Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53340
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

Abstract

Oppførselen til retningscellemigrering under en likestrøms-elektrisk felt (DCEF) er referert til som electrotaxis. Den betydelige rolle fysiologiske DCEF i guiding celle bevegelse i løpet av embryo utvikling, celledifferensiering og sårtilheling har blitt vist i mange studier. Ved å anvende microfluidic chips til en electrotaxis analysen blir undersøkelsesprosessen forkortes og eksperimentelle feil er minimalisert. I de senere år microfluidic anordninger laget av polymere substanser (for eksempel polymetylmetakrylat, PMMA, eller akryl) eller polydimetylsiloksan (PDMS) har blitt mye brukt i å studere reaksjoner i cellene til elektrisk stimulering. Men i motsetning til de mange trinnene som kreves for å dikte opp en PDMS enhet, enkel og rask bygging av akryl mikro fl uidic chip gjør den egnet for både enheten prototyping og produksjon. Men ingen av de rapporterte enheter lette effektiv studie av samtidig kjemisk og DCEF virkninger på celler. I denne rapporten beskriver vi vår design og fabrikasjon av en akrylbasert flerkanals dual-elektrisk-feltet (MDF) chip for å undersøke samtidige effekten av kjemisk og elektrisk stimulering på lungekreft celler. MDF-brikken har åtte kombinasjoner av elektriske / kjemiske stimuleringer i en enkelt test. Brikken ikke bare sterkt forkorter den nødvendige eksperimentelle tid, men også øker nøyaktigheten i electrotaxis studier.

Introduction

Oppførselen til adherente celler beveger seg mot en anode eller katode i henhold til en likestrøm-elektrisk felt (DCEF) er referert til som electrotaxis. Den electrotactic oppførsel av celler spiller en betydelig rolle i embryogenese, nerve regenerering, og sårheling. 1 Tumorceller som rotteprostatakreftceller, to brystcancerceller, 3 og lunge adenokarsinomceller 4-8 har vist electrotactic bevegelse under en påført DCEF . Den fysiologiske EF har blitt målt i kjertel vev. 9,10 Electrotaxis er også blitt rapportert i kjertel-assosiert tumorceller. 2,3 Tatt sammen, electrotaxis kreftceller er ansett å være en metastase faktor. 11 Styre elektriske veiledning kreftceller under DCEF kan være en mulig tilnærming for fremtidig behandling av kreft. Men i dag, den detaljerte molekylære mekanismen for electrotaxis fortsatt kontroversielt. Derfor en undersøkelse av influence av elektrisk stimulering på kreft celle migrasjon kan bidra til utvikling av strategier for kreftbehandling.

Nylig har bio-microfluidic enheter blitt fabrikkert for å studere cellulære responser til å flyte skjærkraft, 12 kjemiske gradienter, 13 og elektrisk stimuli 4 in vitro. Fabrikasjon av bio-microfluidic enheter ved hjelp polydimethylsiloxane (PDMS) eller polymethylmethacrylate (PMMA, også kjent som akryl) har fått redusert strykprosent av slike eksperimenter. Videre bruker akrylbasert microfluidic enheter som en prototype for å undersøke biologiske fag er enklere enn å bruke PDMS chips. Ulike funksjoner i akryl-baserte enheter har blitt utviklet for electrotaxis studien. Imidlertid har ingen av de tidligere utførelser er i stand til samtidig å teste effekten av forskjellige kjemiske forhold og det elektriske felt på celler for electrotaxis studien. Derfor har vi utviklet en microfluidic enhet-multichannel dual-elektrisk-feltet (MDF) chip som inneholder fire uavhengige kulturkanaler og åtte ulike eksperimentelle forhold i en chip.

Den akrylbaserte MDF chip, først rapportert av Hou et al., 8 integreres elektrisk stimulering og flere kjemisk isolerte kanaler. Kan brukes Disse kjemisk isolerte kanaler til kulturen forskjellige typer av celler i en eksperiment. Den DCEF i kanalene frembringes ved hjelp av en elektrisk kraftforsyning. To uavhengige elektriske felt, ett med anvendt elektrisk feltstyrke (EFS) og en annen med 0 EFS, er gjennomført i hver kjemisk isolert kanal. På denne måten gir den bedre chip-kontrollerte sameksistens EF og kjemisk stimulering. Videre resultater fra numerisk simulering av kjemisk diffusjon inne i MDF chip tyder på at ingen krysskontaminering skjedde mellom kanalene etter en 24 timers forsøksperioden. 8

