Abstract
O comportamento de migração direccional de células sob uma corrente eléctrica directa de campo (dcEF) é referido como electrotaxis. O papel fisiológico significativo de dcEF em guiar o movimento de células durante o desenvolvimento embrionário, a diferenciação celular, a cicatrização de feridas e tem sido demonstrada em vários estudos. Através da aplicação de chips microfluídicos para um ensaio electrotaxis, o processo de investigação é encurtado e erros experimentais são minimizados. Nos últimos anos, os dispositivos microfluidicos feitos de substâncias poliméricas (por exemplo, polimetilmetacrilato, PMMA, ou acrílico) ou polidimetilsiloxano (PDMS) têm sido amplamente utilizados no estudo das respostas das células à estimulação eléctrica. No entanto, ao contrário de numerosos passos necessários para fabricar um dispositivo de PDMS, a construção simples e rápido dos micro chip de acrílico fl uidic o torna adequado tanto para dispositivo de prototipagem e produção. No entanto, nenhum dos dispositivos relatados facilitar o estudo da química eficiente e simultânea DCEF efeitos sobre as células. Neste relatório, nós descrevemos nosso projeto e fabricação de um chip de múltiplos canais de base acrílica dual-elétrico-campo (MDF) para investigar o efeito simultâneo de química e estimulação elétrica em células de câncer de pulmão. O chip MDF fornece oito combinações de estímulos elétricos / químicos em um único teste. O chip não só reduz drasticamente o tempo necessário experimental, mas também aumenta a precisão na electrotaxis estudos.
Introduction
O comportamento de células aderentes que se deslocam em relação um ânodo ou cátodo sob uma corrente eléctrica directa de campo (dcEF) é referido como electrotaxis. O comportamento electrotactic de células desempenha um papel importante na embriogénese, a regeneração do nervo, e a cicatrização de feridas. 1 As células de tumor, tais como células de cancro da próstata de rato, células de cancro da mama, 2 e 3 de adenocarcinoma do pulmão de células 4-8 mostraram movimento electrotactic sob uma dcEF aplicada . O EF fisiológica foi medido em tecidos glandulares. 9,10 Electrotaxis também tem sido relatada em células de tumor da glândula associada a 2,3. Tomados em conjunto, os electrotaxis de células cancerosas é considerado um factor de metástase. 11 Controlando a orientação eléctrica de células cancerosas sob dcEF pode ser uma abordagem potencial para o tratamento futuro de cancro. No entanto, hoje, o mecanismo molecular detalhada de electrotaxis permanece controverso. Portanto, uma investigação do influence da estimulação elétrica sobre a migração de células de câncer pode facilitar o desenvolvimento de estratégias para o tratamento do câncer.
Recentemente, dispositivos bio-microfluídicos foram fabricadas para estudar as respostas celulares a fluir força de cisalhamento, 12 gradientes químicos, 13 e estímulos elétricos 4 in vitro. O fabrico de dispositivos de microfluidos que utilizam bio-polidimetilsiloxano (PDMS) ou polimetilmetacrilato (PMMA, também conhecido como acrílico) conseguiu reduzir a taxa de falha de tais experiências. Além disso, a utilização de dispositivos de microfluidos de base acrílica como um protótipo para investigar temas biológicos é mais simples do que utilizando PDMS fichas. Várias funções em dispositivos à base de acrílicos têm sido desenvolvidos para electrotaxis estudo. No entanto, nenhum dos modelos anteriores são capazes de testar simultaneamente os efeitos de várias condições químicas e o campo eléctrico sobre as células para electrotaxis estudo. Assim, foi desenvolvido um dispositivo microfluídico-o multichannel dual-elétrico-campo (MDF) de quatro canais independentes de cultura e oito condições experimentais diferentes em um único chip contendo chips.
