Abstract
ニワトリ胚を使用して直接成長因子または遺伝子発現およびシグナル伝達経路の活性化におけるシグナル伝達経路の特異的阻害剤のいずれかの効果を試験することが可能です。この技術は、特定の時間に正確に定義された発達段階でのシグナル伝達分子の送達を可能にします。この胚を採取し、遺伝子発現は 、in situハイブリダイゼーション、または免疫染色で観察されたシグナル伝達経路の活性化により、例えば、検査することができる後。
U0126、MEK阻害剤に浸し、このFGF18に浸したビデオヘパリンビーズ、AG 1-X2ビーズでは、 卵内肢芽に移植されています。これは、FGF18はMyoDの及びERKのリン酸化の発現を誘導し、誘導された内因性の両方、およびFGF18のMyoD発現がU0126により阻害されることを示しています。レチノイン酸アンタゴニストに浸したビーズは、FGF18によって時期尚早のMyoDの誘導を増強することができます。
このアプローチは、私たちすることができます異なる増殖因子および阻害剤の広い範囲で編、容易に胚内の他の組織に適合されます。
Introduction
鳥類胚は長年1の開発のための研究のための強力なツールを提供してきました。彼らの最も有用な特徴の1つは、操作が比較的容易であるということです。外部開発は、このような細胞の運命2,3を研究するための古典的なウズラ-ニワトリキメラシステムなどの例を含む様々なmicromanipulationsを胚にアクセスするために卵を開き、実行することが可能となり、開発4,5の間に特定の組織における過剰発現のためのレトロウイルスの注入発達シグナル源6を識別し、移植片培養。さらに最近では、GFPを発現するトランスジェニックニワトリのラインからの移植片とラベルなしホストとの間で発生するキメラは、古典的な移植や遺伝子修飾の組み合わせが開発7,8に重要な洞察を提供することができることを示しています。
鳥類胚を操作することができる容易さはそれを手足を研究するための優れたモデルをしました開発9。 in vivoでの開発手足に特定の成長因子の適用は、四肢のパターニング10,11を変化させ、このプロセス12への洞察を提供し続け因子を同定してきました。このアプローチはまた、筋肉の発達を調節する因子を研究するために使用されており、そのようなのWnt 13、BMPは14およびHGF 15などの多数の信号のための役割を明らかにしました。
最近、この技術は、肢芽に筋原性遺伝子発現を制御する信号を調査するために使用されており、FGF18とレチノイン酸との間の相互作用は、MyoDの発現16のタイミングを制御することができることを示しています。ビーズ上にロードした後、定義された発達段階で特定の組織に直接移植することができる成長因子および小分子の組み合わせを使用することで、開発中のほぼすべての時間と領域に介入する機会を与えてくれます。これはinveするために使用されています体節のパターニング17,18、神経仕様19、神経堤の移行20と軸延長部21を含む多くのプロセスをstigate。
ここでは、鶏の手足の開発に増殖因子または阻害剤のいずれかに浸したビーズを移植する方法について説明します。これは、in situハイブリダイゼーションと筋特異的遺伝子発現を分析することによって筋形成におけるこれらの信号の影響を決定するために使用されてきました。我々は、レチノイン酸または特定のシグナル伝達経路の小分子阻害剤のような小さな疎水性分子のための成長因子、またはAG 1-X2ビーズのために使用されるヘパリン浸したビーズのいずれかを使用して移植片を記載しています。しかし、他のビーズは、22のFGFおよびShhの23の両方を提供するために使用されているにもご利用いただけます。
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Protocol
倫理の声明：すべてのこれらの実験は、動物のケアとノッティンガム大学の倫理指針に従ってください。
移植のためのヘパリンビーズの作製
