Abstract
직류 전계 (dcEF) 아래 방향 세포 이동의 동작 electrotaxis로 지칭된다. 배아 개발, 세포 분화 및 상처 치유하는 동안 세포의 이동을 안내에 생리 dcEF의 중요한 역할은 많은 연구에서 입증되었다. electrotaxis 분석에 미세 유체 칩을 적용함으로써, 조사 과정을 단축하고, 실험 오차가 최소화된다. 최근, 마이크로 유체 장치는 고분자 물질 (예를 들면, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트, PMMA, 아크릴) 또는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 넓게 전기 자극에 세포의 반응을 연구에 사용되었다 만들었다. 그러나, PDMS 소자를 제조하는 데 필요한 다수의 단계와는 달리, 칩 uidic FL 아크릴 마이크로 간단하고 신속한 구조 장치 시제품 및 생산 모두에 적합하다. 그러나보고 된 장치 중 어느 것도 동시 화학 및 DCE의 효율적인 연구를 촉진하지세포에 F 효과. 이 보고서에서, 우리는 우리의 디자인 및 폐암 세포에 화학적 및 전기 자극의 효과를 동시에 조사하는 아크릴계 멀티 듀얼 전계 (MDF) 칩의 제조를 설명한다. MDF 칩은 하나의 시험에서 전기 / 화학적 자극의 여덟 조합을 제공합니다. 이 칩은 크게 필요한 실험 시간을 단축뿐만 아니라 electrotaxis 연구의 정확성을 증가뿐만 아닙니다.
Introduction
직류 전계 (dcEF) 아래에 애노드 또는 캐소드 측으로 이동 부착 세포의 거동 electrotaxis로 지칭된다. 셀 electrotactic 동작은 배아 발생, 신경 재생과 상처 치유에 중요한 역할을한다. 이러한 쥐 전립선 암 세포, (2) 유방암 세포, 3, 폐 선암 세포 4-8로서 1 종양 세포가인가 dcEF하에 electrotactic 이동을 보여 주었다 . 생리 EF는 샘 조직에서 측정되었다. 9,10- Electrotaxis 또한 그랜드 - 관련 종양 세포에서보고되었다. 2,3- 암세포의 electrotaxis가 전이 인자로 간주되고, 종합적. 11의 전기 안내 제어 dcEF 하에서 암 세포는 암 치료를위한 미래의 잠재적 접근 할 수있다. 그러나 오늘, electrotaxis의 상세한 분자 메커니즘은 논란이 남아있다. 따라서, INF의 조사암 세포의 이동에 대한 전기 자극의 luence 암 치료 전략의 개발을 촉진 할 수있다.
최근 바이오 마이크로 유체 장치는 시험 관내에서 12 화학적 구배, 전기 자극 (13) 및 4 전단력을 유동 세포 반응을 연구 제작되었다. (또한 아크릴로 알려진 PMMA), 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 또는 폴리 메틸 메타 크릴 레이트를 사용하여 바이오 미세 유체 소자의 제작이 성공적으로 실험의 실패율을 감소시켰다. 또한, 생물학적 인 피사체를 조사하기위한 시제품으로서 아크릴계 마이크로 유체 장치를 이용하여 PDMS 칩을 사용하는 것보다 간단하다. 아크릴계 장치의 각종 기능은 electrotaxis 연구 개발되어왔다. 그러나, 이전 디자인의 것도 동시에 electrotaxis 연구를 위해 세포에 다양한 화학 조건의 효과와 전기 분야를 테스트 할 수 없습니다. 따라서, 우리는 미세 유체 장치 MU 개발ltichannel 이중 전기 분야 (MDF) 칩 포함하는 4 개의 독립적 인 문화 채널과 하나의 칩에 8 개의 다른 실험 조건을.
