Abstract
Het gedrag van gerichte celmigratie onder een gelijkstroom elektrisch veld (dcEF) wordt genoemd electrotaxis. De belangrijke rol van fysiologische dcEF in het begeleiden cel beweging tijdens embryonale ontwikkeling, celdifferentiatie en wondgenezing is aangetoond in vele studies. Door het toepassen van microfluïdische chips met een electrotaxis assay, wordt het onderzoek proces verkort en experimentele fouten worden geminimaliseerd. In de afgelopen jaren, microfluïdische inrichtingen van polymere stoffen (bijvoorbeeld polymethylmethacrylaat, PMMA of acryl) of polydimethylsiloxaan (PDMS) zijn op grote schaal gebruikt bij het bestuderen van de reacties van cellen op elektrische stimulatie. Anders dan de talrijke stappen vereist om een PDMS apparaat fabriceren, de eenvoudige en snelle opbouw van de acryl- micro fl uidic chip maakt het geschikt voor zowel inrichting prototyping en productie. Geen van de vermelde inrichtingen vergemakkelijken efficiënte studie van gelijktijdige chemische en DCEF effecten op cellen. In dit verslag beschrijven we ons ontwerp en fabricage van een acrylbasis multichannel dual-elektrisch-veld (MDF) chip om het gelijktijdige effect van chemische en elektrische stimulering van longkankercellen onderzoeken. De MDF-chip biedt acht combinaties van elektrische / chemische stimulaties in een enkele test. De chip niet alleen sterk verkort de vereiste experimentele tijd, maar verhoogt ook de nauwkeurigheid in electrotaxis studies.
Introduction
Het gedrag van hechtende cellen bewegen naar een anode en kathode onder een gelijkstroom elektrisch veld (dcEF) wordt genoemd electrotaxis. De electrotactic gedrag van cellen speelt een belangrijke rol bij embryogenese, zenuwregeneratie en wondgenezing. 1 Tumorcellen zoals ratten prostaatkankercellen, borstkankercellen 2, 3 en longadenocarcinoom cellen 4-8 gebleken electrotactic beweging onder een aangebrachte dcEF . De fysiologische EF is gemeten klier weefsels. 9,10 Electrotaxis is ook gerapporteerd in klier-geassocieerde tumorcellen. 2,3 genomen samen de electrotaxis van kankercellen wordt beschouwd als een metastase factor. 11 beheersen van de elektrische leiding van kankercellen onder dcEF kan een potentiële benadering voor de toekomstige behandeling van kanker. Echter, vandaag de gedetailleerde moleculaire mechanisme van electrotaxis blijft controversieel. Daarom is een onderzoek naar de influence van elektrische stimulatie op kankercel migratie kan de ontwikkeling van strategieën voor de behandeling van kanker te vergemakkelijken.
Recent zijn bio-microfluïdische inrichtingen vervaardigd voor het bestuderen van cellulaire reacties op schuifkracht stroomt, 12 chemische gradiënten, 13 en elektrische stimuli 4 in vitro. De vervaardiging van bio-microfluïdische apparaten met polydimethylsiloxaan (PDMS) of polymethylmethacrylaat (PMMA, ook bekend als acryl) met succes verlaagd percentage mislukkingen van dergelijke experimenten. Bovendien gebruiken acrylbasis microfluïdische inrichtingen als een prototype voor het onderzoeken van biologische onderwerpen is eenvoudiger dan het gebruik PDMS chips. Verschillende functies acrylbasis inrichtingen ontwikkeld voor electrotaxis studie. Echter, geen van deze ontwerpen kunnen gelijktijdig testen van de effecten van verschillende chemische omstandigheden en het elektrisch veld op cellen electrotaxis studie. Zo ontwikkelden we een microfluïdische apparaat-de multichannel dual-elektrische veld (MDF) chip met vier onafhankelijke cultuur kanalen en acht verschillende experimentele condities in een chip.