O chip de MDF à base de acrílico, relatada pela primeira vez por Hou et ai., 8 integra estimulação eléctrica e vários canais quimicamente isolado. Estes canais quimicamente isoladas podem ser usadas para a cultura de células de diferentes tipos em um experimento. O dcEF nos canais é produzido por uma fonte de alimentação elétrica. Dois campos elétricos independentes, um com a força aplicada de campo elétrico (EFS) e outro com 0 EFS, são realizados em cada canal quimicamente isolado. Deste modo, o chip fornece EF-coexistente controlado melhor e estimulação química. Além disso, os resultados da simulação numérica da difusão química dentro do chip MDF indicar que não ocorreu contaminação cruzada entre os canais, após um período experimental de 24 horas. 8
Em comparação com o device relatado por Li et al., 14 o chip MDF fornece uma área de cultura em geral, o que permite, para posterior análise bioquímica das células estimuladas electricamente. Além disso, com a área de observação maior do chip MDF, mais células podem ser observados no teste, de modo que a análise de velocidade de migração ou direcionamento das células estimuladas electricamente é mais preciso. Os desenhos de chips de um único canal de estudos anteriores relatados por Huang et al. 4 e Tsai et al. 15 permitir que apenas um tipo de célula ou de produto químico a ser testado. No entanto, o chip de MDF podem ser utilizados para investigar os efeitos de vários produtos químicos na electrotaxis, bem como os efeitos da estimulação eléctrica sobre diferentes tipos de células. Em outras palavras, o chip MDF permite o estudo eficiente de dependências químicas de dose.
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Protocol
1. Projeto e Fabricação do Chip MDF
- Desenhe um padrão de camada de acrílico individual utilizando software comercial, como AutoCAD, e salvar o padrão.
- Rever o desenho do padrão de folha de acrílico de quatro camadas na Figura 1A e confirmar as conexões inter-camada.
- Fabricar todas as chapas acrílicas ea fita dupla face por ablação a laser utilizando um CO 2 riscador laser (Figuras 1B, 2A, e 2B). 16
- Ligue o riscador de laser e ligar o aparelho ao computador portátil de controle.
- Execute o software comercial e abrir o padrão desenhado na etapa 1.1, clicando em "arquivo padrão desenvolvido."
- Coloque um pedaço de folha de acrílico branco ou fita dupla face no palco XYZ do riscador laser.
- Definir o foco do feixe de laser na superfície da folha de acrílico ou fita adesiva de dupla face com uma auto-alignment vara fornecida pelo fabricante do riscador laser.
- Envie o padrão projetado para o riscador laser para usinagem direta da chapa acrílica ou fita dupla face.
- Retire o papel protetor das placas de acrílico usando uma pinça e soprar a superfície limpa com azoto gasoso.
- Empilhar as folhas de acrílico e Bond-los juntos sob uma pressão de 2 kg / cm 2, num Bonder térmico durante 45 min a 110 ° C para formar o conjunto do canal de fluxo de estimulação / eléctrica.
- Prepara-se o vidro de cobertura de microscópio como o substrato de cultura de células no chip.
- Coloque a tampa de vidro em uma tina de coloração e encher o frasco com uma diluição de dez vezes do detergente listado na lista de material.
- Coloque a tampa de vidro e tina de coloração em uma steri-limpador ultra-sônico e limpar o vidro da tampa para 15 min.
- Despeje o detergente diluído para fora da tina de coloração, encher o frasco com água destilada e repita o passo 1.5.2 3 vezes.
- Seque o vidro da tampa limpos por sopro com azoto gasoso antes de aderir-lo para a fita dupla face.
- Aderem a tampa de vidro limpos para o conjunto do canal de estimulação do fluxo / elétrico com a fita dupla face modelado no passo 1.2.
- Aderem 13 peças de acrílico adaptadores para as aberturas individuais em uma camada do conjunto de chips MDF com super cola. O conjunto de chip de MDF é então completo (Figura 2D).
- Esteriliza-se o conjunto completo de chip MDF com 30 min de irradiação UV antes de ser utilizado.
2. Configuração da Ponte de Rede do Chip MDF Sal
- Antes da utilização, esterilizar todos os tubos de plástico, porcas com os dedos, e tubos de microcentrífuga mostrados na Figura 3B, definindo um tempo de retenção de 15 min a 121 ° C na autoclave.
- Ligue os tubos Fluoroplastic (Figura 3B-i) ao conjunto de chips MDF através do meio de entradae adaptadores de saída mostrado na Figura 1A.
- Conecte o cone Luer do meio de entrada e saída de tubos de plástico na Figura 3B-i para o 3-way torneiras.