처음 허우에 의해보고 된 아크릴 기반 MDF 칩, 등., 8은 전기 자극과 여러 화학적으로 고립 채널을 통합합니다. 이러한 화학적으로 절연 한 채널 실험에서 배양 세포의 다른 유형을 사용할 수있다. 채널에 dcEF은 전력 공급에 의해 생성된다. 두 개의 독립적 인 전기장인가 전계 강도 (EFS) 0 EFS 또 다른 하나는, 각각의 화학적으로 절연 채널에서 수행된다. 이러한 방식으로, 칩 나은 제어 공존 EF 화학적 자극을 제공한다. 또한, MDF 칩 내부 화학적 확산의 수치 시뮬레이션 결과는 전혀 교차 오염이 24 시간 후 실험 기간 사이에 채널이 발생하지 것을 나타낸다. (8)
데비 비교리 의해보고 세륨 등., 14 MDF 칩은 전기적으로 자극 된 세포의 생화학 적 분석을 위해 더 큰 허용 배양 공간을 제공한다. 또한, 칩의 MDF 큰 관찰 영역보다 세포는 시험에서 관찰 할 수 있으므로, 전기적으로 자극 된 세포의 이동 속도 나 directedness의 분석은 더 정확하다. 황 등. (4) 및 영 외. (15)에 의해보고 된 이전 연구의 단일 채널 칩 설계는 셀 또는 화학 물질의 한 타입이 테스트 될 수 있도록. 그러나, MDF 칩 electrotaxis 다양한 화학 물질의 영향뿐만 아니라, 다른 종류의 세포에 대한 전기 자극의 영향을 조사하기 위하여 사용될 수있다. 즉, MDF 칩은 화학 선량 의존성 효율적인 학습을 허용한다.
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Protocol
1. 디자인 및 MDF 칩의 제조
- 이나 AutoCAD와 같은 상용 소프트웨어를 사용하여 개별 아크릴 층 패턴을 그리고 패턴을 저장합니다.
- 도 1A에서 4 층 아크릴 시트 패턴의 설계를 검토하고 층간 접속을 확인한다.
- 모든 아크릴 시트 및 CO 2 레이저 스 크라이 빙 (도 1B, 2A, 및 2B)를 이용하여 레이저 어블 레이션에 의해 양면 테이프를 제작한다. (16)
- 레이저 스크 라이버를 켜고 제어 노트북 컴퓨터를 연결합니다.
- 상용 소프트웨어를 실행하고 클릭하여 단계 1.1 설계 패턴을 열고 "디자인 패턴 파일을."
- 레이저 스크 라이버의 XYZ 스테이지에 빈 아크릴 시트 또는 양면 테이프의 조각을 놓습니다.
- 자동 alignmen와 아크릴 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저 빔의 초점을 설정레이저 스크 라이버의 제조업체에서 제공하는 T 스틱.
- 아크릴 시트 또는 양면 테이프를 직접 가공에 레이저 스크 라이버에 디자인 패턴을 보냅니다.
- 집게를 사용하여 아크릴 시트에서 보호 종이를 제거하고 질소 가스로 깨끗한 표면을 날려.
- 아크릴 시트를 스택 (110)에서 45 분 동안 열 본더에 2kg / ㎠의 압력 하에서 이들을 접합 흐름 / 전기 자극 채널 조립체를 형성하기 위해 C를 °.
- 칩의 세포 배양 용 기재로서 현미경 용 커버 유리를 준비한다.
- 염색 항아리에 커버 유리를 넣고 재료 목록에 세제를 10 배 희석 항아리를 채우십시오.
- 초음파 steri 청소기의 커버 유리와 염색 항아리를 넣고 15 분 동안 커버 유리를 청소하십시오.
- , 염색 항아리에서 희석 한 세제를 붓고 증류수로 항아리를 보충하고, 단계 1.5를 반복합니다.2 3 회.
- 양면 테이프로 부착하기 전에 질소 가스를 불어 넣어 세정 커버 유리를 건조.
- 단계 1.2 패터닝 양면 테이프 흐름 / 전기 자극 채널 어셈블리 세정 커버 유리를 부착.
- 슈퍼 접착제와 MDF 칩 어셈블리의 제 1 층에 개별로 개구 아크릴 어댑터 (13)의 부착 편. MDF 칩 조립체는 완전한 (도 2d)이다.
- 사용하기 전에 UV 조사 30 분으로 완료 MDF 칩 어셈블리를 멸균.
MDF 칩의 소금 브리지 네트워크 2. 설정
- 사용 (121)에서 15 분의 유지 시간을 설정하여도 3b에 도시 된 모든 플라스틱 튜브, 손으로 조인 견과류 및 마이크로 원심 튜브 살균 종래 오토 클레이브에서 C를 °.
- 매체 입구를 통해 MDF 칩 어셈블리에 불소 수지 튜브 (도 3B-I)을 연결및 출구 어댑터는도 1a에 도시.
- 그림에 플라스틱 튜브를 매체 입구의 루어 테이퍼를 연결하고 콘센트 3B-나는 3 방향 마개에.
- 3 ㎖ 주사기를 사용하여 CO 2 -equilibrated 인산염 완충 식염수 (PBS), 2.5 mL를 취하여 입구 플라스틱 튜브의 3 방향 스톱 콕에 주사기를 연결한다. 출구 플라스틱 튜브의 3 방향 스톱 콕에 빈 3 ㎖ 주사기를 연결한다. 두 주사기 따라서 MDF 칩을 통해 서로 연결되어있다.
