Abstract
Le comportement de la migration cellulaire directionnelle sous un champ électrique à courant continu (dCEF) est désigné comme électrotaxie. Le rôle physiologique important de dCEF à guider le mouvement des cellules pendant le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et la cicatrisation des plaies a été démontré dans de nombreuses études. En appliquant puces microfluidiques à un essai de électrotaxie, le processus d'enquête est raccourcie et les erreurs expérimentales sont minimisés. Ces dernières années, des dispositifs microfluidiques fabriqués avec des matériaux polymères (par exemple, le polyméthacrylate de méthyle, PMMA, acrylique ou) ou du polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été largement utilisés dans l'étude des réponses des cellules à une stimulation électrique. Toutefois, contrairement aux nombreuses étapes nécessaires pour fabriquer un dispositif de PDMS, la construction simple et rapide des micro acryliques fl uidique puce rend approprié à la fois pour le prototypage et la production de l'appareil. Pourtant, aucun des appareils déclarés de faciliter l'étude efficace de la chimique et dcE simultanéeF effets sur les cellules. Dans ce rapport, nous décrivons notre conception et la fabrication d'un double champ électrique multicanaux à base d'acrylique (MDF) à puce pour étudier l'effet simultané de produits chimiques et la stimulation électrique sur des cellules de cancer du poumon. La puce MDF fournit huit combinaisons de stimulations électriques / chimiques dans un seul test. La puce non seulement raccourcit considérablement le temps nécessaire expérimentale, mais augmente également la précision dans électrotaxie études.
Introduction
Le comportement des cellules adhérentes qui se déplacent en direction d'une anode ou de la cathode sous un champ électrique de courant continu (dCEF) est appelée électrotaxie. Le comportement electrotactic de cellules joue un rôle important dans l'embryogenèse, la régénération des nerfs, et la cicatrisation des plaies. 1 Des cellules tumorales telles que des cellules cancéreuses de la prostate de rat, des cellules cancéreuses deux mammaires, 3 et pulmonaires cellules d'adénocarcinome 4-8 ont montré mouvement electrotactic sous une dCEF appliqué . L'EF physiologique a été mesurée dans les tissus de la glande. 9,10 électrotaxie a également été signalé dans les cellules tumorales des glandes associées. 2,3 Pris ensemble, les électrotaxie de cellules cancéreuses est considéré comme un facteur de métastases. 11 Contrôle de la direction électrique les cellules cancéreuses sous dCEF peuvent être une approche potentielle pour le traitement futur du cancer. Cependant, aujourd'hui, le mécanisme moléculaire détaillé de électrotaxie reste controversée. Par conséquent, une enquête de l'influence de la stimulation électrique sur la migration des cellules cancéreuses peut faciliter le développement de stratégies pour le traitement du cancer.
Récemment, des dispositifs bio-microfluidique ont été fabriqués pour l'étude des réponses cellulaires à couler force de cisaillement, 12 gradients chimiques, 13 et électrique 4 stimuli in vitro. La fabrication de dispositifs de bio-microfluidique utilisant (PDMS) ou polyméthacrylate de méthyle (PMMA, aussi connu comme l'acrylique) a réussi à réduire le taux de ces expériences d'échec. En outre, en utilisant des dispositifs microfluidiques à base d'acrylique comme un prototype pour enquêter sur des sujets biologiques est plus simple que d'utiliser des copeaux de PDMS. Diverses fonctions dans les dispositifs à base d'acrylique ont été développés pour électrotaxie étude. Cependant, aucune des conceptions antérieures sont capables de tester simultanément les effets de diverses conditions chimiques et le champ électrique sur-cellules pour électrotaxie étude. Ainsi, nous avons développé un dispositif microfluidique mu-leltichannel double champ électrique (MDF) quatre canaux culturels indépendants et huit conditions expérimentales différentes dans une puce contenant puce.