- 使用前に徹底的にPBSにヘパリンビーズを洗ってください。注：ビーズをPBS中のスラリーとして4℃で保存することができます。
- 1mlのPBSのドロップに20μlのピペットを用いてストックからそれらを除去することによって、移植のためのビーズを選択します。後、3センチペトリ皿に20μlのPBSのドロップにビーズを転送するために2μlに設定し、マイクロピペットを使用しています。 P2ピペットチップで選択ビーズを転送し、解剖顕微鏡ステレオを使用して、サイズに基づいてビーズを選択し;直径100μmの周りの人々は理想的です。
- ビーズからPBSを削除します。 20μlのピペットとファイン時計職人の鉗子で毛管作用により残液と液体の大部分を削除します。注：これは、成長事実上のように、可能な限り除去することが重要ですそれがビーズに添加したときrが希釈されていません。
- ビーズ上に直接成長因子をピペット。 FGF18のために、PBS中の0.1％BSA中に0.5mg / mlで再構成された組換えFGF18の0.5μlを添加します。蒸発から液体を防ぐために、皿の縁の周りに水を数滴を置きます。
- RTで1時間ビーズをインキュベートします。パスツールピペットで皿から水滴を削除し、移植のための準備ができて氷上に置きます。
- （透明のビーズのために）必要な場合は、それらを視覚化するために移植する前に、2％のフェノールレッドに4-5のビーズを転送します。胚に転送する前に、PBSですすいでください。
移植のためのAG 1-X2のビーズの調製
- 0.2 Nギ酸で誘導体化ビーズを使用する前に。
- これを行うには、1.5mlの微小管にビーズを転送するために、スパチュラを使用しています。 0.2 Nギ酸の1ミリリットルを追加し、1時間振とうプラットフォーム上で洗います。
- そして、P1000ピペットでギ酸を除去し、1と交換mlの水。 1時間洗浄し、残りのギ酸を除去するために、6回繰り返します。
- P1000ピペットを用いて残りの液体を削除し、4℃でビーズを格納します。注：この段階で、すべての残留水を除去する必要はありません。
- 3センチメートルペトリ皿に小さなへらを使用してストックから約5〜10マイクロリットル容量のビーズの小さなペレットを削除し、1mlのDMSOを追加（または薬物を溶媒に溶解させ方）。注意：これは、正しいサイズのものを選択するために、そこから数百のビーズを提供する必要があります。
- その後、別の3センチメートルシャーレ中の溶媒の20μlの低下に約100μmの直径のビーズを転送するために2μlに設定P2ピペットを使用しています。
- 20μlのピペットと2μlのピペットを用いて任意の残留溶媒で溶媒を除去。適用される薬剤20μlを交換してください。
注：整合性（またはこれまでに溶媒が使用される）DMSO中の100μMの濃度で薬物を溶解するために、いくつかの小分子阻害剤として-80℃で20μLとストアへのアリコートは不安定であり、それを繰り返し凍結融解を回避するのが最善です。必要な場合は、ビーズを浸漬する前に、所望の濃度に薬剤を希釈します。有効濃度は、各薬物のために経験的に決定する必要があるかもしれません。 - 1時間インキュベートします。これらの分子の多くは光感受性であるため、光から保護します。
- 水に溶解した2％のフェノールレッドを20μlに2μlに設定P2ピペットで転送4-5ビーズを移植する前に。ビーズを可視化するために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してこの手順を実行します。ファイン時計職人鉗子を持つ単一のビーズまたはワイヤループを削除し、胚に転送する前に、PBSですすいでください。これは活性の損失の原因となりますので、使用前に15分以上の場合は2％のフェノールレッド中のビーズを放置しないでください。
3.準備タングステン針
- 3〜4cmのウェル長さに微タングステン線をカットします。の終わりに、ワイヤの一枚を挿入ガラスパスツールピペットや位置に固定するためにブンゼンバーナーで溶融。彼らが使用中に破損している場合、スペアがあることを確認するために10針まで準備します。
