एक दस गुना कमजोर पड़ने के साथ जार भरें।
    2. एक अल्ट्रासोनिक steri-क्लीनर में कांच कवर और धुंधला जार में डाल दिया और 15 मिनट के लिए कवर कांच साफ।
    3. , धुंधला जार से बाहर पतला डिटर्जेंट डालो आसुत जल के साथ जार फिर से भरना, और 1.5 कदम दोहराएँ।2 से 3 बार।
    4. दो तरफा टेप करने के लिए इसे पालन करने से पहले नाइट्रोजन गैस के साथ इसे उड़ाने से साफ कांच कवर सूखी।
  6. 1.2 चरण में नमूनों डबल पक्षीय टेप के साथ प्रवाह / बिजली की उत्तेजना चैनल विधानसभा के लिए साफ कांच कवर पालन करें।
  7. सुपर गोंद के साथ MDF चिप विधानसभा की परत 1 में व्यक्ति के उद्घाटन के लिए एक्रिलिक एडेप्टर के 13 टुकड़े पालन करें। एमडीएफ चिप विधानसभा तो पूरा (चित्रा 2 डी) है।
  8. उपयोग करने से पहले पराबैंगनी विकिरण के 30 मिनट के साथ पूरा एमडीएफ चिप विधानसभा जीवाणुरहित।

एमडीएफ चिप का नमक पुल नेटवर्क की 2. सेटअप

  1. , का उपयोग 121 पर 15 मिनट की एक जोत समय निर्धारित करके चित्रा 3 बी में दिखाए गए सभी प्लास्टिक की ट्यूब, उंगली से तंग नट्स, और microcentrifuge ट्यूब बाँझ से पहले आटोक्लेव में सी °।
  2. मध्यम प्रवेश के माध्यम से एमडीएफ चिप विधानसभा के लिए fluoroplastic ट्यूब (चित्रा 3 बी-आई) कनेक्टऔर आउटलेट एडेप्टर चित्रा 1 ए में दिखाया गया है।
  3. चित्रा में प्लास्टिक ट्यूब मध्यम इनलेट की Luer शंकु कनेक्ट और आउटलेट 3 बी-मैं 3 तरह stopcocks करने के लिए।
  4. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर सीओ 2 -equilibrated फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 2.5 मिलीलीटर ले लो और इनलेट प्लास्टिक ट्यूब के 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के लिए सिरिंज कनेक्ट। आउटलेट प्लास्टिक ट्यूब के 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के लिए एक खाली 3 मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट। दो सीरिंज इस प्रकार एमडीएफ चिप के माध्यम से जुड़े रहते हैं।
    नोट: 37 में पीबीएस सेते डिग्री सेल्सियस 5% -CO 2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर हे / एन सीओ 2 पीबीएस -equilibrated प्राप्त करने के लिए।
  5. सफेद ठोस उंगली से तंग पागल के साथ परत 1 PMMA शीट पर नीले रंग का उद्घाटन और हरी एडाप्टर (चित्रा 1 ए) सील (चित्रा 3 बी-III)।
  6. सीओ 2 के साथ नमक पुल चैनलों और संस्कृति कक्षों भरें सेटअप 2.4 चरण में वर्णित सिरिंज में पीबीएस -equilibrated। बचेंबुलबुले के गठन।
  7. इसके बाद, सीओ 2 डाल दिया हे / एन ऊष्मायन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस 5% -CO 2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में एमडीएफ चिप पीबीएस युक्त -equilibrated। यह दो तरफा टेप में भंग हवा कक्षों में बुलबुले के रूप में करने की अनुमति देता है।
  8. दो सीरिंज का उपयोग चैनल में तेजी से पीबीएस प्रवाह से चैनलों में बुलबुले को दूर बहा। आगे और पीछे यदि आवश्यक हो तो पीबीएस पम्प।
  9. मध्यम आउटलेट ट्यूब से जुड़ा 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से चैनलों में पीबीएस नाली।
  10. सीओ 2 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) -equilibrated का एक नया 3 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, 2.5 मिलीलीटर ले (3.5 कदम देखें), और एक नए के साथ प्रवेश करने के लिए लॉग इन सिरिंज की जगह। मध्यम के साथ चैनलों फिर से भरना।
  11. नमक पुल नेटवर्क तैयार करना।
    1. अस्थायी ठोस नट (चित्रा 3 बी-III) हरी एडेप्टर पर (चित्रा 1 ए) को हटाने और (> 70 डिग्री सेल्सियस) agarose में नमक Bri गर्म 3% इंजेक्षनहरी एडाप्टर (चित्रा 1 ए) में खोलने के माध्यम से डीजीई चैनल।
      नोट: गर्म agarose की तैयारी: पीबीएस के 50 मिलीलीटर में agarose पाउडर के 1.5 ग्राम भंग। आटोक्लेव में 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट की एक जोत समय निर्धारित करके जीवाणुरहित।
    2. तरल नमक पुल चैनल की लंबाई की तीन चौथाई भरता है जब agarose इंजेक्शन लगाने बंद करो।
    3. Agarose इंजेक्शन के बाद ठोस नट (चित्रा 3 बी-III) पंगा लेना द्वारा हरी एडाप्टर (चित्रा 1 ए) पर मुहर pores।
    4. पारदर्शी ट्यूबलर उंगली से तंग पागल (चित्रा 3 बी) के साथ नीले रंग एडाप्टर (चित्रा 1 ए) पर ठोस पागल बदलें।
    5. 3% ट्यूबलर नट (चित्रा 3 बी-IV) में agarose पूर्व गरम कर लेता है।
    6. पहले ट्यूबलर नट्स में एजी / AgCl इलेक्ट्रोड (चित्रा 3 बी-V) (चित्रा 3 बी-चतुर्थ) एम्बेडagarose की सम्पिण्डन।
  12. नमक पुल नेटवर्क की स्थापना के पूरा करने के बाद, एक समय में, संस्कृति कक्षों में एक कक्ष CL1-5 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं इंजेक्षन।