De acrylbasis MDF chip, eerst beschreven door Hou et al., 8 integreert elektrische stimulatie en verschillende chemisch gescheiden kanalen. Deze chemisch gescheiden kanalen kan worden gebruikt om de cultuur verschillende typen cellen in een experiment. De dcEF in de kanalen wordt geproduceerd door een elektrische voeding. Twee onafhankelijke elektrische velden, één met toegepaste elektrische veldsterkte (EFS) en een andere met 0 EFS, worden uitgevoerd in elk chemisch geïsoleerde kanaal. Op deze manier wordt de chip levert beter gecontroleerde coëxisteerende EF en chemische stimulatie. Bovendien, de resultaten van de numerieke simulatie van de chemische diffusie in de MDF-chip aan te geven dat er geen kruisbesmetting plaatsgevonden tussen de kanalen na een 24 uur experimentele periode. 8
Vergeleken met de Device beschreven door Li et al., 14 MDF chip levert een grotere cultuur gebied, waardoor verdere biochemische analyse van de elektrisch gestimuleerde cellen. Bovendien, met grotere observatiegebied MDF chip, meer cellen kunnen worden waargenomen in de test, zodat de analyse van de migratie snelheid of gerichtheid van de elektrisch gestimuleerde cellen nauwkeuriger. De enkelkanaals chip designs eerdere studies beschreven door Huang et al. 4 en Tsai et al. 15 staan slechts één type cel of chemische te testen. Echter, de MDF chip worden gebruikt om de effecten van verschillende chemicaliën op electrotaxis, evenals de effecten van elektrische stimulering van verschillende typen cellen te onderzoeken. Met andere woorden, de MDF chip maakt efficiënte studie van chemische afhankelijkheden dosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp en fabricatie van de MDF-Chip
- Teken een individuele acryllaag patroon met behulp van commerciële software, zoals AutoCAD, en sla het patroon.
- Geef je mening over het ontwerp van de vier lagen acryl plaat patroon in figuur 1A en bevestig de tussenlaag verbindingen.
- Fabriceren alle acrylplaten en de dubbelzijdige tape met behulp van laser ablatie met een CO2-laser kraspen (figuren 1B, 2A en 2B). 16
- Zet de laser kraspen en sluit de machine aan het beheersen van de laptop.
- Voer de commerciële software en open de patroon ontworpen in stap 1.1 door te klikken op "ontworpen patroon bestand."
- Leg een stuk blanco acryl plaat of dubbelzijdig tape op de XYZ stadium van de laser kraspen.
- Stel de focus van de laserstraal op het oppervlak van de acrylplaat of dubbelzijdig plakband met een auto-alignment stok die door de fabrikant van de laser kraspen.
- Stuur het ontworpen patroon om de laser kraspen voor directe bewerking van de acryl plaat of dubbelzijdig tape.
- Verwijder het beschermende papier uit de acrylplaten behulp van een tang en blaas het oppervlak schoon met stikstofgas.
- Stapel de acrylplaten en hechten ze samen onder een druk van 2 kg / cm 2 in een thermische bonder gedurende 45 minuten bij 110 ° C om de stroom / elektrische stimulatiekanaal samenstel.
- Bereid de microscoop dekglas als de celkweek substraat in de chip.
- Plaats het deksel glas in een kleuring pot en vul de pot met een tienvoudige verdunning van het wasmiddel in het materiaal lijst vermeld.
- Plaats het deksel glas en vlekken pot in een ultrasoon Steri-reiniger en reinig het deksel glas voor 15 min.
- Giet de verdunde reinigingsmiddel uit de vlekken pot, vul de pot met gedestilleerd water, en herhaal stap 1.5.2 3 keer.
- Droog de gereinigde dekking van glas door te blazen met stikstofgas voor het naleven naar de dubbelzijdige tape.
- Hechten de gereinigde dekking van glas om de stroom / elektrische stimulatie kanaal montage met dubbelzijdige tape patroon in stap 1.2.
- Houden 13 stuks van acryl adapters aan de individuele openingen in Laag 1 van de MDF-chip assemblage met superlijm. De MDF chip assemblage is dan voltooid (figuur 2D).
- Steriliseer totale MDF chipeenheid met 30 min UV bestraling vóór gebruik.
2. Instellen van de Salt Bridge Network van de MDF-Chip
- Voor gebruik steriliseren alle kunststofbuizen handvast noten en microcentrifugebuizen figuur 3B door een houdtijd van 15 minuten bij 121 ° C in de autoclaaf.
- Sluit de fluorkunststof buizen (figuur 3B-i) aan de MDF-chip assemblage via het medium inlaaten uitlaat adapters weergegeven in figuur 1A.
- Sluit de Luer versmalling van het medium en uitlaat kunststofbuizen in figuur 3B-i om de 3-weg kranen.