- ジェット機炎にワイヤの端部を配置し、（2〜3分程度）タングステンが白色に点灯し、先端が鋭利になるまでそこにそれを保持します。注：必要に応じて、使用中に針を洗浄することができ、ジェット機で再先鋭化。
注：これらの針はまた、ビーズを転送するためのループを作るために使用することができます。静かにベンチに針に触れ、それがループを形成するように曲げます。
ビーズ移植片のための胚の準備4
- それらは所望の段階（ほとんどの肢芽の操作のための3〜5日）に達するまで、平滑末端を上にして卵をインキュベートします。鈍鉗子を使用すると、殻を破ると、シェルを削除し、胚を露出するために鉗子を使用するように平滑末端をタップします。卵殻膜も除去されることを確認します。
注：PBS 1-2 mlのを支援するためにパスツールピペットで追加することができますこの膜は、卵黄にこだわっている場合。静かに、卵黄の表面にPBSをピペットで卵黄を損傷しないように注意しながら、ピンセットで膜をつかみ、静かに卵から引き出します。 - 10ミリリットルの注射器と19 G針で卵から卵白を5 mlまで削除します。胚の生存率を減らすことができ、より大きなボリュームの除去などの卵を密封するために使用されるテープに接触しない胚を確保するために必要な分だけの取ります。
- 胚は15 100 Uペニシリンを含むPBS mlのストレプトマイシンおよび0.1mg / mlにアーティスト墨汁の5-6滴を追加する視覚化するため。 0.5-1は直接1mlシリンジ及び25 G針で胚下mlで注入します。
- 脱水しない胚を確保するために、卵子に1％ウシ胎児血清および100 Uペニシリンおよび0.1mgストレプトマイシン/ mlのPBSを2〜3mlのを追加します。先鋭化時計職人鉗子を使用すると、卵黄膜を除去し、開発肢芽の上に羊膜を開きます。胚が乾燥しないことを確認し、、必要に応じて、より多くのPBS / FCSを追加します。
注：肢芽が明らかに胚の脇腹に対になった派生物として見ることができます。これらの段階では胚は、右側が通常最上でオンになります。その結果、それが右の手足にビーズを移植片と反対側のコントロールとして残したものを使用する方が簡単です。 - ビーズが移植される肢芽の中に切開を作るために先鋭化タングステン線を使用してください。若い段階で、これは困難であるが可能な肢芽を介してすべての方法をカットしないでください。
注：古い胚（HHステージ22以上）においては、グラフト化が、肢自体が小さい芽、これはより困難であるより若い段階において肢芽の特定の領域を選択することが可能です。それは肢芽は、ビーズが四肢近位のままになり、特に若い段階で、そのようにグラフトされたビーズを越えて成長することを覚えておくことも重要です。 - 極細WAのいずれかを使用して、成長因子または薬剤のいずれかからビーズをピックアップtchmakers鉗子やタングステン針から作られたループ。ビーズをDMSOまたはフェノールレッドのいずれかに浸漬されている場合は、胚に適用する前にPBSですすぎます。鉗子/ワイヤループで胚にビーズを転送します。その後、切開部にビードを挿入すると、鋭利なタングステン線を使用しています。
- 胚が水和保たれていることを確実に卵にPBS / FCS 1-2 mlを加えたが、これは胚を損傷し、ビーズが脱落する原因となりますので、胚そのものに直接適用することは避けてください。テープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。
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Representative Results
HHステージでは21のMyoDは染色が開発体節（ 図1A）の筋節に見ることができるが、四肢の筋芽細胞の開発に表現されていない。 図1Bは、FGF18ビーズ移植以下のMyoD 6時間in situハイブリダイゼーションを示しています。対側肢では発現がないながらのMyoDは、ビーズの近くに筋芽細胞に誘導されます。 U0126、MEK、のMyoD（ 図1C）のブロックのFGF18誘導の特異的阻害剤に浸したビーズを共同グラフトします。同様にHHステージ21にU0126ビーズを移植し、24時間後のMyoD発現を探している未処理の対側肢（ 図1D、E）と比較してのMyoDの内因性発現を減少させます。