3. कैंसर कोशिकाओं की तैयारी और Electrotactic प्रयोग के लिए स्थापित

  1. फेफड़ों के कैंसर कोशिका लाइन CL1-5 के नियमित संस्कृति।
    1. 37 पर एक 75T सेल संस्कृति फ्लास्क में पूरा मध्यम में प्रो पान Chyr यांग, 17 से प्राप्त संस्कृति CL1-5 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को, एक 5% सीओ 2 माहौल में सी °। पूरा मध्यम DMEM और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) से बना है। उप-संस्कृति कोशिकाओं हर 3 से 4 दिनों के लिए। electrotaxis प्रयोगों प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं मूल स्रोत से कम से कम 25 अंश हैं।
  2. तेजी से बढ़ रही CL1-5 कोशिकाओं को 0.25% trypsin के बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 37 में 2 मिनट के लिए सेते सेल detachmen के लिए डिग्री सेल्सियस 5% -CO 2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटरटी।
  3. 10% FBS के DMEM के 6 मिलीलीटर के साथ टुकड़ी प्रक्रिया बर्खास्त और आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। तो मध्यम त्यागने और पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ सेल गोली निलंबित।
  4. पीबीएस में कोशिकाओं की संख्या की गणना। तब आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज ले।
  5. पीबीएस त्यागें। पूर्व गर्म सीओ 2 -equilibrated DMEM के साथ कोशिकाओं को निलंबित और 1 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल होना करने के लिए सेल घनत्व को समायोजित।
    नोट: 37 में पूरा मध्यम सेते डिग्री सेल्सियस सीओ 2 को प्राप्त करने के लिए -CO 2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर हे / एन DMEM -equilibrated 5%।