- Retirar 2,5 ml de CO 2 salina tamponada com fosfato -equilibrated (PBS) utilizando uma seringa de 3 ml e ligar-se a seringa para a torneira de 3 vias do tubo de entrada de plástico. Ligar uma seringa de 3 ml vazio à torneira de 3 vias do tubo de saída de plástico. As duas seringas são assim interligados por meio do chip de MDF.
NOTA: Incubar a PBS no 37 ° C 5% de CO 2 incubadora de cultura de células O / N para se obter CO 2 -equilibrated PBS. - Selar as aberturas do azul e os adaptadores verdes (Figura 1A) na folha de PMMA Camada 1 com nozes dedo-tight sólidos brancos (Figura 3B-iii).
- Preencha os canais de ponte de sal e câmaras de cultura com o CO 2 -equilibrated PBS na seringa descrito na configuração do passo 2.4. Evitara formação de bolhas.
- Em seguida, coloque o CO 2 -equilibrated PBS contendo chip de MDF no 37 ° C 5% CO 2 celular cultura incubadora de O / N incubação. Isso permite que o ar dissolvido na fita de dupla face para formar bolhas nas câmaras.
- Lave as bolhas para longe nos canais por um fluxo rápido de PBS no canal utilizando as duas seringas. Bombear o PBS e para trás, se necessário.
- Drenar o PBS nos canais através da torneira de 3 vias ligado ao tubo de saída média.
- Utilizando uma nova seringa de 3 ml, retirar 2,5 ml de CO 2 -equilibrated de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (ver passo 3.5), e substituir a seringa ligada à entrada com o novo. Reabastecer os canais com o meio.
- Preparação da rede de ponte de sal.
- Temporalmente remover os sólidos porcas (Figura 3B-III) nos adaptadores verde (Figura 1A) e injectar 3% quente (> 70 ° C) de agarose para o sal BRIdge canal através da abertura na adaptadores verde (Figura 1A).
NOTA: Preparação de agarose quente: Dissolve-se 1,5 g de pó de agarose em 50 ml de PBS. Esterilizar por fixação de um tempo de retenção de 20 min a 121 ° C na autoclave. - Pare injectando a agarose, quando o líquido enche três quartos do comprimento do canal de ponte salina.
- Selar os poros nos adaptadores verde (Figura 1A) apertando as porcas de sólidos (Figura 3B-III) após a injecção de agarose.
- Substitua as porcas sólidas sobre as placas azuis (Figura 1A) com as porcas de dedo-apertado tubulares translúcidos (Figura 3B).
- Carregar a 3% de agarose pré-aquecida para as porcas tubulares (Figura 3B-IV).
- Incorporar os eléctrodos Ag / AgCl (Figura 3B-v) nas porcas tubulares (Figura 3B-iv) antes dosolidificação da agarose.
- Temporalmente remover os sólidos porcas (Figura 3B-III) nos adaptadores verde (Figura 1A) e injectar 3% quente (> 70 ° C) de agarose para o sal BRIdge canal através da abertura na adaptadores verde (Figura 1A).
- Após concluir a configuração da rede de ponte de sal, injetar as células de câncer de pulmão CL1-5 para as câmaras de cultura, uma câmara de cada vez.
3. Preparação das células cancerosas e configurar para Electrotactic Experiment
- Cultura regular da linha de células de câncer de pulmão CL1-5.
- Cultura das células de cancro do pulmão, CL1-5 obtidos a partir de Prof. Pan-Chyr Yang, 17 em meio completo num frasco de cultura de células a 37 75T ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. O meio completo é composto de DMEM e 10% de soro fetal de bovino (FBS). Sub-cultura das células a cada 3 a 4 dias. As células utilizadas para a realização de experimentos electrotaxis têm menos de 25 passagens da fonte original.
- Adicionar 2 ml de tampão de tripsina a 0,25% para as células em crescimento exponencial CL1-5 e incubar durante 2 minutos em 37 o ° C 5% de CO 2 incubadora para cultura de células de células detachment.
- Terminar o processo de desprendimento com 6 ml de meio DMEM FBS a 10% e centrifuga-se as células a 300 g durante 5 min à temperatura ambiente. Depois descarte a forma e suspender o sedimento de células com 5 ml de PBS.