- Neem 2,5 ml van CO 2 -equilibrated fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een spuit 3 ml en sluit de spuit aan de 3-weg kraan van de inlaat kunststofbuis. Sluit een lege 3 ml spuit om de 3-weg kraan van de uitlaat kunststofbuis. De twee spuiten zijn dus met elkaar verbonden via de MDF chip.
OPMERKING: Incubeer de PBS in de 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator O / N te verkrijgen CO 2 -equilibrated PBS. - Dicht de openingen van de blauwe en groene adapters (figuur 1A) op de laag 1 PMMA plaat met witte vaste hand vast moeren (figuur 3B-iii).
- Vul het zout brug kanalen en cultuur kamers met de CO 2 -equilibrated PBS in de in de setup stap 2.4 beschreven spuit. Vermijdenblaasvorming.
- Vervolgens zet de CO 2 -equilibrated PBS-bevattende MDF chip in de 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator voor O / N incubatie. Hierdoor kan de opgeloste lucht in de dubbelzijdige tape om bellen in de kamers te vormen.
- Wegspoelen de bubbels in de kanalen door een snelle PBS stroming in het kanaal met behulp van de twee spuiten. Pomp de PBS heen en weer, indien nodig.
- Laat de PBS in de kanalen via de 3-weg kraan aangesloten op het medium afvoerbuis.
- Met een nieuwe 3-ml injectiespuit, neem 2,5 ml van CO 2 -equilibrated Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (zie stap 3,5) en plaats de spuit verbonden met de inlaat door de nieuwe. Vul de kanalen met het medium.
- Bereiding van het zout brug netwerk.
- Tijdelijk verwijdert de vaste moeren (figuur 3B-iii) op de groene adapters (figuur 1A) en injecteer 3% heet (> 70 ° C) agarose in de zoute bridge kanaal door de opening in de groene adapters (Figuur 1A).
OPMERKING: Bereiding van hete agarose: Los 1,5 g agarose poeder in 50 ml PBS. Steriliseren door een houdtijd van 20 minuten bij 121 ° C in de autoclaaf. - Stoppen met het injecteren van de agarose als de vloeistof vult driekwart van de lengte van het zout brug kanaal.
- Dicht de poriën op de groene adapters (figuur 1A) door schroeven de vaste moeren (figuur 3B-iii) na agarose injectie.
- Vervang de vaste moeren aan de blauwe adapters (Figuur 1A) met de doorschijnende buisvormige handvast moeren (Figuur 3B).
- Laad de 3% agarose voorverwarmd in de buisvormige moeren (figuur 3B-iv).
- Ag / AgCl-elektroden (figuur 3B-v) in de buisvormige moeren (figuur 3B-iv) voor het insluitenstollen van de agar.
- Tijdelijk verwijdert de vaste moeren (figuur 3B-iii) op de groene adapters (figuur 1A) en injecteer 3% heet (> 70 ° C) agarose in de zoute bridge kanaal door de opening in de groene adapters (Figuur 1A).
- Na het voltooien van de installatie van het zout brug netwerk, injecteer de CL1-5 longkanker-cellen in de cultuur kamers, één kamer per keer.
3. Voorbereiding van kankercellen en Set Up voor Electrotactic Experiment
- Regelmatige cultuur van longkanker cellijn CL1-5.
- De cultuur van de CL1-5 longkankercellen, verkregen van Prof. Pan-Chyr Yang, 17 in het compleet medium in een 75T celkweek kolf bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Het volledige medium bestaat uit DMEM en 10% foetaal runderserum (FBS). Subcultuur de cellen elke 3 tot 4 dagen. De gebruikte cellen voor het uitvoeren van experimenten electrotaxis minder dan 25 passages van de oorspronkelijke bron.
- Voeg 2 ml van 0,25% trypsine buffer om de exponentieel groeiende CL1-5 cellen en incubeer gedurende 2 min in 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator voor mobiele detachment.
- Sluit de onthechting proces met 6 ml van 10% FBS DMEM en centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij RT. Gooi dan het medium op te schorten en de celpellet met 5 ml PBS.
- Tel het aantal cellen in PBS. Bekijk dan 1 x 10 6 cellen en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 min bij RT.
- Gooi de PBS. Suspendeer de cellen met voorverwarmd CO 2 -equilibrated DMEM en pas de celdichtheid worden 1 x 10 6 cellen / ml.