4. Electrotactic प्रयोग के लिए स्थापित

  1. एमडीएफ चिप की दुकान से, चिप में कोशिकाओं के 1 × 10 6 मिलीग्राम / 0.3 मिलीलीटर, इंजेक्षन।
  2. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सेल वरीयता प्राप्त एमडीएफ चिप सेते (37 पर सेट 2-4 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2)।
  3. एमडीएफ सूक्ष्म का सेटअपfluidic प्रणाली।
    1. एक पारदर्शी इंडियम टिन ऑक्साइड ग्लास (आईटीओ) हीटर पर एमडीएफ microfluidic प्रणाली स्थापित करें। एमडीएफ चिप और आईटीओ कांच के बीच काटा एक कश्मीर प्रकार thermocouple के साथ MDF चिप के तापमान को मापने। एक आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (पीआईडी) नियंत्रक के साथ आईटीओ हीटर पर नियंत्रण रखें। 37 को एमडीएफ microfluidic प्रणाली ऊष्मायन तापमान सेट पीआईडी ​​नियंत्रक के साथ सी °।
      नोट: आईटीओ हीटर के निर्माण और सेल संस्कृति हीटिंग सिस्टम की स्थापना पिछली रिपोर्टों में वर्णित हैं 18,19।
    2. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कंप्यूटर नियंत्रित xyz के motorized मंच पर तापमान नियंत्रित एमडीएफ चिप विधानसभा माउंट। मोटरयुक्त चरण का उपयोग 5.1 कदम में वर्णित है। एक चार चैनल सिरिंज पंप के साथ inlets के माध्यम से संस्कृति कक्षों में पूरा मध्यम पम्प।
  4. 20 μl / घंटा की एक प्रवाह दर पर एमडीएफ चिप में पूरा मध्यम पम्प। बाहर से संस्कृति बर्बादी(चित्रा 3 ए में "बेकार" के रूप में दिखाया गया है) microcentrifuge ट्यूबों में एकत्र किया जाता है की सुविधा देता है।
  5. एमडीएफ चिप में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 16-18 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. मध्यम बदलने के लिए, 10 मिनट के लिए 20 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर प्रत्येक संस्कृति कक्ष में क्रमश: 50, 25, 5, और 0 माइक्रोन kinase अवरोध युक्त मध्यम, पंप।
    नोट: 10.6 मिलीग्राम kinase अवरोध करने के लिए बाँझ पानी की 3 मिलीलीटर जोड़कर रो जुड़े प्रोटीन kinase अवरोध Y27632 की एक 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है। 10% FBS के DMEM माध्यम का उपयोग कर, क्रमश: 50, 25, और 5 माइक्रोन के लिए 10 मिमी शेयर समाधान पतला।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 60 मिनट के लिए kinase अवरोध में कोशिकाओं को सेते हैं। / घंटा 20 μl के लिए माध्यम के प्रवाह की दर निर्धारित किया है। एक ही संस्कृति के तापमान का प्रयोग करें और बाद के चरणों में ऊपर वर्णित दर प्रवाह।
  8. चिप पर एजी / AgCl इलेक्ट्रोड के माध्यम से एमडीएफ चिप के लिए एक डीसी बिजली की आपूर्ति कनेक्ट करने के लिए बिजली के तारों का प्रयोग करें।
  9. क्रमानुसार एक ammeter मैं कनेक्टn बिजली के सर्किट। एमडीएफ चिप में विद्युत प्रवाह की निगरानी के लिए ammeter का प्रयोग करें।
  10. डीसी बिजली की आपूर्ति चालू करें और वी के बीच 15 और 19 के लिए बिजली की आपूर्ति वोल्टेज का समायोजन करके 86.94 μA के लिए वर्तमान ammeter सेट
    नोट: ओम कानून को ध्यान में रखते मैं थोक सामग्री के माध्यम से बह विद्युत प्रवाह, यानी, electrotactic कक्ष में संस्कृति के माध्यम से है, जहां ई = मैं / (σA EFF), σ (= 1.38 Ω -1 एम - 1) है संस्कृति के माध्यम से, (0.07 मिमी ऊंचाई × 3 मिमी चौड़ाई के लिए = 0.21 मिमी 2) एक eff की चालकता electrotactic चैम्बर के प्रभावी पार के अनुभागीय क्षेत्र, और एक 300 एम वी / मिमी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक विद्युत प्रवाह (आई) है एमडीएफ चिप में एफई 86.94 μA है।

5. अधिग्रहण और सेल छवियों का विश्लेषण

  1. एक MATLAB जीयूआई प्रोग्राम का उपयोग कर motorized मंच पर नियंत्रण रखें। Microsco पर मुहिम शुरू की एमडीएफ microfluidic प्रणाली के साथपीई, मोटरयुक्त मंच का उपयोग अवलोकन क्षेत्रों के लिए चिप चलते हैं।
  2. एक डिजिटल एकल लेंस पलटा (एसएलआर) कैमरे का उपयोग कर रिकार्ड सेल छवियों खुर्दबीन पर मुहिम शुरू की।
  3. 2 घंटे के लिए 15 मिनट के अंतराल पर एक 4X उद्देश्य लेंस का उपयोग सूक्ष्म चित्र ले लो।
  4. सेल प्रवास विश्लेषण।
    1. एनआईएच ImageJ 1.47 वी भागो
    2. सेल के केन्द्रक के अंतिम पदों के लिए प्रारंभिक से दूरी का विश्लेषण करें।
    3. "छवि अनुक्रम" "फाइल" → "आयात" → करने के लिए जाओ और सेल प्रवास के विश्लेषण के लिए नौ छवियों आयात करते हैं। पहली छवि शून्य समय का परिणाम है, और पिछले छवि 120 मिनट का परिणाम है।
    4. → "माप सेट" "विश्लेषण" के लिए जाओ और बॉक्स के बगल में "Centroid" जाँच
    5. "मुक्तहस्त चयन" आइकन पर क्लिक करें।
    6. पहली छवि में चयनित कोशिकाओं की बढ़त को दर्शाती है।
    7. "संपादित करें" के लिए जाओ → "चयन" → "प्रबंधक को जोड़ें"
    8. नौवें छवि के लिए जाने के लिए और पहली छवि पर चयनित एक ही कोशिकाओं की बढ़त को दर्शाती है। सेल पदों आठवें छवियों के लिए दूसरे का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है।
    9. → "प्रबंधक को जोड़ें" "संपादित करें" → "चयन" के लिए जाओ
    10. दोहराएँ 90 से 100 कोशिकाओं से डेटा एकत्र करने के लिए 5.4.5 5.4.9 करने के लिए कदम।
    11. चयनित कोशिकाओं के प्रारंभिक और अंतिम पदों के परिणाम प्राप्त करने के लिए → "उपाय" "विश्लेषण" के लिए जाओ।
      नोट: पलायन की गति प्रति घंटा औसत सेल आंदोलन लंबाई के रूप में परिभाषित किया गया है। directedness (कैथोड को एनोड से) dcEF के वेक्टर और इसकी अंतिम स्थिति के लिए एक सेल का शुरुआती बिंदु से वेक्टर के बीच कोण है जहां कोज्या, के रूप में परिभाषित किया गया है। directedness कैथोड की ओर पलायन कोशिकाओं के लिए एनोड की ओर पलायन कोशिकाओं के लिए -1 और एक है। बेतरतीब ढंग से मील के एक समूह के लिएकोशिकाओं झंझरी, directedness 0. 2 है