참고 : (37)의 PBS를 품어 ° C 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터 O / N은 CO 2는 PBS를 -equilibrated 얻을 수있다. - 백색 고체를 손으로 조인 너트와 레이어 1 PMMA 시트에있는 파란색의 개구부 및 녹색 어댑터 (그림 1A)를 밀봉 (그림 3B-III).
- CO 2 염다리 채널 배양 챔버를 채우기 설정 단계 2.4에 기재된 주사기에 PBS를 -equilibrated. 기피기포의 형성.
- 이어서, CO 2 넣어 O / N 항온 배양 용의 37 ° C, 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 MDF 칩을 PBS가 함유 -equilibrated. 이는 양면 테이프에 용해 공기 챔버에 버블을 형성 할 수있다.
- 두 개의 주사기를 사용하여 채널에서의 빠른 흐름에 의해 PBS 채널에서 거품을 얻어 플러시. 앞뒤로 필요 PBS 펌프.
- 매체 배출관에 연결된 3 방향 스톱 콕을 통해 채널에서 PBS 드레인.
- CO 2는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 -equilibrated 새로운 3 mL를 주사기를 사용하여, 2.5 mL를 취하여 (단계 3.5 참조), 및 새와 입구에 연결된 주사기를 교체한다. 매체 채널을 리필.
- 염다리 네트워크의 제조.
- 일시적으로 고체 너트 (그림 3B-III) 녹색 어댑터 (그림 1A)를 제거하고 (> 70 ° C) 아가로 오스에 소금 BRI를 뜨거운 3 %를 주입녹색 어댑터 (그림 1A)에있는 구멍을 통해 당선 총재 채널.
주 : 뜨거운 아가로 오스의 제조 : PBS 50ml에 아가로 오스 분말 1.5 g을 녹인다. 오토 클레이브에서 121 ℃에서 20 분의 유지 시간을 설정하여 살균. - 액체 염다리 채널의 길이의 3/4을 채우면 아가 주입 멈춘다.
- 아가로 오스 주입 후 고체 너트를 (그림 3B-III) 나사에 의해 녹색 어댑터 (그림 1A)에 구멍을 밀봉합니다.
- 반투명 튜브를 손으로 조인 너트 (그림 3B)과 푸른 어댑터 (그림 1A)에 고체 너트를 교체합니다.
- 3 % 통 너트 (그림 3B-IV)에 아가로 오스 예열을로드합니다.
- 전 통 너트로의 Ag / AgCl을 전극 (그림 3B-V) (그림 3B-IV)을 포함아가로 오스의 응고.
- 일시적으로 고체 너트 (그림 3B-III) 녹색 어댑터 (그림 1A)를 제거하고 (> 70 ° C) 아가로 오스에 소금 BRI를 뜨거운 3 %를 주입녹색 어댑터 (그림 1A)에있는 구멍을 통해 당선 총재 채널.
- 염다리 네트워크의 설정을 완료 한 후, 한 번에, 배양 챔버로 한 실을 CL1-5 폐암 세포를 주입.
3. 암 세포의 준비 및 Electrotactic 실험에 대한 설정
- 폐암 세포주 CL1-5의 레귤러 배양.
- 37 75T 세포 배양 플라스크에서 완전 배지에서 교수 팬 Chyr 양, 17에서 얻은 배양 CL1-5 폐암 세포, 5 % CO 2 분위기에서 C를 °. 완전 배지는 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 구성된다. 하위 문화 세포마다 3-4일. electrotaxis 실험 수행에 사용되는 세포는 원본에서 25 미만의 통로이다.
- 기하 급수적으로 증가 CL1-5 세포에 0.25 % 트립신 버퍼 2 ㎖를 추가하고 37에서 2 분 동안 품어 세포 detachmen에 대한 ° C 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터티.
- 10 % FBS DMEM 6 ml의 분리 처리를 종료하고 RT에서 5 분 동안 300g로 원심 분리하여 세포. 이어서 배지를 버리고 PBS 5 ㎖과 세포 펠렛을 중지.
- PBS에서 세포의 수를 계산. 이어서 RT에서 5 분 동안 300g에 1 × 106 세포를 원심 분리를 수행.
- PBS를 폐기하십시오. 미리 예열 CO 2 -equilibrated DMEM으로 세포를 중단하고 1 × 106 세포 / ml가되도록 세포 밀도를 조절한다.