OPMERKING: Incubeer de compleet medium in de 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator O / N om het CO 2 te verkrijgen -equilibrated DMEM.
4. Stel voor Electrotactic Experiment
- Vanaf de uitlaat van de MDF chip, injecteer 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, van de cellen in de chip.
- Incubeer de cel geplaatste MDF chip in de celkweek incubator (vastgesteld op 37 ° C en 5% CO2) gedurende 2-4 uur.
- Setup van MDF microvloeibare systeem.
- Installeer de MDF microfluïdische systeem op een transparante glas indiumtinoxide (ITO) verwarming. Meet de temperatuur van de chip MDF met een type K thermokoppel geklemd tussen de MDF chip en de ITO glas. De controle van de ITO verwarming met een proportionele-integrale-afgeleide (PID) regelaar. Stel de MDF microfluïdische systeem incubatietemperatuur tot 37 ° C met de PID controller.
LET OP: De fabricage van de ITO kachel en de opzet van de celkweek verwarmingsinstallatie worden beschreven in eerdere verslagen 18,19. - Monteer de temperatuurgeregelde MDF chipeenheid de computergestuurde XYZ gemotoriseerde stadium een omgekeerde microscoop. Het gebruik van de gemotoriseerde fase wordt beschreven in stap 5,1. Pomp de compleet medium in de cultuur kamers door het inlaten met een vier-kanaals injectiepomp.
- Installeer de MDF microfluïdische systeem op een transparante glas indiumtinoxide (ITO) verwarming. Meet de temperatuur van de chip MDF met een type K thermokoppel geklemd tussen de MDF chip en de ITO glas. De controle van de ITO verwarming met een proportionele-integrale-afgeleide (PID) regelaar. Stel de MDF microfluïdische systeem incubatietemperatuur tot 37 ° C met de PID controller.
- Pomp het volledige medium in de MDF chip met een stroomsnelheid van 20 pl / uur. De cultuur afval van delaat wordt opgevangen in de microcentrifugebuizen (weergegeven als "afval" in figuur 3A).
- Incubeer de cellen gedurende nog 16-18 uur bij 37 ° C in de MDF chip.
- Om het medium vervangen, pomp het medium bevattende 50, 25, 5 en 0 uM kinase inhibitor, respectievelijk in elk kweekkamer bij een stroomsnelheid van 20 pl / min gedurende 10 min.
OPMERKING: Bereid een 10 mM voorraadoplossing van de Rho-geassocieerde proteïne kinase inhibitor Y27632 door toevoeging van 3 ml steriel water om de 10,6 mg kinase remmer. Verdun de 10 mM voorraadoplossing tot 50, 25 en 5 uM, respectievelijk via 10% FBS DMEM medium. - Incubeer de cellen in het kinase remmer nog eens 60 min bij 37 ° C. Stel het medium debiet 20 ul / uur. Gebruik dezelfde cultuur temperatuur en stroomsnelheid hierboven in latere stappen.
- Gebruik elektrische draden van een DC voeding aan te sluiten op de MDF chip via de Ag / AgCl elektroden op de chip.
- Serieel sluit een ampèremeter in het elektrische circuit. Gebruik de ampèremeter om de elektrische stroom in de MDF chip te controleren.
- Schakel de DC-voeding en stel de ampèremeter stroom 86,94 uA door aanpassing van de voedingsspanning tot tussen 15 en 19 V.
OPMERKING: Gezien de wet van Ohm, E = I / (σA eff), waarin I de elektrische stroom die door het stortgoed, dat wil zeggen het kweekmedium in de electrotactic kamer, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) de geleidbaarheid van het kweekmedium, A eff (= 0,21 mm 2 voor een 3 mm breed x 0,07 mm hoogte) is de effectieve doorsnede van de electrotactic kamer en de elektrische stroom (I) vereist om een 300 mV / mm genereren EF in de MDF-chip is 86,94 uA.
5. Verwerving en Analyse van de Cel Afbeeldingen
- Controle van de gemotoriseerde fase met behulp van een MATLAB GUI-programma. Met het MDF microfluïdische gemonteerd op de Micrpe, bewegen de chip naar de observatie regio's met behulp van de gemotoriseerde podium.
- Record cel beelden met behulp van een digitale single-lens reflex (SLR) camera gemonteerd op de microscoop.
- Neem microscopische beelden met een 4x objectief met tussenpozen van 15 min gedurende 2 uur.
- Celmigratie analyse.
- Run NIH ImageJ 1,47 V.
- Analyseer de afstand van de eerste naar de laatste positie van het zwaartepunt van de cel.
- Ga naar "Bestand" → "Import" → "Afbeelding Sequence 'en importeren negen beelden voor celmigratie analyse. Het eerste beeld is het resultaat nul tijd, en het laatste beeld is het resultaat van 120 min.
- Ga naar "Analyseren" → "Metingen" en vink het vakje naast "Zwaartepunt"
- Klik op het icoon "Freehand Selecties".
- Tonen de rand van de geselecteerde cellen in het eerste beeld.
- Ga naar "Edit" → "Selection" → "Aan Manager"
- Naar het negende afbeelding en tonen de rand van dezelfde cellen geselecteerd op de eerste afbeelding. De cel posities kunnen worden opgespoord met behulp van de tweede naar de achtste beelden.
- Ga naar "Edit" → "Selection" → "Aan Manager"
- Herhaal de stappen 5.4.5 tot 5.4.9 gegevens van 90 tot 100 cellen te verzamelen.
- Ga naar "Analyze" → "Measure" het resultaat van de begin- en eindposities van de geselecteerde cellen te verkrijgen.
OPMERKING: De migratie snelheid wordt gedefinieerd als de gemiddelde cel beweging lengte per uur. De gerichtheid wordt gedefinieerd als cosinus, waarbij de hoek tussen de vector van de dcEF (van anode naar kathode) en de vector van het startpunt van een cel zijn eindpositie. De gerichtheid is -1 op cellen migreren naar de anode en 1 op cellen migreren naar de kathode. Voor een groep van willekeurig miraspen cellen, de gerichtheid 0. 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabricage en assemblage van de MDF-apparaat
Een schematisch diagram van de acrylbasis MDF chip wordt getoond in figuur 1A. Vier acryl platen, een dekking van glas, 13 acryl adapters, en een stukje dubbelzijdige tape werden gebruikt bij de assemblage van de voltooide MDF chip (Figuur 2D). Er zijn slechts vier onafhankelijke kanalen cultuur in de MDF apparaat. De on-chip zoutbrug netwerk creëert acht verschillende experimentele omstandigheden in acht segmenten van de chip. Drie zoutbruggen (de blauwe kanalen in Layer 2 van Figuur 1A), 79, 90 en 80 mm lang, werden gekoppeld met de tweede laag van de MDF chip zonder interferentie met de beeldwaarneming. De kleine poriën (blauwe balk kanalen in lagen 3 en 4 van figuur 1A) tussen zoutbrug netwerk en de cultuur kabinet, een 00,25 mm 2 doorsnede gebied, geminimaliseerd de vloeistof flux in het zout brug tijdens het experiment. De cultuur gebied van de MDF chip ongeveer 74 mm 2 in elk segment. In deze demonstratie, zijn de celkweek kamers van de MDF-apparaat bestaat uit de 70 micrometer dikke dubbelzijdige tape en deksel glas. Indien verschillende omstandigheden celkweek (bijvoorbeeld een collageenbekleding vereiste lage afschuiving stroom of grote kweekmedium volume in de kweekkamer) is nodig voor electrotaxis onderzoek, zowel de cultuur substraten en de banden gemakkelijk kunnen worden vervangen. Daarom kunnen verschillende soorten cellen worden gebruikt voor electrotaxis studie binnen de MDF-chip.
Configuratie van MDF microfluïdische systeem
Het MDF microfluïdische systeeminstellingen wordt geïllustreerd in figuur 3A. De in figuur 3B componenten used tot middelgrote stroom en de elektrische huidige netwerk in de MDF microfluïdische systeem. De buizen verbonden met de holle handvast moeren (rood en groen) en Luer taps (bruin) in figuur 3B-i worden gebruikt om medium te vervoeren naar de MDF stroom netwerk. Na het spuiten waren aangesloten op de Luer kaarsen en vestigden zich op de vier-kanaal pomp, de pijpleiding stroom systeem compleet was. Kweekmedium en afval worden vervoerd door de pijpleiding systeem. Omdat de verbinding tussen de buizen en acryl adapters worden vastgemaakt door schroeven connectors kan de MDF middel netwerk hogere hydraulische druk dan kan het PDMS systeem tolereren. Vanwege de extreem lage luchtdoorlaatbaarheid van de acrylplaten en de buisjes wordt elk contact tussen het middel netwerk en de buitenomgeving geblokkeerd. Daarom is de pH van het medium in het systeem blijft stabiel en cellen kunnen worden gekweekt met het MDF microfluïdische systeem buiten een CO2 incubator. Omdat de MDF chIP is geïnstalleerd op een gemotoriseerde stadium kan time-lapse celbeelden worden genomen uit acht afzonderlijke secties. De open bodem microcentrifuge buisjes (figuur 3B-ii) worden de doorzichtige buisvormige hand vast gemonteerde moeren (figuur 3B-iv) de volumecapaciteit van agarose vergroten. Zo kunnen relatief grote elektroden worden ingebracht in de agarose stabiele elektrische stimulatie van de cellen gedurende langere tijd.
Generatie aangegeven gelijkstroom elektrisch veld in de MDF-chip
De spanning van elke kamer kan worden gemeten via de geïmplanteerde elektroden in het elektrische circuit aangesloten chip. Maar, we hebben niet de spanning in de kamer te meten. Integendeel, we gesimuleerd het elektrische veld zoutbrug netwerk en de celkweek kamers van de chip. Vier electrotactic kamers waren serieel conaangesloten in de elektrische circuits. Op deze wijze wordt dezelfde elektrische stroom gehandhaafd elk van deze kamers. Volgens de wet van Ohm, de EFS correleert met de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de kamers in het microfluïdische apparaat. Bovendien, alle PMMA platen en tapes werden gefabriceerd door de CO 2 laser kraspen. De uitlijning van de chip assemblage stukken is nauwkeurig en de structurele gebreken van de chip zijn minimaal. Aldus zullen EFS in elke kamer stabiel blijven. Het elektrische veld simulatieresultaten tonen een homogene verdeling van EFS met 300 en 0 mV / mm in de eerste helften en de resterende helften van de kweek kamers in de inrichting (data niet getoond). Eerder, meldt uit ons lab, Huang et al. en Tsai et al., hebben aangetoond dat het verschil in de gemeten en gesimuleerde EFS waarden minder dan 4%. 4,15 Dit resultaat toont aan dat, in het systeem, de gemeten elektrische veld komt goed overeen met de gesimuleerde waarde. In dit work, hebben wij een grote Ag / AgCl elektroden op stabiele elektrische stroom te leveren voor een langdurig experiment. De toegepaste stroom op de MDF-chip daalde slechts 1,85 ± 0,19% na 7 uur van EF stimulatie in de electrotaxis experimenten. Bovendien is de langste periode van elektrostimulatie werd 4 uur in onze studie. Dus, wij geloven dat de ingang elektrische stroom blijft stabiel tijdens electrotaxis testen, en het elektrische veld in de electrotactic kamers van de MDF-chip worden gecontroleerd door de serie verbonden stroommeter.
Onderzoek naar de electrotaxis van longkanker cellen met de MDF microfluïdische systeem
De electrotactic regulering van Rho-geassocieerde coiled-coil kinase (ROCK) is aangetoond in Chinese hamster ovarium (CHO), 20 endotheliale 21 en neuronale cellen 22 maar nog niet onderzocht voor longkanker cells. Daarom is de ROCK inhibitor, Y27632, werd op de MDF microfluïdische systeem zijn effect op de electrotaxis van longkanker cellen te bestuderen. Zoals getoond in figuur 4, de behandeling van Y27632 toonde geen effect bij het veranderen van de celmigratie snelheid of zonder elektrische stimulatie. De toepassing van Y27632 kankercellen onder dcEF (300 mV / mm) aanzienlijk verminderd zijn anodisch migratie. Bij 50 uM concentratie ROCK inhibitor elimineerde de anodische beweging van longkankercellen maar had geen invloed op de migratie snelheid. Bovendien was er een dosisafhankelijke relatie tussen de aangebrachte chemische concentraties en de directheid index (Figuur 4B). Deze resultaten suggereren dat de MDF microfluïdische systeem betrouwbaar en efficiënt voor het bestuderen electrotaxis.
Figuur 1. Design van de MDF-chip. (A) Schematische tekening van de MDF-chip. De MDF-apparaat bestaat uit vier lagen van acryl platen (72 x 50 mm), 13 acryl-adapters (10 × 10 × 6 mm), dubbelzijdige tape, en een deksel glas (24 × 60 mm). De dikte van de laag 2 acrylplaat is 2 mm en de drie overige lagen zijn elk 1 mm. In de onderste drie lagen acrylaat, de zoutbrug en mediumstroom netwerken worden weergegeven door de blauwe en rode blokken, respectievelijk. In de eerste acrylplaat laag, werden groene acryl adapters voor de injectie van agarose. Blauw acryl adapters werden gebruikt als de verbinding met de Ag / AgCl-elektroden. Er zijn vier celkweek kamers in de MDF-chip. De stippellijn hoogte van iedere celkweekkamer zijn 148 mm 2 (3 x 46 mm) en 0,07 mm respectievelijk. De kleine blauwe kanalen op de lagen 3 en 4 sluit de zoutbrug netwerk om de cultuur kamers. De doorsnede van deze verbinding kanalen is 0,25 mm
Figuur 2. MDF chip fabricage en assemblage processen. (A) De patronen van de acrylplaat en dubbelzijdige tape werden beschreven door CO 2 laser bewerking. (B) De individuele acrylplaat lagen werden vervaardigd door een CO2 laser volgens de ontwerptekening. (C) De gereinigde acrylplaats werden gebonden samen met behulp van een thermische bonder. (D) Afgesloten MDF chip assemblage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Systeem voor electrotaxis onderzoek. (A) Schematische weergave van het stelsel electrotaxis experiment. De buizen aangesloten op de MDF-chip werden gebruikt voor middelgrote infusie en afval uitstroom. De dcEF in de chip werd uitgevoerd door middel van de Ag / AgCl elektroden en voeding. De setup apparaat werd op de XYZ motor fase van een microscoop geïnstalleerd. Cel beelden in de chip werden genomen door een commerciële digitale SLR camera. (B) Foto van de bestanddelen van de mediumstroom netwerk en dcEF generatie MDF microfluïdische systeem, incluDing (i) de buis connector, (ii) open bodem microcentrifugebuizen, (iii) witte vaste handvast moer, (iv) doorzichtige buisvormige handvast moer, en (v) Ag / AgCl elektroden. Klik hier om bekijk een grotere versie van deze figuur.
Figuur 4. Effect van Y27632 aan longkanker celmigratie onder EFS van (A) nul en (B) 300 mV / mm. DcEF stimulatie werd toegepast na een 1 uur voorbehandeling met de aangewezen concentratie Y27632. De elektrische stimulatie duurde 2 uur. De kwantitatieve analyse van de gerichtheid en de snelheid van celmigratie consititute een representatief experiment. 90-100 cellen werden gebruikt in de data-analyse. * P <0,001. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardfout vanhet gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We vonden dat het proces van hechtende acryl adapters op Laag 1 van de MDF-chip lastig te zijn. De toepassing van slechts 1 tot 2 pl superlijm voldoende stevig hechten van de adapter op de MDF chip. Grotere hoeveelheden lijm leidde tot een onvolledige polymerisatie van superlijm en niet hechten. Zodra het acryl adapters stevig werden vastgehouden op de MDF-chip, vloeistof lekkage in de microfluïdische systeem zelden voorgekomen. Daarnaast, O / N incubatie in de vacuümkamer hielp om de lucht gevangen tussen de dubbelzijdige tape / dekking van glas of dubbelzijdig tape / acryl plaat-interface verwijderen. Bijgevolg is dit proces verbetert de stabiliteit van de kweekkamer in de MDF chip.
Temperatuurregeling van de 3% agarose tijdens de bereiding van de zoutbrug netwerk belang. Als de temperatuur van de agarose niet hoog genoeg is tijdens de injectie, de agarose snel stollen binnen de spuit en kan nietworden geïnjecteerd in de zoutbrug netwerk. Bovendien, tijdens agarose injectie, is het belangrijk om bellenvorming in de zoutbrug netwerk voorkomen. Het verschijnen van bellen verhoogt de elektrische weerstand van het netwerk en leidt tot experimentele fout. Bovendien, zodra de agarose stolt tijdens de injectie, kan niet volledig blokkeren vloeistofstroom in de zoutbrug kanaal. Als zodanig kunnen de chemicaliën dan gemakkelijk lekken in andere kanalen. De beste aanpak is om warm agarose injecteren in het netwerk en laat vervolgens de agarose te stollen in de zoutbrug kanalen.