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Representative Results

एमडीएफ डिवाइस के निर्माण और विधानसभा

ऐक्रेलिक आधारित एमडीएफ चिप का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। चार एक्रिलिक शीट, एक गिलास को कवर, 13 एक्रिलिक एडेप्टर, और डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा पूरा एमडीएफ चिप (चित्रा 2 डी) के विधानसभा में इस्तेमाल किया गया। एमडीएफ डिवाइस में केवल चार स्वतंत्र संस्कृति चैनल हैं। हालांकि, पर चिप नमक पुल नेटवर्क चिप के आठ खंडों में आठ विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों बनाता है। तीन नमक पुलों, 79, 90 (चित्रा 1 ए की परत 2 में नीले चैनल), और लंबाई में 80 मिमी, छवि अवलोकन के साथ हस्तक्षेप किए बिना एमडीएफ चिप की दूसरी परत करने के लिए मिलकर कर रहे थे। एक 0 है जो नमक पुल नेटवर्क और संस्कृति कक्षों के बीच छोटे-छोटे छिद्रों (नीला घनाभ परतें 3 में चैनलों और चित्रा 1 ए का 4)0.25 मिमी 2 पार अनुभाग क्षेत्र, प्रयोग के दौरान नमक पुल में द्रव प्रवाह कम से कम। एमडीएफ चिप की संस्कृति क्षेत्र के बारे में 74 मिमी 2 प्रत्येक खंड में है। इस प्रदर्शन में, एमडीएफ डिवाइस के सेल संस्कृति कक्षों 70 माइक्रोन मोटी डबल पक्षीय टेप और कवर कांच से बना रहे हैं। हालांकि, (उदाहरण के लिए, एक कोलेजन कोटिंग की आवश्यकता है, कम प्रवाह कतरनी, या संस्कृति कक्ष में बड़े संस्कृति मध्यम मात्रा) electrotaxis अनुसंधान के लिए आवश्यक है अलग सेल संस्कृति शर्तों, संस्कृति substrates और टेप दोनों आसानी से बदला जा सकता है। इसलिए, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं एमडीएफ चिप के भीतर electrotaxis अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एमडीएफ microfluidic प्रणाली का विन्यास

एमडीएफ microfluidic प्रणाली सेटअप चित्रा 3 में सचित्र है। चित्रा 3 बी में दिखाया गया घटकों यू रहे हैंमध्यम प्रवाह और MDF microfluidic प्रणाली में मौजूदा बिजली नेटवर्क स्थापित करने के लिए sed। चित्रा में खोखले उंगली से तंग (लाल और हरा) नट और Luer tapers (ब्राउन) के साथ जुड़े हुए नलियों 3 बी-मैं एमडीएफ प्रवाह नेटवर्क से मध्यम परिवहन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। सीरिंज Luer tapers से जुड़ा है और चार चैनल पंप पर बसे थे, के बाद पाइप लाइन प्रवाह प्रणाली पूरा हो गया था। संस्कृति के माध्यम से और अपशिष्ट पाइप लाइन प्रणाली के माध्यम से ले जाया जाता है। ट्यूब और एक्रिलिक एडाप्टर के बीच संबंध खराब कर दिया है कनेक्टर्स से बांधा जाता है, क्योंकि एमडीएफ मध्यम नेटवर्क PDMS कर सकते हैं प्रणाली की तुलना में अधिक हाइड्रोलिक दबाव को बर्दाश्त कर सकते हैं। कारण एक्रिलिक शीट और ट्यूबों के चरम कम हवा पारगम्यता, मध्यम नेटवर्क और बाहर के वातावरण के बीच कोई संपर्क अवरुद्ध है। इसलिए, प्रणाली में मध्यम का पीएच मान स्थिर बनी हुई है, और कोशिकाओं सीओ 2 इनक्यूबेटर बाहर एमडीएफ microfluidic प्रणाली का उपयोग करते हुए संवर्धित किया जा सकता। एमडीएफ चर्चा के बादआईपी ​​एक मोटर चालित मंच पर स्थापित किया गया है, समय चूक सेल छवियों आठ अलग-अलग वर्गों से लिया जा सकता है। खुले तली microcentrifuge ट्यूब (चित्रा 3 बी II) agarose की मात्रा क्षमता बढ़ाने के लिए पारदर्शी ट्यूबलर उंगली से तंग पागल पर (चित्रा 3 बी-चतुर्थ) बढ़ रहे हैं। इस रास्ते में, अपेक्षाकृत बड़े इलेक्ट्रोड समय की लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं को स्थिर बिजली की उत्तेजना प्रदान करने के लिए agarose में डाला जा सकता है।