참고 : 37 완전한 매체를 품어 ° C CO 2를 얻기 -CO 2 세포 배양 인큐베이터 O / N은 DMEM을 -equilibrated 5 %.
4. Electrotactic 실험에 대한 설정
- MDF 칩의 출구에서, 칩에 셀 1 × 106 / mL의 0.3 mL로, 주사.
- 세포 배양 인큐베이터에서 셀 시드 MDF 칩을 인큐베이션 (37 ℃ 설정 2-4 시간 동안 ° C와 5 % CO 2).
- MDF 마이크로의 설정유체 시스템.
- 투명 인듐 주석 산화물 유리 (ITO) 위에 히터 MDF 마이크로 유체 시스템을 설치한다. MDF 칩과 ITO 유리 사이 클립핑 K 형 열전대를 가진 MDF 칩의 온도를 측정한다. 비례 적분 미분 (PID) 컨트롤러와 ITO 히터를 제어 할 수 있습니다. 37 MDF 미세 유체 시스템 배양 온도를 설정 PID 제어기와 C를 °.
주 : ITO 히터의 제조 및 세포 배양 물 가열 시스템의 설치 이전의 보고서에 기재되어있다 (18, 19). - 거꾸로 현미경에 컴퓨터 제어 XYZ 전동 무대에서 온도 조절 MDF 칩 어셈블리를 장착합니다. 전동 무대의 사용 단계 5.1에 설명되어 있습니다. 4 채널 주사기 펌프 유입구를 통해 챔버로 배양 완전 배지 펌프.
- 투명 인듐 주석 산화물 유리 (ITO) 위에 히터 MDF 마이크로 유체 시스템을 설치한다. MDF 칩과 ITO 유리 사이 클립핑 K 형 열전대를 가진 MDF 칩의 온도를 측정한다. 비례 적분 미분 (PID) 컨트롤러와 ITO 히터를 제어 할 수 있습니다. 37 MDF 미세 유체 시스템 배양 온도를 설정 PID 제어기와 C를 °.
- 20 μL / hr의 유속 MDF 칩으로 완전 배지 펌프. 아웃에서 문화 폐기물(그림 3a에 "쓰레기"로 표시)의 microcentrifuge 튜브에 수집 할 수 있습니다.
- MDF 칩에 37 ℃에서 또 다른 16 ~ 18 시간 동안 세포를 품어.
- 배지를 교체하기 위해 10 분 동안 20 μL / 분의 유속에서 각 배양 챔버로 각각 50, 25, 5, 0 μM 키나아제 억제제를 함유하는 배지를 펌프.
주 : 10.6 mg의 키나아제 억제제로 멸균 3 ㎖을 첨가하여 회합 단백질은 Rho 키나아제 억제제의 Y27632의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 10 % FBS DMEM 배지를 이용하여, 각각 50, 25, 5 μM로 10 mM의 원액을 희석. - 37 ℃에서 또 다른 60 분 동안 키나아제 억제제로 세포를 배양한다. / 시간 20 μL에 중간 유량을 설정합니다. 동일한 배양 온도를 사용하는 단계 및 이후에 상기 유량.
- 칩의 Ag / AgCl을 통해 전극 MDF 칩에 DC 전원을 접속하는 전기 배선을 사용한다.
- 직렬 I 전류계를 연결N 전기 회로. MDF 칩에 전류를 모니터링하는 전류계를 사용한다.
- DC 전원을 켜고 V. 15 내지 19에 전원 전압을 조정하여 86.94 μA 전류를 전류계로 설정
주 : 옴의 법칙을 고려 I는 벌크 재료를 통해 흐르는 전류, 즉, electrotactic 챔버 내의 배양액이고, E = I / (ΣA의 EFF), σ (= 1.38 Ω -1 m - 1)이고 배양 배지 (0.07 mm 높이 × 3mm의 폭 = 0.21 mm 2) EFF의 전도도 electrotactic 챔버의 유효 단면적, 및 300 MV / mm를 생성하기 위해 필요한 전류 (I) 인 MDF 칩의 EF는 86.94 μA이다.
5. 수집 및 세포 이미지 분석
- MATLAB GUI 프로그램을 사용하여 모터 단계를 제어 할 수 있습니다. microsco에 장착 된 MDF 미세 유체 시스템과PE, 전동 단계를 사용하여 관찰 영역에 칩을 이동합니다.
- 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용하여 기록 세포의 현미경 사진에 탑재.