La puce de MDF à base d'acrylique, d'abord rapporté par Hou et al., 8 intègre une stimulation électrique et plusieurs canaux isolés chimiquement. Ces canaux isolés chimiquement peuvent être utilisés pour la culture de différents types de cellules dans une expérience. Le dCEF dans les canaux est produite par une source d'alimentation électrique. Deux champs électriques indépendantes, l'une avec une force appliquée de champ électrique (EFS) et l'autre avec 0 EFS, sont menées dans chaque canal chimiquement isolé. De cette manière, la puce fournit EF coexistante mieux contrôlée et la stimulation chimique. En outre, les résultats de la simulation numérique de la diffusion de produits chimiques à l'intérieur de la puce MDF indiquent qu'aucune contamination croisée entre les canaux est survenue après une période expérimentale de 24 heures. 8
Par rapport à la DeviCE rapporté par Li et al., 14 la puce MDF fournit une zone de grande culture, qui permet une plus grande analyse biochimique des cellules stimulées électriquement. En outre, avec une plus grande zone d'observation de la puce MDF, plusieurs cellules peuvent être observées dans le test, si l'analyse de la vitesse de migration ou directedness des cellules stimulées électriquement est plus précis. Les monocanal puce conceptions d'études antérieures rapportés par Huang et al. 4 et Tsai et al. 15 ne permettent qu'un seul type de cellule ou chimique à tester. Cependant, la puce de MDF peut être utilisé pour étudier les effets de différents produits chimiques sur la électrotaxie, ainsi que les effets de la stimulation électrique sur différents types de cellules. En d'autres termes, la puce MDF permet l'étude efficace de dépendances de doses chimiques.
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Protocol
1. Conception et fabrication de la puce MDF
- Dessiner un motif de couche acrylique individuelle en utilisant des logiciels commerciaux, tels que AutoCAD, et sauvegarder le motif.
- Revoir la conception du motif de feuille d'acrylique à quatre couches de la figure 1A et confirmer les connexions inter-couches.
- Fabriquer toutes les feuilles d'acrylique et de l'adhésif double-face par ablation laser en utilisant un Traceur laser CO 2 (figures 1B, 2A et 2B). 16
- Allumez le Traceur laser et raccorder l'appareil à l'ordinateur portable contrôle.
- Exécutez le logiciel commercial et ouvrir le modèle conçu à l'étape 1.1 en cliquant sur "fichier de signatures conçu."
- Placez un morceau de feuille d'acrylique blanc ou ruban adhésif double face sur la scène XYZ du Traceur laser.
- Réglez la focalisation du faisceau laser sur la surface de la feuille acrylique ou un adhésif double face avec une auto-alignmenT Stick fourni par le fabricant du Traceur laser.
- Envoyer le modèle conçu pour le Traceur laser pour l'usinage direct de la feuille acrylique ou un adhésif double face.
- Retirez le papier protecteur des plaques acryliques en utilisant une pince et souffler la surface avec de l'azote gazeux.
- Empiler les feuilles acryliques et les lier ensemble sous une pression de 2 kg / cm 2 dans un dispositif de liaison thermique pendant 45 minutes à 110 ° C pour former l'ensemble de canal d'écoulement stimulation / électrique.
- Préparer la lamelle de microscope en tant que substrat de culture de cellules dans la puce.
- Mettez le couvercle en verre dans un bocal de coloration et de remplir le pot avec une dilution de dix fois du détergent répertorié dans la liste des matériaux.
- Mettez le couvercle en verre et le bocal de coloration dans un Steri-nettoyeur ultrasonique et nettoyer le cache de verre pour 15 min.
- Verser le détergent dilué dans le pot de coloration, remplir le pot avec de l'eau distillée, et répétez l'étape 1.5.2 ou 3 fois.
- Sécher le couvercle en verre nettoyé en soufflant avec de l'azote gazeux avant d'adhérer à l'adhésif double face.
- Adhérer le couvercle en verre nettoyé à l'écoulement ensemble de canal de stimulation / électrique avec le ruban adhésif double face à motifs à l'étape 1.2.
- Adhérer 13 morceaux de adaptateurs acryliques aux ouvertures individuelles dans la couche 1 de l'assemblage de puce MDF avec la super glue. L'ensemble de puce MDF est alors terminée (figure 2D).
- Stériliser l'assemblage complet de la puce MDF avec 30 min d'irradiation UV avant de l'utiliser.
2. configuration du pont réseau Sel de la Chip MDF
- Avant utilisation, stériliser tous les tubes en plastique, noix de doigts serrés, et microtubes présentés dans la figure 3B en fixant un temps de maintien de 15 min à 121 ° C dans l'autoclave.
- Connecter les tubes en plastique fluoré (figure 3B-i) à l'Assemblée de la puce MDF par l'entrée moyenet des adaptateurs de sortie présentés dans la figure 1A.
- Branchez le cône Luer de l'entrée de fluide et la sortie des tubes en plastique dans la figure 3B-i à 3 voies robinets.