- Contar o número de células em PBS. Então, 1 x 10 6 células e centrifugar a 300 g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Descarte o PBS. Suspender as células pré-aquecido com CO 2 -equilibrated DMEM e ajustar a densidade celular para ser de 1 x 10 6 células / ml.
NOTA: Incubar o meio completo no 37 ° C 5% de CO 2 incubadora de cultura de células O / N para se obter o CO 2 -equilibrated DMEM.
4. Configurar para Electrotactic Experiment
- A partir da saída do chip MDF, injectar 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, as células no chip.
- Incubar o chip MDF célula-semeado na incubadora de cultura celular (fixada em 37 ° C e 5% CO2) durante 2-4 horas.
- Configuração de MDF microsistema fluídico.
- Instale o sistema microfluídico MDF em um aquecedor de vidro transparente de óxido de índio-estanho (ITO). Medir a temperatura do chip de MDF com um termopar tipo K grampeado entre o chip de MDF e o vidro ITO. Controlar o aquecedor ITO com um controlador proporcional-integral-derivativo (PID). Defina o MDF temperatura de incubação sistema microfluídico para 37 ° C com o controlador PID.
NOTA: O fabrico do aquecedor de ITO e a configuração do sistema de aquecimento de cultura celular são descritos em relatórios anteriores 18,19. - Montar o conjunto de chips MDF com temperatura controlada no XYZ estágio motorizado controlado por computador em um microscópio invertido. O uso da platina motorizada é descrito na etapa 5.1. Bombear o meio completo para dentro das câmaras através das entradas de cultura com uma bomba de seringa de quatro canais.
- Instale o sistema microfluídico MDF em um aquecedor de vidro transparente de óxido de índio-estanho (ITO). Medir a temperatura do chip de MDF com um termopar tipo K grampeado entre o chip de MDF e o vidro ITO. Controlar o aquecedor ITO com um controlador proporcional-integral-derivativo (PID). Defina o MDF temperatura de incubação sistema microfluídico para 37 ° C com o controlador PID.
- Bombear o meio completo para o chip de MDF com um caudal de 20 l / h. Os resíduos da cultura para foravamos é coletada nos tubos de microcentrífuga (indicados como "resíduos" na Figura 3A).
- Incubar as células para outra 16-18 h a 37 ° C no chip de MDF.
- Para substituir o meio, bombear o meio contendo 50, 25, 5 e 0 uM de inibidor de cinase, respectivamente, em cada câmara de cultura a uma taxa de fluxo de 20 mL / min durante 10 min.
NOTA: Prepara-se uma solução estoque de 10 mM do inibidor de proteína-quinase associada a Rho-Y27632 por adição de 3 ml de água estéril para o inibidor de cinase de 10,6 mg. Dilui-se a solução stock de 10 mM para 50, 25, e 5 uM, respectivamente, usando 10% de FBS DMEM. - Incubar as células em que o inibidor de cinase durante mais 60 minutos a 37 ° C. Definir a taxa de fluxo médio de 20 l / h. Use a mesma temperatura da cultura e taxa acima descrito em etapas posteriores fluir.
- Use fios eléctricos para ligar uma fonte de alimentação DC para o chip de MDF através dos eléctrodos de Ag / AgCl sobre o chip.
- Serially conectar um amperímetro in o circuito elétrico. Use o amperímetro para monitorar a corrente elétrica no chip MDF.
- Ligue a fonte de alimentação DC e definir o amperímetro atual para 86,94 mA, ajustando a tensão de alimentação entre 15 e 19 V.
NOTA: Tendo em conta a lei de Ohm, E = I / (σA FEP), onde I é a corrente eléctrica que flui através do material a granel, ou seja, o meio de cultura na câmara electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 M - 1) é o condutividade do meio de cultura, um FEP (= 0,21 mm2 para uma largura de 3 mm x 0,07 mm de altura) é a área em secção transversal efectiva da câmara de electrotactic, e a corrente eléctrica (I) necessária para gerar uma 300 mV / mm EF no chip MDF é 86,94 mA.
5. Aquisição e Análise de Imagens de celular
- Controlar o estágio motorizado usando um programa MATLAB GUI. Com o sistema de microfluidos de MDF montado no microscope, mover o chip para as regiões de observação usando o estágio motorizado.