- 2 시간 동안 15 분 간격으로 4 배 대물 렌즈를 사용하여 미세한 이미지를 가져 가라.
- 세포 이동의 분석.
- NIH ImageJ에 1.47 (V)를 실행
- 셀의 중심의 최종 위치로 초기부터 거리를 분석한다.
- "이미지 시퀀스" "파일"→ "가져 오기"→로 이동하여 세포 이동 분석을위한 9 개의 이미지를 가져옵니다. 제 화상은 제로 시간의 결과이고, 마지막 이미지가 120 분의 결과이다.
- → "측정 설정" "분석"에 가서 옆에있는 상자 "무게 중심"을 확인
- "자유형 선택"아이콘을 클릭합니다.
- 첫 번째 이미지에서 선택된 셀의 에지를 도시한다.
- "편집"로 이동 → "선택"→ "관리자 추가"
- 아홉 번째 이미지로 이동하여 첫 번째 이미지에서 선택한 같은 셀의 가장자리를 묘사. 셀의 위치는 이미지 여덟째 제를 사용 추적 될 수있다.
- → "관리자 추가" "편집"→ "선택"으로 이동
- 반복 90 ~ 100 세포에서 데이터를 수집하기 위해 5.4.5 5.4.9에 단계를 반복합니다.
- 선택한 셀의 초기 및 최종 위치의 결과를 얻을 → "측정"을 "분석"로 이동합니다.
주 : 이동 속도는 시간 당 평균 기포 이동 길이로 정의된다. directedness는 (애노드로부터 캐소드로) dcEF의 벡터 및 최종 위치에 셀의 시작점에서 벡터 사이의 코사인 각도로 정의된다. directedness는 음극쪽으로 마이그레이션 셀의 양극쪽으로 마이그레이션 세포 -1과 +1. 무작위 마일의 그룹에 대한세포 격자, directedness 0 2
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Representative Results
MDF 장치의 제조 및 조립
아크릴계 MDF 칩의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 네 아크릴 시트, 하나의 커버 유리, 아크릴 어댑터 (13), 양면 테이프의 조각이 완료 MDF 칩 (도 2D)의 조립에 사용 하였다. MDF 장치의 네 개의 독립 채널을 배양이있다. 그러나, 온 - 칩 염다리 네트워크는 칩의 여덟 부분에 8 개의 다른 실험 조건을 생성한다. 세 염다리, 79, 90 (도 1a의 계층 2에서 청색 채널), 길이 80mm는, 화상의 관찰을 방해하지 않고 MDF 칩의 두번째 층에 결합되었다. 0이 염다리 네트워크 및 배양 챔버들 사이의 작은 기공 (블루 입방 레이어 3의 채널과도 1a의 4),0.25 mm 2 단면적, 실험 기간 동안 염다리 내로 유체 유동을 최소화. MDF 칩의 문화 영역은 약 74mm 2 각 세그먼트에 있습니다. 이 예제에서, MDF 장치의 세포 배양 챔버는 70 μm의 두께의 양면 테이프와 덮개 유리로 구성되어있다. 그러나, (예를 들어, 콜라겐 코팅 요건, 저 유량 전단 또는 배양 챔버 내의 큰 배양액 부피) electrotaxis 연구에 필요한 다른 세포 배양 조건, 배양 기질과 테이프 모두를 쉽게 교체 할 수있는 경우. 따라서, 세포의 각종 MDF 칩 내의 electrotaxis 연구에 사용될 수있다.
MDF 미세 유체 시스템의 구성
MDF 마이크로 유체 시스템 셋업은도 3a에 도시되어있다. 도 3b에 도시 된 구성 요소를 U 아르유동 매체와 MDF 마이크로 유체 시스템에 전류를 설정하기 위해 네트워크 나오지. 그림에서 빈 손으로 조인 (빨강 및 녹색) 견과류와 루어 테이퍼 (갈색)과 연결 튜브 (b)는-I는 MDF 흐름 네트워크 매체를 수송하는 데 사용됩니다. 주사기는 루어 테이퍼 접속하고 4 채널 펌프 상에 정착 된 후, 파이프 라인의 유동 시스템은 완료되었다. 배양액과 폐기물은 파이프 라인 시스템을 통해 수송된다. 튜브 및 아크릴 어댑터 사이의 접속 커넥터를 나사 결합으로 고정되어 있기 때문에, MDF 매체 네트워크 PDMS 시스템보다 더 높은 유압을 견딜 수있다. 인해 아크릴 시트 및 튜브의 매우 낮은 공기 투과성, 중간 네트워크와 외부 환경 사이의 접촉이 차단된다. 따라서, 시스템에서의 매체의 pH 값이 안정적으로 유지하고, 세포를 CO2 인큐베이터 외부 MDF 마이크로 유체 시스템을 사용하여 배양 할 수있다. MDF의 채널 이후IP는 자동화 된 단계에 설치되어, 시간 경과 세포 이미지 8 개의 개별 섹션에서 취할 수 있습니다. 열린 바닥 마이크로 원심 튜브 (도 3B-II)는 아가의 체적 용량을 증가시키기 위해 관형 투광성 손가락 기밀 너트 (도 3B-IV)에 장착된다. 이러한 방식으로, 비교적 큰 전극을 오랜 기간 동안 안정적으로 세포에 전기 자극을 제공하는 아가로 삽입 될 수있다.