- Prendre 2,5 ml de CO 2 -equilibrated saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une seringue de 3 ml et relier la seringue au robinet d'arrêt à 3 voies d'entrée du tube en matière plastique. Connectez un vide 3 ml seringue au robinet à 3 voies du tube de sortie en plastique. Les deux seringues sont ainsi interconnectés via la puce MDF.
REMARQUE: Incuber le PBS dans le 37 ° C 5% CO 2 incubateur de culture cellulaire O / N CO 2 pour obtenir -equilibrated PBS. - Sceller les ouvertures du bleu et les adaptateurs verts (figure 1A) sur la feuille de PMMA couche 1 avec des noix blanches des doigts étanche solides (figure 3B-iii).
- Remplissez les canaux de pont de sel et chambres de culture avec le CO 2 -equilibrated PBS dans la seringue décrit dans étape de configuration 2.4. Éviterla formation de bulles.
- Ensuite, mettre le CO 2 -equilibrated PBS contenant puce MDF dans le 37 ° C 5% -CO 2 culture cellulaire incubateur pour O / N incubation. Cela permet à l'air dissous dans l'adhésif double face pour former des bulles dans les chambres.
- Évacuer les bulles dans les canaux par un écoulement rapide PBS dans le canal à l'aide des deux seringues. Pomper le PBS avant et en arrière si nécessaire.
- Égoutter le PBS dans les canaux par l'intermédiaire du robinet à 3 voies reliée à la tubulure de sortie moyenne.
- Grâce à un nouveau 3-ml seringue, prendre 2,5 ml de CO 2 -equilibrated milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (voir l'étape 3.5), et de remplacer la seringue reliée à l'entrée par la nouvelle. Remplir les canaux avec le milieu.
- Préparation du réseau de pont de sel.
- Retirer temporairement les écrous solides (figure 3B-iii) sur les cartes vertes (figure 1A) et injecter 3% à chaud (> 70 ° C) agarose dans le bri de seldge canal à travers l'ouverture dans le vert des adaptateurs (figure 1A).
REMARQUE: Préparation d'agarose chaude: Dissoudre 1,5 g de poudre d'agarose dans 50 ml de PBS. Stériliser par la fixation d'un temps de maintien de 20 min à 121 ° C dans l'autoclave. - Arrêter l'injection de l'agarose lorsque le liquide remplit les trois quarts de la longueur du canal de pont salin.
- Sceller les pores sur les adaptateurs verts (figure 1A) en vissant les écrous solides (figure 3B-iii) après l'injection agarose.
- Remplacer les écrous solides sur les adaptateurs bleus (figure 1A) avec les écrous tubulaires translucides des doigts étanche (figure 3B).
- Chargez le 3% préchauffé agarose dans les écrous tubulaires (figure 3B-IV).
- Incluez les électrodes Ag / AgCl (figure 3B-V) dans les écrous tubulaires (figure 3B-iv) devant lasolidification de l'agarose.
- Retirer temporairement les écrous solides (figure 3B-iii) sur les cartes vertes (figure 1A) et injecter 3% à chaud (> 70 ° C) agarose dans le bri de seldge canal à travers l'ouverture dans le vert des adaptateurs (figure 1A).
- Après avoir terminé la mise en place du réseau de pont de sel, injecter les cellules de cancer du poumon CL1-5 dans les chambres de culture, une chambre à la fois.
3. Préparation des cellules cancéreuses et configuré pour Electrotactic Expérience
- La culture régulière de la lignée cellulaire de cancer du poumon CL1-5.
- Culture des cellules cancéreuses pulmonaires, CL1-5 obtenus à partir Prof. Pan-Chyr Yang, 17 dans le milieu complet dans un flacon de culture de cellules à 37 75T ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Le milieu complet est composé de DMEM et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Sous-culture les cellules tous les 3 à 4 jours. Les cellules utilisées pour réaliser des expériences de électrotaxie sont inférieures à 25 passages à partir de la source d'origine.
- Ajouter 2 ml de tampon de trypsine à 0,25% pour les cellules en croissance exponentielle CL1-5 et incuber pendant 2 min dans le 37 ° C 5% CO 2 incubateur pour culture cellulaire de cellules detachment.
- Terminer le processus de détachement avec 6 ml de 10% de FBS DMEM et centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite éliminer le milieu et suspendre le culot de cellules avec 5 ml de PBS.