एमडीएफ चिप में संकेत प्रत्यक्ष वर्तमान बिजली के क्षेत्र की पीढ़ी

प्रत्येक कक्ष का वोल्टेज बिजली के सर्किट से जुड़े चिप में प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड के माध्यम से मापा जा सकता है। हालांकि, हम कक्ष में वोल्टेज उपाय नहीं था। बल्कि, हम नमक पुल नेटवर्क और चिप के सेल संस्कृति कक्षों में बिजली के क्षेत्र में नकली। चार electrotactic कक्षों चुनाव क्रमानुसार थेबिजली के सर्किट में nected। इस तरह, एक ही विद्युत प्रवाह इन कक्षों में से प्रत्येक में बनाए रखा है। ओम कानून के अनुसार, EFS microfluidic युक्ति में कक्षों के पार अनुभाग के क्षेत्र के साथ संबद्ध है। इसके अतिरिक्त, सभी PMMA शीट और टेप सीओ 2 लेजर खुरचने का औजर द्वारा गढ़े गए थे। चिप विधानसभा टुकड़े के संरेखण सटीक है और चिप के संरचनात्मक दोषों कम कर रहे हैं। इस प्रकार, प्रत्येक कक्ष में EFS स्थिर रहना चाहिए। बिजली के क्षेत्र सिमुलेशन परिणाम पहले हिस्सों में 300 और 0 एम वी / मिमी के साथ EFS के एक सजातीय वितरण और डिवाइस में संस्कृति कक्षों के शेष हिस्सों दिखाने (डेटा) नहीं दिखाया। इससे पहले, हमारी प्रयोगशाला, हुआंग एट अल से खबर दी है। और साई एट अल।,। मापा और नकली EFS के मूल्यों में अंतर कम से कम 4% थी दिखा दिया है कि 4,15 यह परिणाम हमारे सिस्टम में मापा जाता है, बिजली के क्षेत्र में नकली मूल्य के साथ अच्छी तरह से मेल खाती है, पता चलता है कि। इस w मेंork, हम एक लंबा प्रयोग के लिए स्थिर विद्युत धारा प्रदान करने के लिए बड़े एजी / AgCl इलेक्ट्रोड डाला। एमडीएफ चिप पर लागू वर्तमान electrotaxis प्रयोगों में एफई उत्तेजना का केवल 1.85 ± 0.19% के बाद 7 घंटा की कमी हुई। इसके अलावा, बिजली की उत्तेजना की सबसे लंबी अवधि हमारे अध्ययन में 4 घंटा था। इस प्रकार, हम इनपुट विद्युत प्रवाह electrotaxis परीक्षण के दौरान स्थिर बनी हुई है विश्वास है, और MDF चिप के electrotactic कक्षों में बिजली के क्षेत्र में क्रमानुसार जुड़ा ammeter द्वारा निगरानी कर रहे हैं।

एमडीएफ microfluidic प्रणाली का उपयोग करते हुए फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की electrotaxis की जांच

रो-जुड़े कुंडलित-तार काइनेज (रॉक) की electrotactic विनियमन चीनी हैम्स्टर अंडाशय (चो), 20 एन्दोथेलिअल, 21 और neuronal कोशिकाओं 22 में प्रदर्शित किया गया है, लेकिन अभी तक फेफड़ों के कैंसर ग के लिए जांच नहीं की गईएल। इसलिए, रॉक अवरोध, Y27632, फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की electrotaxis पर उसके प्रभाव का अध्ययन करने के एमडीएफ microfluidic प्रणाली को लागू किया गया था। चित्रा 4 में दिखाया गया है, Y27632 के उपचार के साथ या बिजली की उत्तेजना के बिना सेल प्रवास गति फेरबदल में कोई प्रभाव नहीं दिखाया। हालांकि, dcEF के तहत कैंसर की कोशिकाओं को Y27632 के आवेदन (300 एम वी / मिमी) काफी उनके anodic पलायन कम कर दिया। 50 माइक्रोन एकाग्रता में रॉक अवरोध करनेवाला फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं के anodic आंदोलन का सफाया कर दिया है लेकिन उनके प्रवास गति को प्रभावित नहीं किया। इसके अलावा, एप्लाइड रसायन सांद्रता और directedness सूचकांक (चित्रा 4 बी) के बीच एक खुराक पर निर्भर संबंध था। इन परिणामों के एमडीएफ microfluidic प्रणाली electrotaxis के अध्ययन के लिए विश्वसनीय और कुशल है कि सुझाव।