Sammenlignet med device beskrevet av Li et al., gir 14 MDF-brikken et større område kultur, som gir mulighet for ytterligere biokjemiske analyse av de elektrisk stimulerte celler. I tillegg, med MDF brikkens større observasjonsområde, flere celler kan observeres i testen, slik at analysen av migrasjonshastigheten eller directedness av de elektrisk stimulerte celler er mer nøyaktig. De enkanals chip-design av tidligere studier rapportert av Huang et al. 4 og Tsai et al. 15 tillater bare en type celle eller kjemisk for å bli testet. Imidlertid kan MDF brikken bli brukt til å undersøke effektene av forskjellige kjemikalier på electrotaxis, samt virkningene av elektrisk stimulering på forskjellige typer celler. Med andre ord tillater den MDF chip for effektiv studiet av kjemiske doseavhengigheter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og fabrikasjon av MDF Chip

  1. Tegn en individuell akryl lag mønster ved hjelp av kommersiell programvare, for eksempel AutoCAD, og ​​lagre mønsteret.
    1. Gjennomgang for utformingen av fire-lags akryl ark mønsteret i figur 1A og bekrefter de intersjiktforbindelser.
  2. Dikte alle akrylplater og dobbeltsidig tape med laser ablasjon hjelp av en CO 2 laser rissenål (Tall 1B, 2A og 2B). 16
    1. Slå på laseren rissenål og koble maskinen til den kontrollerende laptop.
    2. Kjør kommersiell programvare og åpne mønsteret designet i trinn 1.1 ved å klikke på "designet mønsteret fil."
    3. Legg et stykke blank akryl ark eller dobbeltsidig tape på XYZ stadium av laser rissenål.
    4. Satt fokus for laserstrålen på overflaten av akryl ark eller dobbeltsidig tape med en auto-alignment stick gitt av produsenten av laseren rissenål.
    5. Send designet mønsteret til lasertelegraf for direkte bearbeiding av akryl ark eller dobbeltsidig tape.
  3. Fjern beskyttelsespapiret fra akrylplater ved hjelp av pinsett og blåse overflaten ren med nitrogengass.
  4. Stable akrylplater og binde dem sammen under et trykk på 2 kg / cm 2 i et termisk bønder i 45 minutter ved 110 ° C for å danne flow / elektrisk stimulering kanal montering.
  5. Klargjør mikroskop dekkglasset som cellekultur substratet i brikken.
    1. Sett på dekkglass i en fargings krukke og fylle glasset med et ti-gangers fortynning av vaskemiddel som er oppført i materialet listen.
    2. Sett dekselet glass og farging jar i en ultralydklor-renere og rengjøre dekkglass i 15 min.
    3. Hell fortynnet vaskemiddel ut av flekker krukke, fylle glasset med destillert vann, og gjenta trinn 1.5.2 tre ganger.
    4. Tørk renset dekkglass ved å blåse den med nitrogengass før man følger den til dobbeltsidig tape.
  6. Følge renset dekkglass til flyt / elektrisk stimulering kanal montering med dobbeltsidig tape mønstret i trinn 1.2.
  7. Følge 13 stykker av akryl adaptere til de enkelte åpninger i Layer 1 av MDF chip montering med superlim. MDF chip montering er så komplett (figur 2D).
  8. Sterilisere komplett MDF chip montering med 30 min av UV bestråling før bruk.