- Imagens de células gravar usando uma câmera de single-lens reflex digitais (SLR) montado no microscópio.
- Tome imagens microscópicas, utilizando uma lente de objectiva de 4X em intervalos de 15 minutos durante 2 horas.
- A análise de migração celular.
- Execute NIH ImageJ 1,47 V.
- Analisar a distância a partir do inicial para as posições finais do centróide da célula.
- Vá em "Arquivo" → "Importar" → "Sequência de Imagens", e importar nove imagens para análise de migração celular. A primeira imagem é o resultado do tempo zero, e a última imagem é o resultado de 120 min.
- Vá em "Analisar" → "Definir Medidas" e marque a caixa ao lado de "Centroid"
- Clique no ícone "Freehand Seleções".
- Descrevem a borda das células seleccionadas na primeira imagem.
- Vá em "Editar" → "Seleção" → "Adicionar ao Manager"
- Ir para o nono imagem e descrever o bordo das mesmas células seleccionadas na primeira imagem. As posições de células pode ser rastreada usando a segunda e a oitava imagens.
- Vá em "Editar" → "Seleção" → "Adicionar ao Manager"
- Repita os passos 5.4.5 a 5.4.9 para coletar dados de 90 a 100 células.
- Vá em "Analisar" → "Measure" para obter o resultado das posições iniciais e finais das células selecionadas.
NOTA: a velocidade de migração é definida como o comprimento médio do movimento das células por hora. O direcionamento é definido como co-seno, onde é o ângulo entre o vector da dcEF (do ânodo para o cátodo) e o vector a partir do ponto de partida de uma célula para a sua posição final. O direcionamento é -1 para as células migram para o ânodo e um para as células que migram em direção ao cátodo. Para um grupo de aleatoriamente migradeamento de células, o direcionamento é 0. 2
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Representative Results
Fabricação e montagem do dispositivo de MDF
Um diagrama esquemático do chip MDF à base de acrílicos é mostrado na Figura 1A. Quatro placas de acrílico, uma tampa de vidro, 13 adaptadores de acrílico, e um pedaço de fita dupla face foram utilizados na montagem do chip MDF concluída (Figura 2D). Há apenas quatro canais independentes de cultura no dispositivo de MDF. No entanto, a rede de pontes salinas no chip cria oito diferentes condições experimentais em todos os oito segmentos do chip. Três pontes salinas (os canais azul na camada 2 da figura 1A), 79, 90, e 80 mm de comprimento, foram acoplados para a segunda camada do chip MDF, sem interferir com a observação de imagem. Os pequenos poros (azul canais cubóide em camadas 3 e 4 da Figura 1A) entre a rede de ponte de sal e as câmaras de cultura, que têm um 0.25 Mm 2 secção transversal de área, minimizado o fluxo de fluido para dentro da ponte de sal durante a experiência. A área de cultura do chip MDF é cerca de 74 mm2 em cada segmento. Nesta demonstração, as câmaras de cultura de células de o dispositivo de MDF são compostos da espessura da fita e tampa de vidro de dupla face de 70 uM. No entanto, se diferentes condições de cultura de células (por exemplo, um requisito de revestimento de colagénio, de baixo cisalhamento do fluxo, ou grande volume de meio de cultura na câmara de cultura) é necessária para ambos os electrotaxis investigação, os substratos de cultura e as fitas podem ser facilmente substituídos. Portanto, vários tipos de células pode ser usada para estudo electrotaxis dentro do chip MDF.