MDF 칩에 나타난 직류 전계의 발생
각 챔버의 전압은 전기 회로에 연결된 칩에 이식 된 전극을 통해 측정 할 수있다. 그러나 챔버 내의 전압을 측정하지 않았다. 대신, 우리는 염다리 네트워크와 칩의 세포 배양 챔버에 전계를 시뮬레이션. 네 electrotactic 챔버 사기꾼 직렬로했다전기 회로에 연결된. 이러한 방식으로, 동일한 전류는 이러한 챔버들 각각 유지된다. 옴의 법칙에 따르면, EFS는 미세 유동 장치의 챔버의 단면의 면적과 상관. 또한, 모든 PMMA 시트 및 테이프 CO 2 레이저 스 크라이 빙에 의해 제조 하였다. 칩 실장 부분의 정렬이 정확하고 칩의 구조적 결함을 최소화한다. 따라서, 각 실의 EFS는 안정적으로 유지한다. 전계 시뮬레이션 결과는 제 반쪽 (300) 및 0 MV / mm와 EFS의 균일 분포 및 장치에서 배양 챔버의 나머지 절반을 보여준다 (데이타 미기재). 이전에, 우리가 실험실, 황 등으로부터보고합니다. 및 영은 외.,. 측정 시뮬레이션 EFS 값의 차가 4 % 미만임을 입증 4,15이 결과가 우리의 시스템에서 측정 된 전계 시뮬레이션 된 값과 잘 대응하고 있음을 보여준다. 이 승오크, 우리는 오랜 실험에 안정된 전류를 제공하는 대형의 Ag / AgCl에 전극을 삽입 하였다. MDF 칩에인가되는 전류는 electrotaxis 실험에서 EF 자극의 1.85 ± 0.19 %, 7 시간 후 감소 하였다. 또한, 전기 자극의 가장 긴 기간은 우리의 연구에서 4 시간이었다. 따라서, 우리는 입력 전류가 electrotaxis 테스트 동안 안정적으로 유지 믿고 MDF 칩 electrotactic 챔버에 전계가 직렬 접속 된 전류계에 의해 모니터링된다.
MDF 마이크로 유체 시스템을 사용 폐암 세포의 electrotaxis 조사
회합은 Rho 꼬인 코일 키나제 (ROCK)의 규제 electrotactic 중국 햄스터 난소 (CHO), 내피 (20), (21) 신경 세포 (22)에서 입증되었지만 아직 폐암 C의 조사되지 않은ELL 학생. 따라서, ROCK 억제제, Y27632는 폐암 세포의 electrotaxis에 미치는 영향을 연구하는 MDF 마이크로 유체 시스템에 적용 하였다. 도 4에 도시 된 바와 같이, Y27632의 치료 또는 전기 자극없이 세포의 이동 속도 변화에 아무런 영향을 나타내지 않았다. 그러나 dcEF 하에서 암세포 Y27632의 애플리케이션 (300 MV / mm)가 현저히 양극 이동을 감소시켰다. 50 μM 농도에서, ROCK 억제제 폐암 세포의 양극 움직임을 제거하지만 그 이동 속도에 영향을 미치지 않았다. 또한,인가 화학적 농도 및 directedness 지수 (도 4B) 사이의 투여 량 - 의존성 상관 관계가 있었다. 이러한 결과는 MDF 미세 유체 시스템이 electrotaxis 연구를위한 안정적이고 효율적으로하는 것이 좋습니다.