2. Oppsett i Salt Bridge Network of MDF Chip

  1. Før bruk sterilisere alle plastrørene, fingertett nøtter og mikrosentrifugerør som er vist på figur 3B ved å sette en holdetid på 15 minutter ved 121 ° C i autoklaven.
  2. Koble fluoroplastic rør (Figur 3B-i) til MDF-chip montering via mediet innløpetog utløps adaptere vist i Figur 1A.
  3. Koble Luer taper av mediet innløp og utløp plastrør i Figur 3B-i til de 3-veis stoppekraner.
  4. Ta 2,5 ml CO 2 -equilibrated fosfatbufret saltløsning (PBS) under anvendelse av en 3 ml sprøyte og koble sprøyten til 3-veis stoppekran i innløps plastrør. Koble en tom 3 ml sprøyte til 3-veis stoppekran i utløps plastrør. De to sprøyter er dermed koblet sammen gjennom MDF chip.
    MERK: Inkuber PBS i 37 ° C 5% CO 2 cellekulturinkubatoren O / N for å få CO 2 -equilibrated PBS.
  5. Forsegle åpningene av blå og grønne adaptere (Figur 1a) på Layer 1 PMMA ark med hvite solide finger tett nøtter (Figur 3B-iii).
  6. Fyll salt bro kanaler og kultur kamre med CO 2 -equilibrated PBS i sprøyten beskrevet i oppsettet trinn 2.4. Unngådannelsen av bobler.
  7. Deretter satte den CO 2 -equilibrated PBS-holdig MDF chip i 37 ° C 5% CO 2 cellekultur inkubator for O / N inkubasjon. Dette tillater at oppløst luft i den dobbeltsidig tape for å danne bobler i kamrene.
  8. Spyle bort bobler i kanalene ved en rask PBS flyt i kanalen ved hjelp av de to sprøyter. Pumpe PBS frem og tilbake om nødvendig.
  9. Drenere PBS i kanalene via tre-veis kran som er koblet til mediet utløpsrøret.
  10. Ved hjelp av en ny 3-ml sprøyte, ta 2,5 ml av CO 2 -equilibrated Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) (se trinn 3.5), og erstatte sprøyten er koblet til innløpet til den nye. Påfyll kanalene med mediet.
  11. Fremstilling av saltet bro-nettverket.
    1. Midlertidig fjerne de faste muttere (figur 3B-iii) på de grønne adapterne (figur 1A) og injisere 3% varme (> 70 ° C) agarose i salt bridge kanal gjennom åpningen i grønne adaptere (figur 1A).
      MERK: Fremstilling av varm agarose: Oppløs 1,5 g agarose-pulver i 50 ml PBS. Steriliser ved å sette en holdetid på 20 min ved 121 ° C i autoklaven.
    2. Stoppe injisere agarose når væsken fyller tre fjerdedeler av lengden av den saltbroen kanalen.
    3. Forsegle porene på de grønne adaptere (figur 1A) ved å skru fast mutterne (Figur 3B-iii) etter agarose injeksjon.
    4. Bytt ut de faste mutrene på de blå adaptere (Figur 1a) med de gjennomsiktige rørformede finger tett nøtter (Figur 3B).
    5. Last inn 3% agarose forvarmes til de rørformede nøtter (Figur 3B-IV).
    6. Bygge inn Ag / AgCl elektroder (Figur 3B-v) i de rørformede nøtter (Figur 3B-iv) førstørkning av agarose.
  12. Etter å ha fullført oppsettet av salt broen nettverk, injisere CL1-5 lungekreftceller i kultur kamre, ett kammer om gangen.

3. Utarbeidelse av kreftceller og satt opp for Electrotactic Experiment

  1. Regelmessig kultur for lungekreft cellelinje CL1-5.
    1. Kultur de CL1-5 lungekreftceller, hentet fra professor Pan-Chyr Yang, 17 i komplett medium i en 75T cellekulturflaske ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. Den komplette medium er sammensatt av DMEM og 10% føtalt bovint serum (FBS). Sub-kultur av cellene hver 3 til 4 dager. Cellene som brukes for å utføre electrotaxis eksperimenter er mindre enn 25 passasjer fra den opprinnelige kilden.
  2. Tilsett 2 ml av 0,25% trypsin-buffer til de eksponentielt voksende CL1-5 celler og inkuberes i 2 minutter i 37 ° C 5% CO 2 cellekultur inkubator for celle detachment.
  3. Avslutte løsgjøring prosessen med 6 ml 10% FBS DMEM og sentrifuger cellene ved 300 g i 5 min ved RT. Deretter kastes medium og suspen cellepelleten med 5 ml PBS.
  4. Tell antall celler i PBS. Så 1 x 10 6 celler og sentrifuger ved 300 g i 5 min ved RT.
  5. Kast PBS. Suspendere cellene med forvarmet CO 2 -equilibrated DMEM og justere celletettheten til å være 1 x 10 6 celler / ml.
    MERK: Inkuber komplett medium i 37 ° C 5% CO 2 cellekulturinkubatoren O / N for å få CO 2 -equilibrated DMEM.