- Comptez le nombre de cellules dans le PBS. Ensuite, prendre 1 x 10 6 cellules et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
- Rejeter le PBS. Suspendre les cellules avec préchauffé CO 2 -equilibrated DMEM et ajuster la densité de cellules à 1 x 10 être 6 cellules / ml.
REMARQUE: Incuber le milieu complet dans le 37 ° C 5% -CO 2 cellule incubateur de culture O / N pour obtenir le CO 2 -equilibrated DMEM.
4. Mettre en place pour Electrotactic Expérience
- De la sortie de la puce MDF, injecter 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, les cellules dans de la puce.
- Incuber la puce MDF cellule tête de série dans l'incubateur de culture cellulaire (fixé à 37 ° C et 5% de CO 2) pour 2-4 heures.
- Configuration de MDF microsystème fluidique.
- Installez le système microfluidique MDF sur un transparent Indium Tin verre d'oxyde (ITO) chauffe. Mesurer la température de la puce MDF avec un thermocouple de type K coupé entre la puce MDF et le verre ITO. Contrôler le chauffage ITO avec un contrôleur proportionnel intégral-dérivé (PID). Réglez la microfluidique température d'incubation du système MDF à 37 ° C avec le régulateur PID.
NOTE: La fabrication du chauffe-ITO et l'installation du système de chauffage de la cellule de la culture sont décrits dans les rapports précédents 18,19. - Montez la puce de MDF ensemble à température contrôlée sur le XYZ platine motorisée contrôlée par ordinateur sur un microscope inversé. L'utilisation de la platine motorisée est décrite dans l'étape 5.1. Pomper le milieu complet dans des chambres de culture à travers les entrées avec une pompe à seringue à quatre canaux.
- Installez le système microfluidique MDF sur un transparent Indium Tin verre d'oxyde (ITO) chauffe. Mesurer la température de la puce MDF avec un thermocouple de type K coupé entre la puce MDF et le verre ITO. Contrôler le chauffage ITO avec un contrôleur proportionnel intégral-dérivé (PID). Réglez la microfluidique température d'incubation du système MDF à 37 ° C avec le régulateur PID.
- Pomper le milieu complet dans la puce MDF à un taux de 20 ul / h débit. Les déchets de la culture du savoirlets est recueilli dans les microtubes (représentés comme des «déchets» dans la figure 3A).
- Incuber les cellules pour un autre 16-18 heures à 37 ° C dans la puce de MDF.
- Pour remplacer le milieu, le milieu contenant de la pompe 50, 25, 5 et 0 inhibiteur de la kinase uM, respectivement, dans chaque chambre de culture à un débit de 20 ul / min pendant 10 min.
NOTE: Préparer une solution mère 10 mM de l'inhibiteur de la protéine kinase Y27632 Rho-associé en ajoutant 3 ml d'eau stérile pour l'inhibiteur de kinase de 10,6 mg. Diluer la solution mère de 10 mM à 50, 25 et 5 pm, respectivement, en utilisant 10% de milieu FBS DMEM. - Incuber les cellules dans l'inhibiteur de kinase pendant encore 60 minutes à 37 ° C. Réglez le débit moyen de 20 ul / h. Utilisez la même température de la culture et le taux décrit ci-dessus dans les étapes ultérieures couler.
- Utilisez des fils électriques pour connecter une alimentation en courant continu à la puce MDF via les électrodes Ag / AgCl sur la puce.
- Série connecter un ampèremètre in le circuit électrique. Utilisez l'ampèremètre pour contrôler le courant électrique dans la puce MDF.
- Allumez l'alimentation DC et réglez l'ampèremètre actuelle à 86,94 uA en ajustant la tension d'alimentation comprise entre 15 et 19 V.
NOTE: Compte tenu de la loi d'Ohm, E = I / (aA eff), où I est le courant électrique circulant à travers la matière en vrac, à savoir, le milieu de culture dans la chambre electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) est le conductivité du milieu de culture, A eff (= 0,21 mm 2 pour une largeur de 3 mm x 0,07 mm de hauteur) est la surface en coupe transversale effective de la chambre electrotactic, et le courant électrique (I) nécessaire pour générer un 300 mV / mm EF dans la puce MDF est de 86,94 uA.
5. Acquisition et analyse de la cellule Images
- Contrôler la platine motorisée à l'aide d'un programme MATLAB GUI. Avec le système microfluidique MDF monté sur le microscoPE, déplacer la puce pour les régions d'observation en utilisant le platine motorisée.