A configuração do sistema de microfluidos de MDF
A configuração do sistema de microfluidos MDF é ilustrado na Figura 3A. Os componentes mostrados na Figura 3B é used para estabelecer o fluxo médio e da rede de corrente eléctrica no sistema microfluídico MDF. Os tubos ligados com as porcas de dedo-apertado ocos (vermelho e verde) e círios Luer (marrom) na Figura 3B-i são utilizadas para o transporte de médio a rede de fluxo de MDF. Após as seringas foram conectados aos círios Luer e se estabeleceram na bomba de quatro canais, o sistema de fluxo de oleoduto foi completa. São transportados meio de cultura e de resíduos através do sistema pipeline. Uma vez que a ligação entre os tubos e adaptadores acrílicos são fixados conectores de rosca, a rede de média MDF podem tolerar pressão hidráulica maior do que o sistema pode PDMS. Devido à extrema baixa permeabilidade ao ar das folhas de acrílico e os tubos, qualquer contacto entre a rede e o meio ambiente exterior é bloqueado. Portanto, o valor do meio no sistema de pH mantém-se estável, e as células podem ser cultivadas utilizando o sistema de microfluidos de MDF fora de uma incubadora de CO 2. Uma vez que o ch MDFIP está instalado em um palco motorizado, imagens de células de lapso de tempo podem ser tomadas a partir de oito seções individuais. Os tubos de microcentrífuga de fundo aberto (Figura 3B-II) são montados sobre as porcas de aperto manual tubulares translúcidos (Figura 3B-IV) para aumentar a capacidade do volume de agarose. Desta forma, relativamente grandes eléctrodos pode ser inserido na agarose para fornecer estimulação eléctrica estável para as células por longos períodos de tempo.
Geração de campo elétrico de corrente contínua indicado no chip MDF
A tensão de cada câmara pode ser medido através dos eletrodos implantados no chip conectado-circuito elétrico. No entanto, nós não medir a tensão na câmara. Em vez disso, que simulava o campo eléctrico na rede de pontes salinas e as câmaras de cultura de células do chip. Quatro câmaras electrotactic foram serialmente connectado nos circuitos eléctricos. Deste modo, a mesma corrente elétrica é mantido em cada uma destas câmaras. De acordo com a lei de Ohm, o EFS correlaciona-se com a área da secção transversal das câmaras no dispositivo de microfluidos. Além disso, todas as chapas de PMMA e as fitas foram fabricados pelo CO 2 riscador laser. O alinhamento das peças de montagem de chip é preciso e os defeitos estruturais do chip são mínimas. Assim, os EFS em cada câmara deve permanecer estável. Os resultados da simulação do campo eléctrico mostram uma distribuição homogénea de EFS com 300 e 0 mV / mm nas primeiras metades e as metades das restantes câmaras de cultura do dispositivo (dados não mostrados). Anteriormente, relatórios de nosso laboratório, Huang et al. e Tsai et al., demonstraram que a diferença na medida e os valores simulados EFS foi inferior a 4%. 4,15 Este resultado mostra que, no nosso sistema, o campo eléctrico medido corresponde bem com o valor simulado. Neste Work, é inserido grandes eléctrodos de Ag / AgCl para fornecer corrente eléctrica estável durante um longo experimento. A corrente aplicada no chip MDF diminuiu apenas 1,85 ± 0,19% após 7 horas de estimulação EF nos experimentos electrotaxis. Além disso, o período mais longo de estimulação elétrica foi de 4 h em nosso estudo. Assim, acreditamos que a corrente elétrica de entrada mantém-se estável durante electrotaxis testes e do campo elétrico nas câmaras electrotactic do chip MDF são monitorados pelo amperímetro em série ligado.
Investigação dos electrotaxis de células de câncer de pulmão que utilizam o sistema microfluídico MDF
A regulação electrotactic de Rho-associado em espiral espiralada cinase (ROCK), foi demonstrada em ovário de hamster chinês (CHO), endotelial 20, 21 e 22 células neuronais, mas ainda não foi investigada para o cancro do pulmão cells. Por conseguinte, o inibidor de ROCK, Y27632, foi aplicada ao sistema de microfluidos de MDF para estudar o seu efeito sobre as células electrotaxis de cancro do pulmão. Como mostrado na Figura 4, o tratamento de Y27632 não mostrou nenhum efeito na alteração da velocidade de migração de células com ou sem estimulação eléctrica. No entanto, a aplicação de Y27632 às células cancerosas sob dcEF (300 mV / mm) reduziu significativamente a sua migração anódica. Na concentração de 50 uM, o inibidor ROCHA eliminado o movimento anódica de células de cancro de pulmão, mas não afecta a sua velocidade de migração. Além disso, houve uma correlação dependente da dose entre as concentrações de químicos aplicados e o índice de direcionamento (Figura 4B). Estes resultados sugerem que o sistema de microfluidos de MDF é fiável e eficaz para estudar electrotaxis.