4. Sett opp for Electrotactic Experiment

  1. Fra utløpet av MDF chip, injisere 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, av cellene inn i brikken.
  2. Inkuber celle-seeded MDF chip i cellekulturinkubator (innstilt ved 37 ° C og 5% CO2) i 2-4 timer.
  3. Oppsett av MDF microfluidic system.
    1. Installer MDF microfluidic systemet på en gjennomsiktig indiumtinnoksid glass (ITO) bereder. Måle temperaturen av MDF-brikken med en K-type termoelement klippet mellom MDF chip og ITO glass. Styr ITO ovn med en proporsjonal-integral-derivat (PID) kontrolleren. Sett MDF microfluidic system inkuberingstemperatur til 37 ° C med en PID-regulator.
      MERK: fabrikasjon av ITO varmeapparatet og oppsett av cellekultur varmesystemet er beskrevet i tidligere rapporter 18,19.
    2. Montere temperaturkontrollert MDF chip montering på datastyrt XYZ motorisert scenen på en invertert mikroskop. Bruken av motoriserte trinn er beskrevet i trinn 5,1. Pump fullstendig medium i kulturkamrene gjennom innløpene med en fire-kanals sprøytepumpe.
  4. Pump den komplette medium i MDF-chip ved en strømningshastighet på 20 mL / time. Kulturen avfall fra outlar samles i Mikrosentrifugerør (vist som "avfall" i figur 3A).
  5. Cellene inkuberes i et annet 16-18 timer ved 37 ° C i MDF brikken.
  6. For å erstatte mediet, pumpe medium inneholdende 50, 25, 5, 0 og uM kinase inhibitor, henholdsvis i hver kultur kammer med en strømningshastighet på 20 mL / min i 10 min.
    MERK: Fremstill en 10 mM stamløsning av Rho-assosiert protein kinase inhibitor Y27632 ved tilsetning av 3 ml sterilt vann til 10,6 mg kinase inhibitor. Fortynn 10 mM stamløsning på 50, 25, og 5 uM, henholdsvis ved bruk av 10% FBS DMEM-medium.
  7. Inkuber cellene i kinase inhibitor for en annen 60 min ved 37 ° C. Still medium strømningshastigheten 20 pl / time. Bruk samme kultur temperatur og strømningshastighet som er beskrevet ovenfor i senere trinn.
  8. Bruk elektriske ledninger for å koble til en DC strømforsyning til MDF chip via Ag / AgCl elektroder på brikken.
  9. Serielt koble et amperemeter in er den elektriske kretsen. Bruk amperemeter for å overvåke den elektriske strømmen i MDF brikken.
  10. Slå på DC strømforsyning og sette amperemeter strøm til 86,94 fiA ved å justere strømforsyningen på mellom 15 og 19 V.
    MERK: vurderer Ohms lov, E = I / (σA eff), hvor I er den elektriske strøm som flyter gjennom massegodset, dvs. dyrkningsmediet i electrotactic kammeret, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) er ledningsevne i kulturmediet, A eff (= 0,21 mm 2 for et 3 mm bredde x 0,07 mm høyde) er det effektive tverrsnittsareal av det electrotactic kammeret, og den elektriske strømmen (I) som er nødvendig for å generere et 300 mV / mm EF i MDF chip er 86,94 uA.

5. Oppkjøp og analyse av Cell Images

  1. Styr motorisert stadium ved hjelp av et MATLAB GUI program. Med MDF mikrofluidsystem montert på mikroskop,pe, flytte brikken til observasjon regionene ved hjelp av motoriserte scenen.
  2. Postcelle bilder med et digitalt speilreflekskamera (SLR) kamera montert på mikroskopet.
  3. Ta mikroskopiske bilder med en 4X objektiv med intervaller på 15 min for 2 timer.
  4. Celle migrasjon analyse.
    1. Kjør NIH ImageJ 1,47 V.
    2. Analyser avstand fra den første til de endelige posisjoner av cellens geometriske tyngdepunkt.
    3. Gå til "File" → "Import" → "Image Sequence", og importere ni bilder for celle migrasjon analyse. Det første bildet er et resultat av null tid, og det siste bildet er et resultat av 120 min.
    4. Gå til "Analyze" → "Set Målinger" og merk av for "Tyngdepunktet"
    5. Klikk på "Freehand Selections" -ikonet.
    6. Skildre kanten av de valgte cellene i det første bildet.
    7. Gå til "Edit" → "Valg" → "Legg til Manager"
    8. Gå til niende bildet og skildre kanten av de samme cellene valgt på det første bildet. Celle posisjonene kan spores ved hjelp av andre til åttende bilder.
    9. Gå til "Edit" → "Selection" → "Legg til Manager"
    10. Gjenta trinn 5.4.5 til 5.4.9 for å samle inn data fra 90 til 100 celler.
    11. Gå til "Analyze" → "tiltak" for å få resultatet av de første og siste posisjonene til de valgte cellene.
      MERK: migrasjon hastighet er definert som gjennomsnittet celle bevegelse lengde per time. Den directedness er definert som cosinus, der er vinkelen mellom vektoren av DCEF (fra anode til katode) og vektoren fra startpunktet av en celle til dens endelige stilling. Den directedness er -1 for cellene migrerer mot anoden og en for celler migrerer mot katoden. For en gruppe tilfeldig migrating celler, er 0. 2 den directedness