- Images de cellules d'enregistrement à l'aide d'un appareil photo reflex mono-objectif numérique (SLR) montés sur le microscope.
- Prenez des images microscopiques en utilisant un objectif 4X à des intervalles de 15 minutes pendant 2 heures.
- Analyse de la migration cellulaire.
- Exécutez NIH ImageJ 1,47 V.
- Analyser la distance de la première à la position finale de la centroïde de la cellule.
- Allez dans "Fichier" → → "Importer" "séquence d'images", et importer neuf images pour l'analyse de la migration cellulaire. La première image est le résultat du temps zéro, et la dernière image est le résultat de 120 min.
- Allez sur "Analyser" → "Définir mesures" et cochez la case à côté de "Centre de gravité"
- Cliquez sur l'icône «main levée de sélections».
- Représenter le bord des cellules sélectionnées dans la première image.
- Allez sur "Edit" → "Sélection" → "Ajouter au Manager"
- Aller à la neuvième image et de représenter le bord des mêmes cellules sélectionnées sur la première image. Les positions de cellule peuvent être tracées en utilisant la deuxième à huitième images.
- Allez sur "Edit" → "Sélection" → "Ajouter au Manager"
- Répétez les étapes 5.4.5 à 5.4.9 de recueillir des données à partir de 90 à 100 cellules.
- Allez sur "Analyser" → "Measure" pour obtenir le résultat des positions initiales et finales des cellules sélectionnées.
NOTE: La vitesse de migration est définie comme la durée moyenne de mouvement des cellules par heure. Le directedness est défini comme cosinus, où est l'angle entre le vecteur de la dCEF (de l'anode à la cathode) et le vecteur de point de départ d'une cellule dans sa position finale. Le directedness est -1 pour les cellules qui migrent vers l'anode et une pour les cellules qui migrent vers la cathode. Pour un groupe de manière aléatoire miréseau de cellules, le directedness est 0. 2
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Representative Results
Fabrication et l'assemblage de l'appareil MDF
Un diagramme schématique de la puce de MDF à base d'acrylique est représenté sur la Figure 1A. Quatre feuilles d'acrylique, d'un couvercle en verre, 13 adaptateurs acryliques, et un morceau de ruban adhésif double-face ont été utilisés dans l'assemblage de la puce MDF complété (figure 2D). Il ya seulement quatre canaux indépendants de la culture dans le dispositif MDF. Cependant, le réseau de pont de sel sur puce crée huit conditions expérimentales différentes dans les huit segments de la puce. Trois ponts de sel (les canaux bleu dans la couche 2 de la figure 1A), 79, 90, et 80 mm de longueur, ont été couplés à la seconde couche de la puce MDF sans interférer avec l'observation de l'image. Les petits pores (canaux cuboïde bleu en couches 3 et 4 de la figure 1A) entre le réseau de pont de sel et les chambres de culture, qui ont un 00,25 mm 2 section transversale, minimisé le flux de fluide dans le pont de sel pendant l'expérience. La zone de culture de la puce MDF est d'environ 74 mm 2 dans chaque segment. Dans cette démonstration, les chambres de culture cellulaire du dispositif MDF sont composées de l'épaisseur de bande et le couvercle en verre double-face 70 um. Toutefois, si différentes conditions de culture cellulaire (par exemple, une exigence de revêtement de collagène, faible cisaillement d'écoulement, ou un grand moyen volume de la culture dans la chambre de culture) est nécessaire pour la recherche sur les électrotaxie, les deux substrats de culture et les bandes peuvent être facilement remplacés. Par conséquent, les divers types de cellules peuvent être utilisées pour électrotaxie étude au sein de la puce MDF.