그림 1. 데스MDF 칩의 IGN. (A) MDF 칩의 개략도. MDF 장치 아크릴 시트 4 층 (72 × 50mm) 13 아크릴 어댑터 (10 × 10 × 6mm), 양면 테이프, 및 덮개 유리 (24 × 60mm)로 구성된다. 레이어 2 아크릴 판의 두께가 2mm이고, 다른 세 개의 층은 각각 1mm이다. 아래 세 아크릴 층, 소금 다리와 매체 유동 네트워크는 각각 파란색과 빨간색 블록으로 표시됩니다. 제 아크릴 시트 층, 녹색 아크릴 어댑터는 아가의 주입에 사용 하였다. 블루 아크릴 어댑터의 Ag / AgCl을 전극에 연결을 사용 하였다. MDF 칩에 네 개의 세포 배양 챔버가 있습니다. 면적과 각 세포 배양 챔버의 높이가 각각 148mm 2 (3 × 46mm) 및 0.07 mm이다. 레이어 3 및 4에 작은 파란색 채널은 문화 챔버에 소금 브리지 네트워크를 연결합니다. 이러한 연결 채널들의 단면은 0.25 mm이고
그림 2. MDF 칩 제조 및 조립 공정. (A) 아크릴 시트와 양면 테이프의 패턴은 이산화탄소 레이저 가공에 의해 스크라이브했다. (B) 각각의 아크릴 시트 층은 설계 도면에있어서, CO 2 레이저로 제작 하였다. (C) 청소 아크릴 시트S 함께 열 본더를 사용하여 결합 하였다. (D) 완료 MDF 칩 어셈블리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 electrotaxis 연구 3. 시스템. electrotaxis 실험에 대한 시스템의 (A) 개략도. MDF 칩에 연결된 중간 튜브를 주입하고 폐기 유출에 사용 하였다. 칩에 dcEF는 자세 / AgCl을 전극과 전원 공급 장치를 통해 실시했다. 장치 설정은 현미경의 XYZ 모터 무대에 설치되었습니다. 칩 셀 이미지는 상업용 디지털 SLR 카메라로 촬영했다. (B) MDF 마이크로 유체 시스템 내의 유동 매체의 네트워크 구성 요소 및 dcEF 세대의 사진,의 inclu딩 (I) 튜브 커넥터, (II) 오픈 바닥의 microcentrifuge 튜브, (ⅲ) 백색 고체를 손으로 조인 너트, (IV) 반투명 튜브를 손으로 조인 너트 및 (V)의 Ag / AgCl을 전극. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
도 (A)의 아래 EFS 폐암 세포 이동에 Y27632 4. 효과 제로 및 (B) 300 MV / mm. dcEF 자극은 Y27632의 표시된 농도에서 1 시간 전처리 후에 도포 하였다. 전기 자극은 2 시간 동안 지속되었다. directedness 및 세포 이동의 속도의 정량 분석은 대표적인 실험 consititute. 90-100 셀은 데이터 분석에 사용 하였다. * P <0.001합니다. 데이터는 표준 오차 ± 평균으로 표현된다평균 (SEM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 까다로 MDF 칩의 제 1 층 상에 아크릴 어댑터를 부착하는 과정을 발견 하였다. 슈퍼 접착제 단지 1 내지 2 μL의 응용 단단히 MDF 칩 상에 어댑터를 부착하기에 충분하다. 접착제의 큰 금액은 슈퍼 접착제 및 준수 실패의 불완전한 중합 결과. 아크릴 어댑터 단단히 MDF 칩에 부착 한 후, 마이크로 유체 시스템의 액체 누출이 거의 발생하지 않았다. 또한, 진공 챔버 내부의 O / N 항온 처리는 양면 테이프 / 커버 유리 또는 양면 테이프 / 아크릴 시트 인터페이스 사이에 포획 된 공기를 제거하는 데 도움을 주었다. 따라서,이 프로세스는 MDF 칩 배양 챔버의 안정성을 향상시킨다.
염다리 네트워크의 제조시 3 % 아가로 오스의 온도 제어가 중요하다. 아가의 온도가 주입 중에 충분히 높지 않으면, 아가 신속 주사기 내부 고화와 연결할 수없는염다리 네트워크에 주입 될 수있다. 더욱이, 아가로 주입하는 동안, 그것은 염다리 네트워크 내의 어떤 기포 형성을 방지하는 것이 중요하다. 거품의 외양은 크게 네트워크의 전기 저항을 증가시키고, 실험 실패로 이끈다. 아가로 오스가 고형화 중에 주입되면 또한, 완전히 염다리 채널에서 액체 흐름을 차단할 수 없다. 이와 같이, 화학은 다른 채널로 용이하게 유출 할 수있다. 최상의 방법은 네트워크로 핫 아가를 주입 한 후, 아가 로스가 염다리 채널 내부 고화 허용하는 것이다.