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fabrikasjon og sammenstilling av MDF-enhet

Et skjematisk diagram av akrylbasert MDF brikke er vist i Figur 1A. Fire akrylplater, ett deksel glass, 13 akryl adaptere, og et stykke dobbeltsidig tape ble brukt i monteringen av den ferdige MDF chip (figur 2D). Det er bare fire uavhengige kultur kanaler i MDF-enheten. Imidlertid skaper on-chip saltbro nettverk åtte forskjellige forsøksbetingelser i de åtte segmenter av brikken. Tre saltbroer (blå kanaler i lag 2 i figur 1 A), 79, 90 og 80 mm i lengde, ble koblet til det andre laget av MDF brikke uten å forstyrre den bilde observasjon. De små porer (blå cuboid kanaler i lag 3 og 4 i fig 1 A) mellom saltbro nettverket og kulturkamre, som har en 0-0,25 mm 2 tverrsnittsareal, minimert fluidfluksen inn i saltbroen under forsøket. Kulturen området av MDF-brikken er omtrent 74 mm 2 i hvert segment. I denne demonstrasjonen blir cellekulturkamre MDF-anordningen består av 70 um tykt dobbeltsidig tape og dekkglass. Men hvis ulike celledyrkningsforhold (for eksempel en kollagen belegg krav, lav vannføring skjær, eller stor kultur medium volum i kulturen kammer) er nødvendig for electrotaxis forskning, både kultur underlag og båndene kan lett skiftes ut. Derfor kan forskjellige typer av celler brukes for electrotaxis studier innen MDF-chip.

Konfigurasjon av MDF microfluidic system

MDF microfluidic systemoppsett er illustrert i figur 3A. Komponentene som er vist i figur 3B er used å etablere medium flyt og elektrisk strøm nettverket i MDF microfluidic system. Rørene er forbundet med de hule fingertett muttere (røde og grønne) og Luer avsmalninger (brun) i figur 3B-i blir brukt til å transportere medium til MDF strømnings nettverket. Etter sprøytene var koblet til de Luer smalner og bosatte seg på firekanals pumpe, var rørledningen flyt system komplett. Kulturmedium og avfall blir transportert gjennom rørsystemet. På grunn av at forbindelsen mellom rørene og akryl adaptere er festet ved skrudd kontakter, kan det MDF medium nettverket tåler høyere hydraulisk trykk enn det PDMS-systemet. På grunn av den ekstremt lave luftpermeabilitet av akrylplater og rørene er noen kontakt mellom mediet nettverket og de ytre omgivelser blokkert. Derfor forblir pH-verdien av mediet i systemet stabilt, og cellene kan dyrkes ved hjelp av MDF mikrofluidsystem utenfor en CO 2 inkubator. Siden MDF chip er installert på en motorisert stadium, kan time-lapse cellebilder tas fra åtte forskjellige kapitlene. Den åpne bunn mikrosentrifugerør (figur 3B-II) er montert på den gjennomskinnelige rørformede fingertett muttere (figur 3B-iv) for å øke kapasiteten på agarose volum. På denne måte kan relativt store elektroder settes inn i agarose for å tilveiebringe stabil elektrisk stimulering til cellene i lengre perioder av gangen.