आकृति 1
चित्रा 1. देसएमडीएफ चिप के आईजीएन। (ए) एमडीएफ चिप के योजनाबद्ध ड्राइंग। एमडीएफ डिवाइस एक्रिलिक शीट के चार परतों (72 × 50 मिमी), 13 एक्रिलिक एडाप्टर (10 × 10 × 6 मिमी), डबल पक्षीय टेप, और एक गिलास को कवर (24 × 60 मिमी) के होते हैं। परत 2 एक्रिलिक शीट की मोटाई 2 मिमी है और अन्य तीन परतों प्रत्येक 1 मिमी हैं। कम तीन एक्रिलिक परतों में, नमक पुल और मध्यम प्रवाह नेटवर्क क्रमशः, नीले और लाल ब्लॉक द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। पहले एक्रिलिक पत्र परत में, हरे एक्रिलिक एडेप्टर agarose के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया। ब्लू एक्रिलिक एडेप्टर एजी / AgCl इलेक्ट्रोड के लिए कनेक्शन के रूप में इस्तेमाल किया गया। एमडीएफ चिप में चार सेल संस्कृति कक्षों रहे हैं। क्षेत्र और प्रत्येक कोशिका संस्कृति कक्ष की ऊंचाई क्रमश: 148 मिमी 2 (3 × 46 मिमी) और 0.07 मिमी हैं। परतें 3 और 4 पर छोटे नीले चैनलों संस्कृति कक्षों के लिए नमक पुल नेटवर्क से कनेक्ट। इन कनेक्शन चैनलों के पार अनुभाग 0.25 मिमी है एट अल।, 8 कॉपीराइट 2014, अमेरिकी भौतिकी संस्थान)। एमडीएफ विधानसभा डिवाइस के सभी घटकों का (बी) के फोटोग्राफ, PMMA शीट, एक्रिलिक एडेप्टर, डबल पक्षीय टेप, और गिलास को कवर शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. एमडीएफ चिप निर्माण और विधानसभा प्रक्रियाओं। (ए) एक्रिलिक शीट और डबल पक्षीय टेप के पैटर्न सीओ 2 लेजर मशीनिंग द्वारा मानते थे। (बी) के अलग-अलग एक्रिलिक पत्र परतों डिजाइन ड्राइंग के अनुसार सीओ 2 लेजर द्वारा गढ़े गए थे। (सी) साफ एक्रिलिक पत्रएक साथ एक थर्मल bonder का उपयोग कर बंधुआ थे। (डी) पूरे किए एमडीएफ चिप विधानसभा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा electrotaxis अध्ययन के लिए 3. सिस्टम। Electrotaxis प्रयोग के लिए इस प्रणाली की (ए) योजनाबद्ध आरेख। एमडीएफ चिप से जुड़ा नलियों मध्यम अर्क और अपशिष्ट तपका के लिए इस्तेमाल किया गया। चिप में dcEF एजी / AgCl इलेक्ट्रोड और बिजली की आपूर्ति के माध्यम से आयोजित किया गया था। डिवाइस सेटअप एक माइक्रोस्कोप के xyz मोटर मंच पर स्थापित किया गया था। चिप में सेल छवियों को एक वाणिज्यिक डिजिटल एसएलआर कैमरा द्वारा उठाए गए थे। (बी) एमडीएफ microfluidic प्रणाली में मध्यम प्रवाह नेटवर्क के घटकों और dcEF पीढ़ी की तस्वीर, incluडिंग (मैं) ट्यूब कनेक्टर, (द्वितीय) खुला तली microcentrifuge ट्यूब (iii) सफेद ठोस उंगली से तंग अखरोट, (iv) पारदर्शी ट्यूबलर उंगली से तंग अखरोट, और (v) एजी / AgCl इलेक्ट्रोड। के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा (ए) के EFS के तहत फेफड़ों के कैंसर के सेल प्रवास पर Y27632 4. प्रभाव शून्य और (बी) 300 एम वी / मिमी। DcEF उत्तेजना Y27632 का संकेत एकाग्रता के साथ एक 1 घंटा पूर्व उपचार के बाद लागू किया गया था। बिजली की उत्तेजना के 2 घंटे के लिए चली। directedness और सेल प्रवास की गति के मात्रात्मक विश्लेषण एक प्रतिनिधि प्रयोग consititute। 90-100 कोशिकाओं डेटा विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया। * <0,001 पी के लिए। डेटा की मानक त्रुटि ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैंमतलब (SEM)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम मुश्किल होने एमडीएफ चिप की परत 1 पर एक्रिलिक एडेप्टर पालन करने की प्रक्रिया में पाया गया। सुपर गोंद का सिर्फ 1 से 2 μl के आवेदन मजबूती से एमडीएफ चिप पर एडाप्टर पालन करने के लिए पर्याप्त है। गोंद की बड़ी मात्रा में सुपर गोंद और पालन करने के लिए विफलता की एक अधूरी बहुलकीकरण में हुई। एक्रिलिक एडेप्टर मजबूती से एमडीएफ चिप पर पालन कर रहे थे एक बार, microfluidic प्रणाली में तरल रिसाव शायद ही कभी हुआ। इसके अलावा, निर्वात चैम्बर के अंदर हे / एन ऊष्मायन दो तरफा टेप / कवर गिलास या दो तरफा टेप / एक्रिलिक पत्र इंटरफेस के बीच फंस हवा निकालने में मदद की। नतीजतन, इस प्रक्रिया एमडीएफ चिप में संस्कृति कक्ष की स्थिरता को बढ़ाता है।