Figura 1. Design do chip MDF. (A) Desenho esquemático do chip de MDF. O dispositivo MDF é composta por quatro camadas de chapas de acrílico (72 x 50 mm), 13 adaptadores de acrílico (10 × 10 × 6 mm), fita dupla face, e uma tampa de vidro (24 x 60 mm). A espessura da camada de folha de acrílico é de 2 2 mm e os outros três camadas são cada um 1 mm. Nos três camadas inferiores acrílico, a ponte de sal e redes de fluxo médio estão representadas pelos blocos de azul e vermelho, respectivamente. Na primeira camada de folha de acrílico, adaptadores acrílico verdes foram utilizados para a injecção de agarose. Adaptadores acrílico azuis foram usadas como a ligação para os eléctrodos de Ag / AgCl. Existem quatro câmaras de cultura de células no chip de MDF. A área e a altura de cada câmara de cultura de células são 148 mm 2 (3 × 46 mm) e 0,07 mm, respectivamente. Os pequenos canais azuis nas Camadas 3 e 4 conectar a rede ponte de sal para as câmaras de cultura. A secção transversal destes canais de ligação é de 0,25 mm
Processos Figura 2. MDF de fabricação de chips e montagem. (A) Os padrões da folha de acrílico e fita dupla face foram descritas por CO 2 usinagem laser. (B) As camadas individuais de folhas de acrílico foram fabricados por um laser de CO 2 de acordo com o desenho. (C) A folha de acrílico limposs foram colados em conjunto, utilizando um bonder térmica. (D) Concluída a montagem chip de MDF. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Sistema de electrotaxis estudo. (A) Diagrama esquemático do sistema para o experimento electrotaxis. Os tubos ligados ao chip MDF foram usadas para perfusão médio e resíduos de efluxo. O dcEF no chip foi realizado através da Ag / AgCl eletrodos e fonte de alimentação. A instalação do dispositivo foi instalado no palco do motor XYZ de um microscópio. Imagens de células no chip foram tiradas por uma câmera digital SLR comercial. (B) fotografia de um dos componentes da rede de escoamento de meio e a geração dcEF no sistema de microfluidos de MDF, including (i) o conector do tubo, (ii) microtubos abertas de fundo, (iii) sólido branco porca dedo-apertado, (iv) translúcido tubular porca com os dedos, e (v) eléctrodos Ag / AgCl. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeito de Y27632 na migração de células de cancro de pulmão de acordo com as EFS de (A) de zero e (B) 300 mV / mm. DcEF estimulação foi aplicada depois de um pré-tratamento de 1 hora, com a concentração indicada de Y27632. A estimulação eléctrica durou durante 2 horas. A análise quantitativa do direcionamento e a velocidade da migração celular consititute uma experiência representativa. 90-100 células foram usadas na análise de dados. * para P <0,001. Os dados são expressos como a média ± erro padrão deda média (EPM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Encontramos o processo de adesão adaptadores de acrílico para Camada 1 do chip MDF a ser complicado. A aplicação de apenas 1 a 2 ul de super-cola é suficiente para aderir firmemente o adaptador no chip MDF. Grandes quantidades de cola resultou em uma polimerização incompleta do super-cola e falta em aderir. Uma vez que os adaptadores de acrílico foram firmemente aderido no chip MDF, fuga de líquido no sistema microfluídico raramente ocorria. Além disso, O / N incubação dentro da câmara de vácuo ajudou a remover o ar preso entre o / tampa de vidro fita dupla face ou interface dupla face folha de fita / acrílico. Por conseguinte, este processo melhora a estabilidade da câmara de cultura no chip de MDF.
O controlo da temperatura de agarose a 3% durante a preparação da rede de ponte salina é importante. Se a temperatura da agarose não é suficientemente elevada durante a injecção, a agarose solidificar rapidamente irá dentro da seringa e não podeser injectada na rede ponte salina. Além disso, durante a injecção de agarose, é importante para evitar qualquer formação de bolhas na rede ponte salina. O aparecimento de bolhas aumenta grandemente a resistência eléctrica da rede e leva à falha experimental. Além disso, uma vez que a agarose solidifica durante a injecção, esta não pode bloquear completamente o fluxo de líquido no canal de ponte salina. Como tal, os produtos químicos podem facilmente seguida vazar para outros canais. A melhor abordagem é injetar agarose quente na rede e, em seguida, permitir que a agarose para solidificar dentro dos canais de ponte de sal.