Generering av indikeres likestrøm elektrisk felt i MDF chip

Spenningen fra hvert kammer kan måles via implanterte elektrodene i den elektriske kretsen er koblet chip. Men vi gjorde ikke måle spenningen i kammeret. Heller, vi simulert det elektriske felt i saltbroen nettverket og cellekulturkamre brikken. Fire electrotactic kamre var serielt contilkoplet i de elektriske kretser. På denne måten blir den samme elektriske strøm vedlikeholdes i hvert av disse kamrene. Ifølge Ohms lov, korrelerer med arealet av tverrsnittet av kamrene i mikrofluidinnretningen EFS. I tillegg ble alle PMMA plater og bånd fabrikkert av CO 2 laser rissenål. Innrettingen av chip monteringsstykkene er presis og de strukturelle defekter av brikken er minimal. Således bør de EFS i hvert kammer forblir stabil. De elektriske felt simuleringsresultater viser en homogen fordeling av EFS med 300 og 0 mV / mm i de første halvdelene, og de resterende halvdeler av kultur kamrene i anordningen (data ikke vist). Tidligere rapporter fra vårt laboratorium, Huang et al. og Tsai et al., har vist at forskjellen i de målte og de ​​simulerte EFS verdiene var mindre enn 4%. 4,15 Dette resultat viser at, i vårt system, det målte elektriske felt samsvarer godt med den simulerte verdi. I denne work, vi satt inn store Ag / AgCl elektroder for å gi stabil elektrisk strøm for en langvarig eksperiment. Den brukes strøm på MDF chip kun redusert 1,85 ± 0,19% etter 7 timer av EF stimulering i electrotaxis eksperimenter. Videre, den lengste perioden med elektrisk stimulering var fire timer i vår studie. Følgelig tror vi inngangs elektriske strøm forblir stabil i løpet av electrotaxis testing, og det elektriske felt i electrotactic kamre i MDF chip overvåkes av seriekoblet amperemeter.

Undersøkelse av electrotaxis av lungekreftceller ved hjelp av MDF microfluidic system

Den electrotactic regulering av Rho-assosiert coiled-spole kinase (ROCK) har blitt påvist i kinesisk hamsterovarie (CHO), 20 endothelial, 21 og nerveceller 22, men har ennå ikke blitt undersøkt for lungekreft calen. Derfor ROCK inhibitor, Y27632, ble påført på MDF mikrofluidsystem for å studere dens effekt på electrotaxis av lungekreftceller. Som vist i figur 4, behandling av Y27632 viste ingen effekt i å endre cellemigreringshastigheten med eller uten elektrisk stimulering. Men bruk av Y27632 til kreftceller i henhold DCEF (300 mV / mm) betydelig redusert sin anode migrasjon. Ved 50 uM konsentrasjon, den ROCK inhibitor eliminert den anodiske bevegelse av lungekreftceller, men påvirket ikke deres migreringshastighet. Dessuten var det en doseavhengig sammenheng mellom de påførte kjemiske konsentrasjoner og den directedness indeksen (figur 4B). Disse resultatene tyder på at MDF mikrofluidsystem er pålitelig og effektiv for å studere electrotaxis.