नमक पुल नेटवर्क की तैयारी के दौरान 3% agarose के तापमान को नियंत्रित महत्वपूर्ण है। Agarose के तापमान इंजेक्शन के दौरान पर्याप्त नहीं है, तो agarose जल्दी से सिरिंज के अंदर जमना और नहीं कर सकते हैं करेंगेनमक पुल नेटवर्क में इंजेक्ट किया। इसके अलावा, agarose इंजेक्शन के दौरान, यह नमक पुल नेटवर्क में किसी भी बुलबुला गठन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। बुलबुले की उपस्थिति बहुत नेटवर्क के बिजली के प्रतिरोध बढ़ जाती है और प्रयोगात्मक विफलता की ओर जाता है। Agarose इंजेक्शन के दौरान solidifies एक बार इसके अलावा, यह पूरी तरह से नमक पुल चैनल में तरल प्रवाह को ब्लॉक नहीं कर सकते। जैसे, रसायन तो आसानी से अन्य चैनलों में लीक कर सकते हैं। सबसे अच्छा तरीका नेटवर्क में गर्म agarose इंजेक्षन करने के लिए और फिर agarose नमक पुल चैनलों के अंदर जमना करने की अनुमति है।

सेल इंजेक्शन electrotaxis प्रयोग में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। संस्कृति कक्ष में सेल बोने के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करने के लिए, हम कोशिकाओं के अतिरिक्त संख्या इंजेक्शन। इस दृष्टिकोण में, कोशिकाओं के आउटलेट से इंजेक्शन थे। इंजेक्शन की गति संस्कृति कक्ष में एक असमान सेल वितरण से बचने के लिए भी धीमी है और होना चाहिए। इसके अलावा, क्योंकिएमडीएफ चिप में अलग कर रहे हैं चैनल, इंजेक्शन एक समय में एक चैनल से किया जाना चाहिए। इस प्रकार, पूरा सेल इंजेक्शन प्रक्रिया में समय लेने वाली है। भविष्य में, यह एक अतिरिक्त सेल इंजेक्शन चैनल बनाने के लिए जरूरी होगा कि सब कर सकते हैं चार संस्कृति कक्षों में एक साथ प्रत्यारोपण कोशिकाओं। इस नई प्रक्रिया नमूना मात्रा, इंजेक्शन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या, और आपरेशन के समय कम हो जाएगा।

Microfluidic युक्ति fabricating के लिए सामग्री के रूप में PDMS बजाय एक्रिलिक का प्रयोग करने में कई फायदे हैं। एक ऐक्रेलिक आधारित डिवाइस एक मशीन के बिना एक हीटर पर सीधे संचालित किया जा सकता है। सिस्टम कोई सीओ 2 की आपूर्ति की आवश्यकता है, कोशिकाओं को हीटर के साथ एक नियमित औंधा माइक्रोस्कोप पर एक ऐक्रेलिक आधारित जैव microfluidic चिप में उगाया जा सकता है। यह एक मशीन के बाहर चिप में सेल छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए आसान है। हम प्रणाली में सेल छवियों रिकॉर्ड करने के लिए एक व्यापक रूप से उपलब्ध वाणिज्यिक डिजिटल एसएलआर कैमरे का इस्तेमाल किया। इसके अलावा, नरमकैमरे के प्रोग्राम नियंत्रण के लिए आवश्यक बर्तन भी आसानी से उपलब्ध है। यह कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग आसानी से प्रोग्राम बनाता है। इसलिए, जैव microfluidic ऑटो रिकॉर्डिंग छवि प्रणाली के निर्माण की लागत एक वाणिज्यिक प्रणाली की तुलना में काफी कम है। एक PDMS आधारित चिप का उपयोग करते समय इसके विपरीत, प्रणाली एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में संचालित किया जाना चाहिए। इस प्रकार, अतिरिक्त छवि रिकॉर्डिंग उपकरण इनक्यूबेटर में ऑपरेशन के लिए खरीदा जाना चाहिए। इस तरह के उपकरणों अपेक्षाकृत भारी, महंगा है, और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में सीमित स्थान के एक बड़े हिस्से में रह रहे हैं। एक और पहलू में, PDMS चिप निर्माण की प्रक्रिया की तुलना में, uidic चिप FL एक्रिलिक माइक्रो के आसान और तेजी से निर्माण डिवाइस प्रोटोटाइप और उत्पादन दोनों के लिए उपयुक्त है। के रूप में था इसके अलावा, PDMS आधारित डिवाइस के साथ तुलना में, एक्रिलिक आधारित microfluidic चिप, संरचनात्मक रूप से और अधिक स्थिर और एक जटिल तीन आयामी microfluidic नेटवर्क प्रणाली के निर्माण के लिए अधिक उपयुक्त हैइस अध्ययन में एमडीएफ चिप के साथ प्रदर्शन किया। एमडीएफ चिप में पर चिप नमक पुल नेटवर्क को आसानी से एक PDMS आधारित डिवाइस में उत्पादन नहीं किया जा सकता है। इस नेटवर्क सिस्टम microfluidic चिप का कुल आकार को कम करता है और electrotaxis अनुसंधान आसान और तेज बनाता है।