Configuration de MDF système microfluidique
La configuration du système microfluidique MDF est illustré sur la figure 3A. Les composants représentés sur la figure 3B sont used pour établir un flux moyen et le réseau de courant électrique dans le système microfluidique MDF. Les tubes reliés avec les écrous des doigts étanche creux (rouge et vert) et cierges Luer (brun) dans la figure 3B-i sont utilisés pour transporter moyen au réseau d'écoulement MDF. Après les seringues ont été connectés aux cierges Luer et se sont installés sur la pompe à quatre canaux, le système d'écoulement du pipeline était complète. Le milieu de culture et les déchets sont transportés à travers le système de pipeline. Parce que la connexion entre les tubes et adaptateurs acryliques sont fixés par des connecteurs vissés, le réseau de support MDF peut tolérer une pression hydraulique plus élevée que le système peut-PDMS. En raison de la faible perméabilité à l'air extrême des feuilles acryliques et les tubes, tout contact entre le moyen de réseau et l'environnement extérieur est bloquée. Par conséquent, la valeur du pH du milieu dans le système demeure stable, et les cellules peuvent être cultivées à l'aide du système microfluidique MDF extérieur d'un incubateur CO 2. Depuis le ch MDFIP est installé sur une platine motorisée, images de cellules time-lapse peuvent être prises à partir de huit sections individuelles. Les microtubes à fond ouvert (figure 3B-II) sont montés sur les écrous des doigts étanche tubulaires translucides (figure 3B-iv) pour augmenter la capacité de volume d'agarose. De cette façon, relativement grandes électrodes peuvent être insérées dans l'agarose pour fournir une stimulation électrique stable aux cellules pendant des périodes plus longues.
Génération de champ électrique à courant continu indiqué dans la puce MDF
La tension de chaque chambre peut être mesurée via les électrodes implantées dans la puce de circuit électrique connecté. Cependant, nous ne mesurons la tension dans la chambre. Au contraire, nous avons simulé le champ électrique dans le réseau de pont de sel et les chambres de culture cellulaire de la puce. Quatre chambres étaient electrotactic série conconnecté dans les circuits électriques. De cette manière, le même courant électrique est maintenu dans chacune de ces chambres. Selon la loi d'Ohm, l'EFS est en corrélation avec l'aire de la section transversale des chambres dans le dispositif microfluidique. En outre, toutes les feuilles et bandes PMMA ont été fabriqués par le Traceur laser CO 2. L'alignement des pièces d'assemblage de puces est précis et les défauts structurels de la puce sont minimes. Ainsi, l'EFS dans chaque chambre devraient rester stables. Les résultats de simulation électriques sur le terrain montrent une répartition homogène de l'EFS avec 300 et 0 mV / mm dans les premières moitiés et les moitiés restantes des chambres de culture dans le dispositif (données non présentées). Auparavant, les rapports de notre laboratoire, Huang et al. et Tsai et al., ont montré que la différence de la mesure et les valeurs simulées EFS est inférieure à 4%. 4,15 Ce résultat montre que, dans notre système, le champ électrique mesuré correspond bien à la valeur simulée. Dans ce work, nous avons inséré grandes électrodes Ag / AgCl pour fournir un courant électrique stable pendant une longue expérience. Le courant appliqué sur la puce MDF diminué seulement 1,85 ± 0,19% après 7 h d'EF stimulation dans les expériences de électrotaxie. En outre, la plus longue période de stimulation électrique était de 4 h dans notre étude. Ainsi, nous croyons que le courant électrique d'entrée reste stable pendant les essais électrotaxie, et le champ électrique dans les chambres electrotactic de la puce MDF sont surveillés par l'ampèremètre connectés en série.
Etude des électrotaxie de cellules de cancer du poumon en utilisant le système microfluidique MDF
Le règlement electrotactic de Rho-kinase associée à enroulement en spirale (ROCK) a été démontrée dans ovaire de hamster chinois (CHO), 20 endothéliale, 21 et 22 cellules neuronales, mais n'a pas encore été étudiée pour le cancer du poumon caunes. Par conséquent, l'inhibiteur de ROCK, Y27632, a été appliquée au système microfluidique MDF pour étudier son effet sur les électrotaxie de cellules cancéreuses du poumon. Comme le montre la Figure 4, le traitement des Y27632 n'a montré aucun effet en modifiant la vitesse de migration des cellules avec ou sans stimulation électrique. Cependant, l'application du Y27632 dans les cellules cancéreuses sous dCEF (300 mV / mm) réduit de manière significative leur migration anodique. A une concentration de 50 uM, l'inhibiteur de ROCK éliminé le mouvement anodique de cellules de cancer du poumon, mais n'a pas affecté leur vitesse de migration. De plus, il y avait une corrélation dose-dépendante entre les concentrations chimiques appliqués et de l'indice de directedness (figure 4B). Ces résultats suggèrent que le système microfluidique MDF est fiable et efficace pour l'étude de électrotaxie.