Injecção celular é um processo crítico para o experimento electrotaxis. Para assegurar um número suficiente de células para a sementeira de células na câmara de cultura, que injectado em excesso do número de células. Nesta abordagem, as células foram injectados a partir da saída. A velocidade de injeção deve ser lento e até mesmo para evitar uma distribuição desigual de células na câmara de cultura. Além disso, porque ocanais são isolados no chip de MDF, a injecção tem de ser feito um canal de cada vez. Assim, o processo de injecção de célula completa é demorado. No futuro, será necessário para criar um canal de injecção de células adicionais que podem células simultaneamente implante na todas as quatro câmaras de cultura. Este novo processo irá reduzir o volume de amostra, o número de células necessário para a injecção, e o tempo de operação.
Existem várias vantagens na utilização de acrílico em vez de PDMS como o material para a fabricação do dispositivo de microfluidos. Um dispositivo à base de acrílico pode ser operada directamente sobre um aquecedor sem uma incubadora. Uma vez que o sistema não requer nenhuma fornecimento de CO 2, as células podem ser cultivadas num chip de bio-microfluidos à base de acrílico sobre um microscópio invertido regular com o aquecedor. É mais fácil para gravar as imagens das células no chip fora de uma incubadora. Nós usamos uma câmera digital SLR comercial amplamente disponível para gravar as imagens de células no sistema. Além disso, o softutensílios necessários para controle programável da câmera também é facilmente disponível. Isso faz com que time-lapse imaging das células facilmente programável. Por conseguinte, o custo de construção do sistema de gravação automática de imagem Bio-microfluidos é muito menor do que a de um sistema comercial. Em contraste, quando se utiliza um chip baseado-PDMS, o sistema pode ser operado numa incubadora de CO 2. Assim, a imagem adicional equipamento de gravação deve ser adquirido para a operação na incubadora. Tal equipamento é caro, relativamente volumosos, e ocupa uma grande parte do espaço limitado na incubadora de cultura de células. Noutro aspecto, em comparação com o processo de fabricação de chips de PDMS, a fabricação fácil e rápido dos micro chip de acrílico fl uidic é adequado tanto para dispositivo de prototipagem e produção. Além disso, em comparação com o dispositivo de PDMS-base, o chip de microfluidos à base de acrílicos é estruturalmente mais estável e mais adequado para a construção de um sistema de microfluidos de rede tridimensional complicada, como foirealizada com o chip MDF neste estudo. A rede ponte salina no chip no chip de MDF não pode ser facilmente produzido em um dispositivo baseado no PDMS. Este sistema de rede minimiza o tamanho total do chip de microfluidos e faz electrotaxis pesquisa mais fácil e rápido.
Dentro do chip de MDF, geramos apenas dois pontos fortes de campo elétrico (EFS, 0 e 300 mV / mm) em cada canal isolado. No entanto, o chip de MDF e o campo multi-chip de electrotactic, como relatado por Huang et ai., 4 partes de um design de canal semelhante na região da cultura celular. Alterando as formas da câmara de cultura no chip MDF, EFSS múltiplos também pode ser gerado no chip de MDF. Com estas modificações, e múltiplos EFSS múltiplos produtos químicos podem ser utilizados no mesmo teste. Por conseguinte, um sistema de rastreio de alto rendimento poderá ser criado para investigar electrotaxis utilizando o dispositivo.
Em apenas um experimento, o chip MDF é capaz de testar os efeitos dediferentes substâncias químicas em células sob dcEF, ou as influências de estimulação elétrica em diferentes tipos de células. Pode até ser possível aplicar 20 canais paralelos isolado no chip MDF, sem aumentar significativamente o tamanho do dispositivo. 8 Tal como demonstrado no presente trabalho, numa experiência, foi obtida uma correlação dependente da dose significativa entre o direcionamento da migração celular e Y27632 (Figura 4). O chip de MDF com quatro canais fornece claramente uma abordagem eficiente para estudar electrotaxis em células cancerosas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
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