एमडीएफ चिप के अंदर है, हम प्रत्येक पृथक चैनल में केवल दो बिजली क्षेत्र ताकत (EFS, 0 और 300 एम वी / मिमी) उत्पन्न। हालांकि, हुआंग द्वारा रिपोर्ट के रूप एमडीएफ चिप और बहु क्षेत्र electrotactic चिप, एट अल।, 4 हिस्सेदारी सेल संस्कृति क्षेत्र में इसी तरह के एक चैनल डिजाइन। एमडीएफ चिप में संस्कृति कक्ष के आकार में फेरबदल करके, कई EFSs भी एमडीएफ चिप पर उत्पन्न किया जा सकता है। इन संशोधनों के साथ, कई EFSs और कई रसायनों का ही परीक्षण में इस्तेमाल किया जा सकता है। तदनुसार, एक उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रणाली उपकरण का उपयोग कर electrotaxis जांच करने के लिए बनाया जा सकता है।

सिर्फ एक प्रयोग में, एमडीएफ चिप के प्रभाव का परीक्षण करने में सक्षम हैअलग dcEF के तहत कोशिकाओं पर रसायन, या कोशिकाओं के विभिन्न प्रकारों पर बिजली की उत्तेजना का प्रभाव। यह भी काफी डिवाइस के आकार में वृद्धि के बिना एमडीएफ चिप में 20 अलग-थलग समानांतर चैनलों को लागू करने के लिए संभव हो सकता है। 8 एक प्रयोग में, इस काम में प्रदर्शन के रूप में, हम सेल प्रवास के directedness और के बीच एक महत्वपूर्ण खुराक पर निर्भर सहसंबंध प्राप्त Y27632 (चित्रा 4)। चार चैनलों के साथ MDF चिप स्पष्ट रूप से कैंसर की कोशिकाओं में electrotaxis के अध्ययन के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM medium Gibco,Invitrogen, USA 12800-017
Fetal Bovine Serum Gibco,Invitrogen, USA 16000-044
Trypsin Gibco,Invitrogen, USA 25200-072
PBS Basic Life BL2651
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical Co 10005583
agarose LONZO, USA SeaKem LE AGAROSE
syringe Terumo 3 ml with Luer taper
3-way stopcock Nipro with Luer taper
PMMA (acrylic) HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan thickness 1mm, 2mm
acrylic adaptor KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan 1/4-28 port, 10x10x6 mm customized
nut Thermo Fisher Scientific Inc. UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Microscope cover glass Deckgläser, Germany 24x60 mm
double-sided tape 3M PET 8018
super glue 3M Scotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 detergent Franklab, France TFD4
ultrasonic steri cleaner LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonder KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan customized
CO2 laser scriber LTT group, Taiwan ISL-II
proportional-integral-derivative (PID) controller JETEC Electronics Co., Japen TTM-J40-R-AB,
K-type thermocouple TECPEL TPK-02A
4-channel syringe pump KdScientific, USA 250P
DC power supply GWInstek, Taiwan
X-Y-Z motor stage TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan customized
inverted microscope Olympus, Japan CKX41
digital SLR camera Canon, Japan 60D

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References

  1. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  2. Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
  3. Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
  4. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  5. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
  6. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
  7. Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
  8. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
  9. Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
  10. Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
  11. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
  12. Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
  13. Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
  14. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  15. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
  16. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
  17. Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
  19. Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
  20. Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
  21. Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
  22. Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 106 एक्रिलिक microfluidic electrotaxis फेफड़ों adenocarcinoma समवर्ती रासायनिक / विद्युत प्रभाव polymethylmethacrylate PMMA
एक multichannel दोहरे बिजली क्षेत्र microfluidic चिप का उपयोग कर लंग कैंसर कोशिकाओं के Electrotaxis अध्ययन
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Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (106), e53340, doi:10.3791/53340 (2015).

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