Figure 1. DesIGN de la puce MDF. (A) Schéma de la puce MDF. Le dispositif MDF se compose de quatre couches de feuilles d'acrylique (72 x 50 mm), 13 adaptateurs acryliques (10 x 10 x 6 mm), ruban adhésif double face, et un verre de couverture (24 × 60 mm). L'épaisseur de la feuille acrylique de la couche 2 est de 2 mm et les trois autres couches sont chacun 1 mm. Dans les trois couches acryliques inférieurs, le pont de sel et réseaux d'écoulement moyennes sont représentées par les blocs bleu et rouge, respectivement. Dans la première couche de feuille acrylique, des adaptateurs acryliques verts ont été utilisés pour l'injection d'agarose. Adaptateurs acryliques bleues ont été utilisés en tant que connexion à des électrodes Ag / AgCl. Il y a quatre chambres de culture cellulaire dans la puce MDF. La zone et la hauteur de chaque chambre de culture cellulaire sont 148 mm 2 (3 x 46 mm) et 0,07 mm, respectivement. Les petits canaux bleus sur les couches 3 et 4 se connectent au réseau de pont de sel aux chambres de culture. La section de ces canaux de connexion est de 0,25 mm
Figure 2. MDF puce fabrication et d'assemblage des processus. (A) Les motifs de la feuille acrylique et ruban adhésif double face ont été prescrites par CO 2 usinage laser. (B) Les couches de feuilles acryliques individuels ont été fabriqués par un laser CO 2 selon le dessin de conception. (C) La feuille acrylique nettoyés ont été collés ensemble en utilisant une colle thermique. (D) complété de montage de puce MDF. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Système de électrotaxie étude. (A) Schéma du système pour l'expérience de électrotaxie. Les tubes reliés à la puce MDF ont été utilisés pour perfusion à moyen et déchets efflux. Le dCEF dans la puce a été menée à travers le Ag / AgCl électrodes et l'alimentation. La configuration de l'appareil a été installé sur la scène XYZ du moteur d'un microscope. Images de portables à la puce ont été prises par un appareil photo reflex numérique commerciale. (B) Photographie des composants du réseau d'écoulement de fluide et la génération dCEF dans le système microfluidique MDF, incluDing (i) le connecteur du tube, (ii) des microtubes à fond ouvert, (iii) solide blanc écrou serré à la main, (iv) translucide tubulaire écrou serré à la main, et (v) des électrodes Ag / AgCl. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effet de la Y27632 sur la migration des cellules de cancer du poumon dans les EFS de (A) zéro et (B) 300 mV / mm. DCEF stimulation a été appliquée après un prétraitement de 1 heure avec la concentration indiquée de Y27632. La stimulation électrique a duré 2 heures. L'analyse quantitative de la directedness et la vitesse de la migration des cellules et constituent en une expérience représentative. 90-100 cellules ont été utilisées dans l'analyse des données. * P <0,001. Les données sont exprimées comme la moyenne ± erreur type dela moyenne (SEM). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons trouvé le processus d'adhésion adaptateurs acryliques sur la couche 1 de la puce MDF à être difficile. L'application de seulement 1 à 2 pi de super glue est suffisante pour faire adhérer fermement l'adaptateur sur la puce MDF. De plus grandes quantités de colle ont abouti à une polymérisation incomplète de la super glue et l'échec à adhérer. Une fois que les adaptateurs acryliques ont été fermement collées sur la puce MDF, une fuite de liquide dans le système microfluidique rarement eu lieu. En outre, O / N incubation intérieur de la chambre à vide a permis d'enlever l'air emprisonné entre le ruban adhésif double face / couvercle en verre ou de l'interface de la feuille de bande / acrylique double-face. Par conséquent, ce procédé améliore la stabilité de la chambre de culture dans la puce MDF.
Contrôle de la température de l'agarose à 3% au cours de la préparation du réseau en pont de sel est importante. Si la température de la gélose est pas assez élevé lors de l'injection, l'agarose va rapidement se solidifier à l'intérieur de la seringue et ne peut pasinjecter dans le réseau de pont de sel. En outre, lors de l'injection d'agarose, il est important d'éviter toute formation de bulles dans le réseau en pont de sel. L'apparition de bulles augmente considérablement la résistance électrique du réseau et conduit à l'échec expérimental. En outre, une fois que l'agarose se solidifie au cours de l'injection, il ne peut pas bloquer complètement l'écoulement de liquide dans le canal de pont salin. Par conséquent, les produits chimiques peuvent alors facilement fuir vers d'autres canaux. La meilleure approche consiste à injecter agarose chaude dans le réseau et pour permettre ensuite la gélose se solidifier à l'intérieur des canaux de pont de sel.