Figur 1
Figur 1. Design av MDF-brikken. (A) Skjematisk tegning av MDF chip. MDF-enheten består av fire lag med akrylplater (72 x 50 mm), 13 akryl adaptere (10 × 10 × 6 mm), dobbeltsidig tape, og et dekkglass (24 × 60 mm). Tykkelsen av det lag 2 akryl ark er 2 mm, og de andre tre lagene er hver 1 mm. I de lavere tre akryl lag, er saltbroen og mellomflytnettverk representert ved de blå og røde blokkene, henholdsvis. I det første akryl ark laget, ble grønne akryl adaptere som brukes for injeksjon av agarose. Blå akryl- adaptere ble brukt som forbindelse til Ag / AgCl-elektroder. Det er fire cellekulturkamre i MDF-brikken. Arealet og høyden av hver cellekulturkammer er 148 mm 2 (3 x 46 mm) og 0,07 mm, respektivt. De små blå kanaler på Lag 3 og 4 koble salt broen nettverket til de kultur kamre. Tverrsnittet av disse forbindelseskanaler er 0,25 mm et al., 8 copyright 2014, American Institute of Physics). (B) Fotografi av alle komponenter i MDF enhet forsamlingen den, bestående av PMMA ark, akryl adaptere, dobbeltsidig tape og dekkglass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. MDF chip fabrikasjon og montasje prosesser. (A) Mønstrene av akryl ark og dobbeltsidig tape ble beskrevet av CO 2 laser maskinering. (B) De individuelle akrylplate med sjikt ble fremstilt av en CO 2 laser i henhold til design tegningen. (C) Den rensede akryl arks ble bundet sammen ved hjelp av en termisk bønder. (D) Fullført MDF chip montering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. System for electrotaxis studien. (A) Skjematisk diagram av systemet for electrotaxis eksperimentet. Rørene som er koblet til MDF-brikken ble brukt for mellomstore infusjon og avfall effluks. Den DCEF i brikken ble gjennomført gjennom Ag / AgCl elektroder og strømforsyning. Oppsett enheten ble installert på XYZ motor fasen av et mikroskop. Celle bilder i brikken ble tatt av et kommersielt digitalt speilreflekskamera. (B) Fotografi av komponentene av mediumstrømmen nettverket og DCEF generering i MDF mikrofluidsystem, inkluding (i) røret kontakt, (ii) åpne bunnet Mikrosentrifugerør, (iii) hvitt fast for hånd mutter, (iv) gjennomskinnelig rørformet finger-tight mutter, og (v) Ag / AgCl elektroder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Effekt av Y27632 på lungekreft cellemigrering under EFS av (A) lik null, og (B) 300 mV / mm. DCEF stimulering ble påført etter en time en forbehandling med den angitte konsentrasjon av Y27632. Den elektriske stimuleringen varte i 2 timer. Den kvantitative analysen av directedness og hastigheten på cellemigrering consititute et representativt eksperiment. 90-100 celler ble anvendt i dataanalysen. * for p <0,001. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik avgjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi fant prosessen med å følge akryl adaptere på Layer 1 av MDF chip for å være vanskelig. Anvendelsen av bare 1 til 2 mL av superlim er tilstrekkelig til fast følge adapteren på MDF chip. Større mengder lim resulterte i en ufullstendig polymerisasjon av superlim og unnlatelse av å følge. Når akryl adaptere ble godt festet på MDF chip, sjelden skjedde væskelekkasje i microfluidic system. I tillegg O / N inkubasjon inne i vakuumkammeret bidratt til å fjerne luft fanget mellom dobbeltsidig tape / cover glass eller dobbeltsidig tape / akryl ark grensesnitt. Følgelig forbedrer denne prosessen stabiliteten av kulturen kammer i MDF brikken.

Temperaturkontroll av 3% agarose under fremstillingen av saltbroen nettverket er viktig. Hvis temperaturen av agarose er ikke høy nok i løpet av injeksjonen, vil agarose raskt størkner inne i sprøyten og ikke kanbli injisert i saltbro nettverket. Videre under agarose injeksjon, er det viktig å unngå bobledannelse i saltbroen nettverket. Tilsynekomsten av bobler i stor grad øker den elektriske motstanden til nettverket og fører til eksperimentelle feil. I tillegg, når agarosen stivner under injeksjonen, kan det ikke fullstendig blokkere væskestrømmen i saltbro kanalen. Som sådan, kan kjemikalier så lett lekker ut i andre kanaler. Den beste tilnærmingen er å injisere varmt agarose inn i nettverket, og deretter la agarose å stivne inne i salt bro kanaler.

Celleinjeksjon er en kritisk prosess i electrotaxis forsøket. For å sikre et tilstrekkelig antall celler for celle seeding i dyrkningskammeret, injiserte vi overskytende antall celler. I denne tilnærmingen, ble cellene injisert fra stikkontakten. Injeksjonshastighet må være langsom, og selv for å unngå en ujevn fordeling celle i kulturen kammeret. I tillegg, fordikanaler er isolert i MDF chip, må injeksjonen gjøres en kanal om gangen. Således er det fullstendig celleinjeksjonsprosessen tidkrevende. I fremtiden vil det være nødvendig å opprette en ekstra celle injeksjonskanal som kan samtidig implantat celler i alle fire dyrkingskamre. Denne nye fremgangsmåten vil redusere prøvevolumet, det antall celler som kreves for injeksjon, og driftstiden.