세포 주입은 electrotaxis 실험에서 중요한 과정이다. 배양 챔버 내의 세포에 대한 세포의 파종 충분한 수 있도록하기 위해, 우리는 세포의 수를 초과하는 주입. 이 방법에서, 세포는 배출구로부터 주입 하였다. 사출 속도는 배양 챔버 내의 세포 분포 불균일을 방지하기에도 느린되어야한다. 또한 때문에MDF 칩에 절연되어 채널은, 주입 한 번에 하나의 채널이 수행되어야한다. 따라서, 전체 셀 주입 공정은 시간 소모적이다. 향후, 이는 추가적인 세포 주입 채널을 생성 할 필요가있을 것이다 수 네 배양 챔버로 동시에 임플란트 세포. 이 새로운 프로세스는 샘플 볼륨, 주입에 필요한 세포의 수 및 작업 시간을 단축 할 것이다.
미세 유체 장치의 제조를위한 재료로서 PDMS보다는 아크릴을 사용하여 여러 가지 이점이있다. 아크릴계 장치 인큐베이터없이 히터를 직접 조작 할 수있다. 시스템은 어떠한 CO 2 공급이 필요하지 않기 때문에, 세포는 상기 히터와 정규 거꾸로 현미경에 아크릴계 바이오 마이크로 유체 칩에서 성장 될 수있다. 그것은 인큐베이터의 외부 칩에서 세포 이미지를 기록하는 것이 더 쉽습니다. 우리는 시스템 내의 셀의 이미지를 기록하기 위해 널리 사용되는 상업적 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용 하였다. 또한, 소프트카메라의 프로그램 제어에 필요한 제품도 쉽게 사용할 수 있습니다. 이것은 세포의 시간 경과 영상을 쉽게 프로그래밍합니다. 따라서, 바이오 마이크로 유체 자동 녹화 영상 시스템 구축 비용이 상업적 시스템보다 훨씬 낮다. PDMS 기반의 칩을 사용하는 경우는 대조적으로, 시스템은 CO 2 인큐베이터에서 작동되어야한다. 따라서, 별도의 영상 녹화 장비는 인큐베이터에서 작동을 위해 구입해야합니다. 이러한 장치는 상대적으로 부피가 크고 고가이며, 세포 배양 인큐베이터에서 한정된 공간의 상당 부분을 차지한다. 또 다른 측면에서, PDMS 칩의 제조 프로세스에 비해, 칩 uidic FL 아크릴 마이크로 쉽고 빠르게 제조 장치 시제품 및 생산 모두에 적합하다. 있다는 또한, PDMS 기반 장치와 비교하여, 아크릴계 마이크로 유체 칩은 구조적으로 더욱 안정적이고 복잡한 삼차원 미세 유체 네트워크 시스템을 구성하기에 더 적합이 연구에서 MDF 칩을 수행. MDF 칩 온칩 염다리 네트워크 용이 PDMS 기반 장치를 제조 할 수 없다. 이 네트워크 시스템은 미세 유체 칩의 전체 크기를 최소화하고 electrotaxis 연구 쉽고 빠르게 만든다.
MDF 칩의 내부에서, 우리는 서로 격리 된 채널에 두 전기장 강도 (EFS, 0과 300 MV / mm)를 생성합니다. 그러나, 황에 의해보고 된 MDF 칩 및 멀티 칩 필드 electrotactic, 등., 4주 세포 배양 영역에 유사한 채널 설계. MDF 칩 배양 챔버의 형상을 변경함으로써, 여러 EFSs 또한 MDF 칩 상에 생성 될 수있다. 이러한 변형으로, 여러 EFSs 복수 화학 동일한 시험에 사용될 수있다. 따라서, 높은 처리량 스크리닝 시스템은 장치를 사용 electrotaxis을 조사하기 위해 생성 될 수있다.
한 실험에서, MDF 칩의 효과를 시험 할 수있다다른 dcEF에서 세포에 화학 물질, 또는 세포의 다른 유형에 전기 자극의 영향. 심지어 상당히 장치의 크기를 증가시키지 않고 MDF 칩 20 절연 병렬 채널을 구현하는 것이 가능할 수있다. (8) 하나의 실험에서,이 연구에서 입증 된 바와 같이, 우리는 세포 이동의 directedness 간의 상당한 투여 량 - 의존성 상관 관계를 수득 Y27632 (그림 4). 네 개의 채널을 가진 MDF 칩은 명확하게 암 세포에 electrotaxis 연구를위한 효율적인 방법을 제공합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
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