L'injection de cellules est un processus essentiel dans l'expérience de électrotaxie. Afin d'assurer un nombre suffisant de cellules pour l'ensemencement des cellules dans la chambre de culture, nous avons injecté nombre excès de cellules. Dans cette approche, les cellules ont été injectées à partir de la sortie. La vitesse d'injection doit être lente et même d'éviter une répartition inégale de la cellule dans la chambre de culture. En outre, parce que lecanaux sont isolés dans la puce MDF, l'injection doit être faite un canal à la fois. Ainsi, le procédé d'injection de cellule complète prend beaucoup de temps. Dans l'avenir, il sera nécessaire de créer un canal d'injection de cellules supplémentaires qui peuvent cellules simultanément implant dans les quatre chambres de culture. Ce nouveau procédé permettra de réduire le volume échantillon, le nombre de cellules nécessaires pour l'injection, et le temps de fonctionnement.
Il existe plusieurs avantages à utiliser acrylique PDMS plutôt que comme matériau pour la fabrication du dispositif microfluidique. Un dispositif à base d'acrylique peut être utilisé directement sur un appareil de chauffage sans un incubateur. Étant donné que le système ne nécessite aucune alimentation en CO 2, les cellules peuvent être cultivées dans un bio-puce microfluidique à base d'acrylique sur un microscope inversé régulier avec l'élément chauffant. Il est plus facile d'enregistrer des images de cellules dans la puce à l'extérieur de l'étuve. Nous avons utilisé une caméra commerciale largement disponibles reflex numérique pour enregistrer les images de cellules dans le système. En outre, le moelleuxvaisselle nécessaire pour le contrôle programmable de la caméra est également facilement disponibles. Cela rend imagerie time-lapse des cellules facilement programmable. Par conséquent, le coût de la construction du système d'image auto-enregistrement bio-microfluidique est beaucoup plus faible que celle d'un système commercial. En revanche, lors de l'utilisation d'une puce à base de PDMS, le système doit fonctionner dans un incubateur à CO 2. Ainsi, le matériel d'enregistrement d'image supplémentaire doit être acheté pour un fonctionnement dans l'incubateur. Un tel équipement est coûteux, relativement encombrant et occupe une grande partie de l'espace limité dans l'incubateur de culture cellulaire. Dans un autre aspect, par rapport au processus de PDMS fabrication de puces, la fabrication facile et rapide des micro acryliques fl uidique puce est adapté à la fois pour le prototypage et la production de l'appareil. En outre, par rapport au dispositif à base de PDMS, la puce microfluidique à base d'acrylique est structurellement plus stable et plus approprié pour la construction d'un système tridimensionnel complexe réseau microfluidique, de même queréalisée avec la puce MDF dans cette étude. Le pont réseau sur puce sel dans la puce MDF ne peut pas être facilement produit dans un dispositif à base de PDMS. Ce système de réseau minimise la taille totale de la puce microfluidique et rend électrotaxie recherche facile et plus rapide.
Intérieur de la puce MDF, nous avons généré seulement deux points forts de champ électrique (EFS, 0 et 300 mV / mm) dans chaque canal isolé. Cependant, la puce de MDF et de la multi-domaine puce electrotactic, tel que rapporté par Huang et al., 4 parts une conception de canal similaire dans la région de culture de cellules. En modifiant les formes de la chambre de culture dans la puce MDF, plusieurs EFS peuvent également être générés sur la puce MDF. Avec ces modifications, EFS multiples et de multiples produits chimiques peuvent être utilisés dans le même test. En conséquence, un système de criblage à haut débit pourrait être créé pour enquêter sur électrotaxie l'aide de l'appareil.
En une seule expérience, la puce MDF est capable de tester les effets dedifférents produits chimiques sur les cellules dans des dCEF, ou l'influence de la stimulation électrique sur différents types de cellules. Il peut même être possible de mettre en œuvre des 20 canaux parallèles isolées dans la puce de MDF sans augmenter significativement la taille de l'appareil. 8 Comme démontré dans ce travail, dans une expérience, nous avons obtenu une corrélation dose-dépendante significative entre le directedness de la migration cellulaire et Y27632 (figure 4). La puce MDF avec quatre canaux prévoit clairement une approche efficace pour étudier électrotaxie dans les cellules cancéreuses.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
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