Det er flere fordeler ved å bruke akryl fremfor PDMS som materiale for fremstilling av mikrofluidanordningen. En akryl-basert enhet kan brukes direkte på en varmekilde uten en inkubator. Siden systemet ikke krever noen CO 2 forsyning, kan cellene dyrkes i et akrylbasert bio-mikrofluid chip på en vanlig invertert mikroskop med varmeapparatet. Det er lettere å ta opp celle bilder i brikken utsiden av en inkubator. Vi brukte en allment tilgjengelig kommersielt digitalt speilreflekskamera å registrere celle bildene i systemet. I tillegg er den mykeware nødvendig for programmerbar styring av kameraet er også lett tilgjengelig. Dette gjør time-lapse avbildning av cellene lett programmerbar. Derfor er kostnadene ved å bygge den bio-auto-mikrofluidopptaksbildesystem som er mye lavere enn for et kommersielt system. I motsetning til dette, ved bruk av en PDMS-baserte chip, systemet må opereres i en CO 2 inkubator. Dermed må ekstra bildeopptaksutstyr kjøpes for drift i kuvøse. Slikt utstyr er kostbart, forholdsvis plasskrevende, og opptar en stor del av den begrensede plass i cellekulturinkubator. I et annet aspekt, i forhold til prosessen med PDMS chip fabrikasjon, er lett og hurtig fremstilling av akryl mikro fl uidic chip egnet for både enheten prototyping og produksjon. Videre, sammenlignet med PDMS-basert enhet, er det akryl-baserte mikrofluid chip konstruksjonsmessig mer stabilt og mer egnet for bygging av en komplisert tredimensjonal mikrofluidnettverkssystem, som varutføres med MDF-brikken i denne studien. Den på brikken salt bro-nettverket i MDF brikken kan ikke lett fremstilles i en PDMS-basert enhet. Dette nettverket system minimerer den totale størrelsen på mikrofluid chip og gjør electrotaxis forskning enklere og raskere.

Inne i MDF chip, genererte vi bare to elektriske feltstyrker (EFS, 0 og 300 mV / mm) i hver isolert kanal. Imidlertid, MDF-brikken og med flere felt electrotactic chip, som rapportert av Huang et al., 4 deler tilsvarende kanal utforming i cellekultur regionen. Ved å endre former av kulturen kammer i MDF chip, kan flere EFSs også genereres på MDF chip. Med disse modifikasjoner, kan multiple EFSs og flere kjemikalier som benyttes i den samme testen. Følgelig kan en high throughput screening system opprettes for å undersøke electrotaxis ved hjelp av anordningen.

I ett eksperiment, er den MDF-brikken er i stand til å teste effekten avulike kjemikalier på cellene under DCEF, eller påvirkning av elektrisk stimulering på forskjellige typer celler. Det kan også være mulig å gjennomføre 20 isolerte parallelle kanaler i MDF-chip uten i særlig grad å øke størrelsen av enheten. 8. Som vist i dette arbeidet, i ett forsøk, erholdt vi en signifikant doseavhengig sammenheng mellom directedness av cellemigrering og Y27632 (figur 4). MDF-brikke med fire kanaler gir helt klart en effektiv metode for å studere electrotaxis i kreftceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM medium Gibco,Invitrogen, USA 12800-017
Fetal Bovine Serum Gibco,Invitrogen, USA 16000-044
Trypsin Gibco,Invitrogen, USA 25200-072
PBS Basic Life BL2651
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical Co 10005583
agarose LONZO, USA SeaKem LE AGAROSE
syringe Terumo 3 ml with Luer taper
3-way stopcock Nipro with Luer taper
PMMA (acrylic) HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan thickness 1mm, 2mm
acrylic adaptor KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan 1/4-28 port, 10x10x6 mm customized
nut Thermo Fisher Scientific Inc. UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Microscope cover glass Deckgläser, Germany 24x60 mm
double-sided tape 3M PET 8018
super glue 3M Scotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 detergent Franklab, France TFD4
ultrasonic steri cleaner LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonder KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan customized
CO2 laser scriber LTT group, Taiwan ISL-II
proportional-integral-derivative (PID) controller JETEC Electronics Co., Japen TTM-J40-R-AB,
K-type thermocouple TECPEL TPK-02A
4-channel syringe pump KdScientific, USA 250P
DC power supply GWInstek, Taiwan
X-Y-Z motor stage TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan customized
inverted microscope Olympus, Japan CKX41
digital SLR camera Canon, Japan 60D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  2. Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
  3. Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
  4. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  5. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
  6. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
  7. Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
  8. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
  9. Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
  10. Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
  11. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
  12. Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
  13. Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
  14. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  15. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
  16. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
  17. Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
  19. Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
  20. Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
  21. Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
  22. Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).

Tags

Bioteknologi akryl microfluidic electrotaxis lunge adenokarsinom samtidig kjemisk / elektrisk effekt polymethylmethacrylate PMMA
Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J.… More

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (106), e53340, doi:10.3791/53340 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter