Abstract
Met behulp van kippenembryo's is het mogelijk om direct de effecten van beide groeifactoren of specifieke remmers van signaaltransductiewegen op genexpressie en activering van signaaltransductieroutes testen. Deze techniek maakt de afgifte van signaalmoleculen op exact gedefinieerde ontwikkelingsstadia specifieke tijden. Na deze embryo's kunnen worden geoogst en genexpressie onderzocht, bijvoorbeeld door in situ hybridisatie, of activering van signaaltransductieroutes waargenomen met immunokleuring.
In deze video heparine kralen gedrenkt in FGF18 of AG 1-X2 kralen gedrenkt in U0126, een MEK-inhibitor, worden geënt in de ledematen kiem in ovo. Hieruit blijkt dat FGF18 induceert expressie van MyoD en ERK fosforylatie en zowel endogene als FGF18 MyoD geïnduceerde expressie wordt geremd door U0126. Kralen gedrenkt in een retinoïnezuur antagonist kan voortijdige MyoD inductie versterken door FGF18.
Deze aanpak kan onsed met een groot aantal verschillende groeifactoren en remmers en wordt gemakkelijk aangepast aan andere weefsels in het ontwikkelende embryo.
Introduction
Aviaire embryo's een krachtig hulpmiddel voor de studie van ontwikkeling bedoeld jaren 1. Een van hun meest nuttige eigenschappen is dat ze relatief gemakkelijk te manipuleren. Externe ontwikkeling maakt het mogelijk om het ei te openen om het embryo en uitvoeren van verschillende micromanipulations met voorbeelden zoals de klassieke kwartel-chick chimera voor het bestuderen lot van de cel 2,3, de injectie van retrovirussen voor overexpressie in specifieke weefsels tijdens de ontwikkeling 4,5 en explantatie cultuur ontwikkelingsstoornissen signalering bronnen 6 identificeren. Meer recent hersenschimmen gegenereerd tussen ongelabelde gastheren met enten van een transgene kippen lijn die GFP heeft aangetoond dat de combinatie van klassieke enten en genetische modificatie belangrijke inzichten kunnen geven in de ontwikkeling van 7,8.
Het gemak waarmee het aviaire embryo kan worden gemanipuleerd heeft gemaakt een uitstekend model voor de studie ledematenontwikkeling 9. Toepassing van specifieke groeifactoren aan de ontwikkeling van ledematen in vivo is behulpzaam geweest bij het identificeren van factoren die ledematen patronen 10,11 veranderen en blijft om inzicht te geven in dit proces 12 geweest. Deze aanpak is ook gebruikt om de factoren die spierontwikkeling regelen bestuderen en heeft rollen voor diverse signalen zoals Wnts 13, BMP's 14 en 15 HGF blootgelegd.
Recent werd deze techniek gebruikt om de signalen te besturen myogene genexpressie in de ledemaatknop onderzoeken en blijkt dat de interacties tussen FGF18 en retinoïnezuur het tijdstip van MyoD expressie 16 kan besturen. Met een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen die op kralen kunnen worden geladen en vervolgens direct geënt in specifieke weefsels in ontwikkelingsstadia gedefinieerde geeft de mogelijkheid om op bijna elk moment en omgeving ingrijpen tijdens de ontwikkeling. Deze is gebruikt om INVEstigate veel processen waaronder somiet patroonvorming 17,18, neurale specificatie 19, neurale lijst migratie 20 en as uitbreiding 21.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het enten korrels geweekt in beide groeifactoren of inhibitors in ontwikkelende kippenembryo ledematen. Deze is gebruikt om het effect van deze signalen op myogenesis bepalen door het analyseren spieren genexpressie met in situ hybridisatie. We beschrijven implantaten met behulp van heparine geweekte korrels, die worden gebruikt voor groeifactoren of AG 1-X2 parels voor kleine hydrofobe moleculen zoals retinoïnezuur of kleine molecule inhibitoren van specifieke signaleringsroutes. Maar andere kralen zijn ook beschikbaar, die zijn gebruikt om zowel FGF's 22 en 23 Shh leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Al deze experimenten volgen het dier zorg en ethische richtlijnen van de Universiteit van Nottingham.
1. Voorbereiding van de Heparine Kralen voor Enten
- Was heparine korrels grondig in PBS vóór gebruik. Opmerking: Parels kunnen bij 4 ° C worden bewaard als een suspensie in PBS.
- Selecteer kralen voor enten door het verwijderen van hen uit de voorraad met een 20 ul pipet in een 1 ml daling van PBS. Gebruik een micropipet ingesteld op 2 pl kralen over in een 20 ul druppel PBS in een petrischaal 3 cm. Kies kralen op basis van grootte en met behulp van een stereo dissectiemicroscoop, transfer geselecteerd kralen met een P2 pipet tip; die rond 100 micrometer diameter zijn ideaal.
- Verwijder de PBS uit de korrels. Verwijder het meeste vocht met een 20 ul pipet en de residuele vloeistof door capillaire werking met fijne horlogemakers pincet. Opmerking: Het is van belang om zoveel mogelijk te verwijderen, zodat de groei factor is niet verdund wanneer het wordt toegevoegd aan de korrels.
- Pipetteer de groeifactor direct op de korrels. Voor FGF18 voeg 0,5 ul recombinant FGF18 gereconstitueerd in 0,5 mg / ml in 0,1% BSA in PBS. Plaats enkele druppels water rond de randen van de schotel naar het verhinderen dat vloeistof verdampen.
- Incubeer de kralen voor 1 uur bij KT. Verwijder de druppels water uit de schotel met een Pasteur pipet en plaats op ijs klaar voor transplantatie.
- Indien nodig (voor transparante kralen) overdracht 4-5 kralen tot 2% fenol rood voor het enten te helpen visualiseren. Spoel in PBS alvorens naar het embryo.
2. Voorbereiding van AG 1-X2 Kralen voor Enten
- Vóór derivatiseren kraaltjes met 0,2 N mierenzuur.
- Gebruik hiervoor een spatel kralen overdracht naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml 0,2 N mierenzuur en was op een schudplateau gedurende 1 uur.
- Verwijder vervolgens de mierenzuur met een P1000 pipet en te vervangen door 1ml water. Wassen 1 uur en herhaal zesmaal resterende mierenzuur verwijderen.
- Verwijder overblijvende vloeistof met een P1000 pipet en bewaar de korrels bij 4 ° C. Opmerking: Het is niet nodig om al het restwater in dit stadium te verwijderen.
- Verwijderen van een kleine pellet van kralen van ongeveer 5-10 ul volume van de voorraad met een kleine spatel in een 3 cm petrischaal en voeg 1 ml DMSO (of een ander oplosmiddel wordt het geneesmiddel opgelost in). Opmerking: Dit moet honderden parels om die van de juiste grootte te selecteren verschaffen.
- Gebruik een pipet P2 ingesteld op 2 pl aan kralen overdracht van ongeveer 100 urn diameter een 20 ul druppel oplosmiddel in een 3 cm petrischaal.
- Verwijder oplosmiddel met een 20 ul pipet en eventuele achtergebleven oplosmiddel met 2 pi pipet. Vervang door 20 gl van het geneesmiddel aan te passen.
Opmerking: Om consistent te lossen het geneesmiddel bij een concentratie van 100 uM in DMSO (of die ooit oplosmiddel wordt gebruikt),20 pl aliquot in en bewaar bij -80 ° C als een kleine molecule inhibitoren zijn onstabiel en is het best om herhaalde vries-dooien te voorkomen. Eventueel verdun het geneesmiddel voor de gewenste concentratie voor het weken kralen. Doeltreffende concentraties moeten empirisch worden bepaald voor elk geneesmiddel. - Incubeer gedurende 1 uur. Beschermen tegen licht als veel van deze moleculen zijn gevoelig voor licht.
- Voor enten overdracht 05/04 kralen met een pipet p2 ingesteld op 2 pi in 20 gl 2% fenolrood opgelost in water. Voer deze stap met behulp van een stereo dissectiemicroscoop om de kralen te visualiseren. Verwijder een enkele kraal met fijne horlogemakers pincet of een draad lus en spoel in PBS alvorens naar het embryo. Niet parels in 2% fenolrood reactie langer dan 15 min vóór gebruik als dit verlies aan activiteit kan veroorzaken.
3. Voorbereiding Tungsten Naalden
- Snijd fijne wolfraam draad in 3-4 cm lengte. Steek een stuk draad in het uiteinde vaneen glazen Pasteur pipet en smelten in een Bunsen brander te fixeren. Bereid tot 10 naalden zodat er reserveonderdelen als ze beschadigd tijdens gebruik.
- Plaats het uiteinde van de draad in een steekvlam vlam en houd hem daar tot de wolfraam gloeit witte en de tip is scherp (ongeveer 2-3 minuten). Opmerking: Tijdens het gebruik van de naald kan worden gereinigd en opnieuw aangescherpt in de brander als dat nodig is.
OPMERKING: Deze naalden kunnen ook gebruikt worden om lussen te maken voor overdracht kralen. Zachtjes aanraken van de naald naar de bank en het zal buigen om een lus te vormen.
4. De voorbereiding van embryo's voor Bead Enten
- Broeden eieren met de stompe eind tot ze de gewenste fase (3-5 dagen voor de meeste ledematen knop manipulaties) te bereiken. Met behulp van stompe tang tik op de stomp uiteinde aan de schaal te breken en vervolgens met de tang om de schil te verwijderen en het embryo bloot te leggen. Zorg ervoor dat de eierschaal membraan wordt ook verwijderd.
OPMERKING: 1-2 ml PBS kan worden toegevoegd met een pasteurpipet te helpen metDit als het membraan vasthoudt aan de dooier. Voorzichtig pipet de PBS op het oppervlak van de dooier, het grijpen van de membraan met de tang, het verzorgen van de dooier niet te beschadigen, en trek het voorzichtig uit de buurt van het ei. - Verwijder tot 5 ml van albumine uit het ei met een spuit 10 ml en een 19 G naald. Neem slechts zoveel als nodig is om de embryo maakt contact met de cassette om het ei het verwijderen van grotere hoeveelheden afdichting embryo overleving verminderen niet te garanderen.
- Visualiseren het embryo voeg een 5-6 druppels kunstenaars india inkt 15 ml PBS met 100 U penicilline en 0,1 mg streptomycine / ml. Injecteren 0,5-1 ml direct onder het embryo met een spuit van 1 ml en een 25 G naald.
- Voeg 2-3 ml PBS met 1% foetaal kalfsserum en 100 U penicilline en 0,1 mg streptomycine / ml in het ei om het embryo niet uitdrogen garanderen. Met behulp van geslepen horlogemakers pincet verwijder de vitelline membraan en open de amnion over de ontwikkeling van ledematen. Zorg ervoor dat de embryo niet uitdroogt enIndien nodig, voeg meer PBS / FCS.
Opmerking: De ledematen is duidelijk te zien als gepaarde uitwassen op de flank van het embryo. Op deze fasen wordt het embryo slag zodanig rechts gewoonlijk boven. Daardoor gewoonlijk gemakkelijker parels enten in de juiste ledematen en gebruik de linker die als contralaterale controles. - Gebruik een scherp wolfraamdraad om een incisie te maken in de ledemaatknop wanneer de hiel wordt geïmplanteerd. Zaag niet helemaal door de ledemaatknop indien mogelijk, maar op jongere stadia dit moeilijk.
Opmerking: In oudere embryo's (HH fase 22 en hoger) is het mogelijk specifieke gebieden van de ledemaatknop selecteren voor enting maar op jongere stadia is moeilijker omdat de ledemaatknop zelf is klein. Het is ook belangrijk om te onthouden dat de ledemaatknop voorbij de geënte hiel zal groeien zo, vooral bij jonge stadia, de hiel wordt in de proximale extremiteit blijven. - Pick-up een kraal van zowel de groeifactor of drugs met behulp van extra fijn watchmakers pincet of een lus gemaakt van een wolfraam naald. Als de kraal is gedrenkt in hetzij DMSO en fenolrood, spoelen in PBS alvorens het embryo. Breng de kraal naar de embryo met de tang / draad lus. Gebruik dan de geslepen wolfraamdraad aan de korrel te voegen in de incisie.
- Voeg 1-2 ml PBS / FCS om het ei te zorgen dat het embryo gehydrateerd wordt gehouden, maar vermijd direct aanbrengen op het embryo zich als dit de embryo's kunnen beschadigen en de kraal te worden verdreven. Verzegel het ei met tape en terug naar de incubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij HH stadium 21 MyoD niet wordt uitgedrukt in ontwikkelingslanden ledematen myoblasten hoewel kleuring te zien in de myotoom van de ontwikkeling somieten (Figuur 1A). Figuur 1B toont in situ hybridisatie voor MyoD 6 uur na FGF18 kraal graft. MyoD wordt geïnduceerd in myoblasten nabij de hiel terwijl er geen expressie in de contralaterale ledemaat. Co-enten een kraal gedrenkt in U0126, een specifieke remmer van MEK, blokken FGF18 inductie van MyoD (figuur 1C). Evenzo enten een U0126 kraal bij HH stadium 21 en op zoek naar MyoD expressie na 24 uur vermindert de endogene expressie van MyoD vergelijking met de onbehandelde contralaterale ledematen (figuur 1D, E).
In ledematen bij HH stadium 19 FGF18 heeft MyoD (Figuur 1F) opwekken. Echter co-enten van korrels geweekt in FGF18 en retinoïnezuur antagonist BMS493 kan deze overwinnen en ectopische MyoD gedetecteerd (Figure 1G)
Om dat te FGF18 bevestigen handelt door middel van MEK embryo's werden geoogst 1 uur na kraal graft en immunostained voor gefosforyleerde ERK, een helderveld beeld van een FGF18 kraal 1 uur na het enten van het doelwit van MEK. Figuur 1 H toont terwijl figuur 1I toont aan dat FGF18 induceert snelle fosforylering van ERK rond het geënte kraal. Figuur 1J toont een bekleding van deze beelden. Controle kralen gedrenkt in 0,1% BSA hoeft ERK fosforylering opwekken (figuur 1 K, L, M)
Figuur 1. MyoD uitdrukking in de ledematen wordt gereguleerd door FGF18 en retinoïnezuur door de ERK fosforylering. Ongemanipuleerde controle ledematen bij HH stadium 21 hoeft MyoD (A) niet uitdrukken, maar voortijdige expressie wordt gedetecteerd 6 uur na het enten van een FGF18 kraal (B). Co-enten FGF18 en U0126 kralen blokkeert dit inductie (C). Endogene MyoD expressie wordt gezien bij HH stadium 21 (D), maar dit wordt geblokkeerd door enten kralen gedrenkt in U0126 (E). In eerdere ledematen voortijdige MyoD expressie niet geïnduceerd door FGF18 (F), maar wordt geïnduceerd door enten co-korrels geweekt in FGF18 en retinoïnezuur antagonist BMS493 (G). FGF18 korrels geënt HH21 ledematen induceren ERK fosforylatie na 1 uur: helderveld (H), fluorescent (I) en samengevoegde (J) beelden van een HH21 ledemaat immunologisch gekleurd voor anti-phosphoERK. Controle korrels gedrenkt in BSA geen ERK fosforylering induceren: (K), fluorescent (L) en samengevoegd (M) beelden van een HH21 ledemaat immunologisch gekleurd voor anti-phosphoERK. Dit cijfer is aangepast van Mok et al, 2014 16. Zwarte sterretjes: heparine parels; witte asterisico's: AG 1-X2 kralen; pijlen geven buitenbaarmoederlijke MyoD meningsuiting in ledematen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van kralen grafts rechtstreeks op ontwikkelende weefsels in ovo is een krachtig hulpmiddel om de rol van de groeifactor signalering ontleden tijdens de ontwikkeling die ongekende controle over het ontwikkelingsstadium waarin zij worden toegepast en de blootstellingsduur.
De keuze van de kraal voor elk type molecuul van belang. Kleine hydrofobe moleculen, zoals beschreven remmers en retinoïnezuur, goed binden gewoonlijk gederivatiseerde AG 1-X2 korrels hoewel het noodzakelijk om de effectiviteit te testen van elke remmer van deze korrels empirisch. Ook voor groeifactoren kan het noodzakelijk zijn om verschillende soorten kralen testen. Sommige kralen transparant en dus moeilijk te visualiseren tijdens de manipulaties maar een korte behandeling met fenolrood, gevolgd door een spoeling in PBS zal ze etiketteren lang genoeg is om het implantaat uit te voeren.
Bij de voorbereiding van korrels, met name die welke zijn gedrenkt inhibitors is het belangrijk om hen te beschermen tegen licht zoveel mogelijk. Tijdens de initiële behandeling als tijdens manipulatie toch moeten vallen en alleen verwijderd wanneer korrels worden overgedragen. Het beste is om vers ontdooide porties gebruiken als sommige van deze reagentia zijn instabiel en kan misleidend negatieve resultaten geven als ze niet goed opgeslagen. Het is belangrijk niet te verlaten weken in fenolrood te lang voordat enting aangezien dit de effectiviteit van de hiel te verminderen.
De gebruikte concentraties van deze kralen enten, zowel groeifactoren en drugs, vaak zeer hoog; FGF18 korrels worden geweekt in een concentratie van 0,5 mg / ml en kralen voor kleine molecule inhibitoren worden vaak geweekt in een concentratie van 100 uM. Hoewel dit veel hoger dan de concentratie gewoonlijk gebruikt om cellen in oplossing behandelt dit nodig omdat de hoeveelheden groeifactoren en drugs geabsorbeerd parels en vervolgens vrijgelaten is moeilijk direct te meten maar vermoedelijk generate lagere niveaus dan dit in vivo. Hierdoor wordt een reeks concentraties worden getest per molecule gebruikt om een effectieve dosis te bepalen.
Deze techniek is ook toepasbaar op een breed scala van andere weefsels, zoals somieten 24, tijdens de ontwikkeling en kan op embryo's in ovo of in kweken, zoals EC 25 cultuur. Het is ook mogelijk om gekweekte cellen die specifieke groeifactoren pellets die vervolgens kunnen worden geënt ontwikkelende embryo's op dezelfde manier 26 afscheiden groeien.
De combinatie van de toegankelijkheid, het gemak van manipulatie en lage kosten maakt kippenembryo's een uitstekend model van ontwikkeling. Transgene technologie in toenemende mate worden toegepast op vogelsoorten en genetisch gemodificeerde lijnen van zowel kippen en kwartels 7 27 beschikbaar komen van de combinatie van klassieke embryo enten technieken met deze gewijzigde vogels is al het verstrekken van nieuwe inzichten in dewikkeling 8,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