Celinjectie is een kritisch proces in de electrotaxis experiment. Om voldoende cellen voor het zaaien van cellen in de kweekkamer garanderen, geïnjecteerd overmaat aantal cellen. In deze benadering werden cellen geïnjecteerd uit de uitlaat. De injectiesnelheid moet langzaam en zelfs tot een ongelijke verdeling van de cel kweekkamer voorkomen. Bovendien, omdat dekanalen worden geïsoleerd in de MDF chip moet de injectie worden uitgevoerd één kanaal tegelijk. Aldus totale celinjectie proces is tijdrovend. In de toekomst zal het noodzakelijk zijn een extra celinjectie kanaal maken die tegelijkertijd implantaat cellen in vier kamers cultuur. Deze nieuwe werkwijze zal monstervolume, het aantal cellen vereiste voor injectie, en de bewerking te verminderen.
Er zijn verschillende voordelen bij het gebruik van acryl plaats PDMS als materiaal voor het vervaardigen van het microfluïdische apparaat. Een acrylbasis inrichting kan direct op een verwarming worden bediend zonder incubator. Aangezien het systeem vereist geen CO 2 toevoer kunnen cellen worden gekweekt in een op acryl gebaseerde bio-microfluïdische chip op regelmatige omgekeerde microscoop met de kachel. Het is gemakkelijker om celbeelden op de chip opnemen buiten een incubator. We gebruikten een alom beschikbare commerciële digitale SLR camera om de cel te beelden in het systeem op te nemen. Bovendien is de zachtewaren noodzakelijk programmeerbare besturing van de camera is ook gemakkelijk beschikbaar. Dit maakt time-lapse beeldvorming van de cellen eenvoudig te programmeren. Daarom is de kosten van de bouw van de bio-microfluïdische automatische opname beeldsysteem is veel lager dan die van een commercieel systeem. Daarentegen, bij gebruik van een PDMS-gebaseerde chip, het systeem moet worden geplaatst in een CO2 incubator. Zo moet extra beeldopname apparatuur worden aangeschaft voor gebruik in de couveuse. Dergelijke apparatuur is duur, relatief omvangrijk en beslaat een groot deel van de ruimte in de celkweek incubator. In een ander aspect, in vergelijking met het proces van PDMS-chips, de gemakkelijke en snelle vervaardiging van acryl micro fl uidic chip is geschikt voor zowel inrichting prototyping en productie. Bovendien, vergeleken met de PDMS-apparaat, de acrylbasis microfluïdische chip qua structuur stabieler en meer geschikt voor het construeren van een gecompliceerde driedimensionale microfluïdische netwerksysteem, net alsuitgevoerd met de MDF chip in deze studie. De on-chip zoutbrug netwerk in de MDF chip kan niet gemakkelijk worden geproduceerd in een PDMS-apparaat. Dit netwerksysteem minimaliseert de totale omvang van de microfluïdische chip en maakt electrotaxis onderzoek makkelijker en sneller.
Binnen in de MDF-chip, genereerden we slechts twee elektrische veldsterkte (EFS, 0 en 300 mV / mm) in elke geïsoleerde kanaal. Echter, de MDF-chip en de multi-veld electrotactic chip, zoals gerapporteerd door Huang et al., 4 delen een vergelijkbaar kanaal ontwerp in de celkweek regio. Door het veranderen van de vormen van de kweekkamer in de MDF chip kunnen meerdere EFSs worden gegenereerd op MDF chip. Met deze wijzigingen kunnen meerdere EFSs en meerdere chemische stoffen worden gebruikt in dezelfde test. Dienovereenkomstig kan een hoge doorvoer screening systeem gecreëerd om electrotaxis gebruik van de inrichting te onderzoeken.
In één experiment werd de MDF chip is geschikt voor het testen van de effecten vanverschillende chemicaliën op cellen onder dcEF of de invloeden van elektrische stimulatie op verschillende soorten cellen. Het kan zelfs mogelijk zijn om 20 geïsoleerde parallelle kanalen in de MDF chip te voeren zonder aanzienlijke verhoging van de grootte van de inrichting. 8 Zoals in dit werk in één experiment kregen we een significante dosis-afhankelijke relatie tussen de gerichtheid van celmigratie Y27632 (Figuur 4). De MDF chip met vier kanalen biedt duidelijk een efficiënte aanpak voor het bestuderen electrotaxis in kankercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