HHステージ19 FGF18での肢芽でのMyoD（ 図1F）を誘発しません。しかし、FGF18に浸したビーズの同時移植とBMS493は、これを克服することができ、異所性のMyoDが検出されたレチノイン酸アンタゴニスト（Figu再1G）
図1Iは、FGF18は、迅速なリン酸化を誘導することを示していることFGF18を確認するために、MEK胚を介して作用すると1時間、ビーズ移植後に回収し、リン酸化ERKのために免疫染色している、MEK。 図1Hの目標は、移植後FGF18ビーズ1時間の明視野像を示します移植されたビーズの周りのERKの。 図1Jは、これらの画像の重ね合わせを示しています。 0.1％BSAに浸漬対照ビーズ（図1K、L、M）ERKリン酸化を誘導しません
手足の 図1 のMyoDの発現は、ERKのリン酸化を介して、FGF18とレチノイン酸によって調節されている。HHステージ21で未操作の制御手足は（MyoDの（A）を発現しないが、早期の式は、FGF18ビーズを移植した後、6時間に検出されましたB）。 FGF18とU0126ビーズブロック共グラフトするこの誘導（C）。内因性のMyoD発現は、HHステージ21（D）で見られるが、これはU0126（E）に浸したビーズを移植することによってブロックされています。以前の肢芽に時期尚早のMyoD発現はFGF18（F）によって誘導されないが、FGF18及びレチノイン酸アンタゴニストBMS493（G）に浸し共グラフトビーズによって誘発されます。 、明視野（H）蛍光（I）および抗phosphoERKについて免疫染色HH21肢の（J）の画像をマージ：HH21の手足に移植されたFGF18ビーズは1時間後にERKリン酸化を誘導します。 BSAに浸しコントロールビーズはERKリン酸化を誘導しない：抗phosphoERKについて免疫HH21肢の（K）、蛍光（L）と合併（M）は 、画像。この図は、モクら、2014 16から変更されています。ブラックアスタリスク：ヘパリンビーズ;白ASTEリスク：AG 1-X2ビーズ;矢印は、肢芽における異所性のMyoDの発現を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
卵内の組織の開発に直接適用ビーズ移植片の使用は、それらが適用されるときの発達段階と暴露時間を超える圧倒的な制御を与え、開発中の増殖因子シグナル伝達の役割を分析するための強力なツールです。
分子の各タイプのビーズの選択は重要です。それは、経験的にこれらのビーズのそれぞれの阻害剤の有効性をテストする必要があるが、このようなここに記載の阻害剤及びレチノイン酸のような小さな疎水性分子は、通常、誘導体化AGによく1-X2ビーズに結合します。同様に、成長因子のためには、ビーズの異なるタイプをテストする必要があるかもしれません。いくつかのビーズは透明であり、そのように操作中に視覚化することは難しいことができますが、PBSですすぎ、続いてフェノールレッドと短い治療は移植を行うのに十分な長さのためにそれらをラベル付けします。
ビーズを調製する場合、特に阻害剤に浸漬されていますSは、できるだけ光から保護することが重要です。彼らの初期治療中および操作中に彼らを覆い、ビーズのみが転送されているときに削除する必要があります。これらの試薬のいくつかは不安定であり、適切に保存されていない場合は誤解を招く負の結果を与えることができるように、それは解凍したてのアリコートを使用するのが最適です。これは、ビーズの有効性を減らすことができ、このよう移植する前に、あまりにも長い間、フェノールレッドに浸し、それらを残していないことも重要です。
成長因子および薬物の両方のこれらのビーズ移植のために使用される濃度は、しばしば非常に高いです。 FGF18ビーズは、しばしば、100μMの濃度で浸漬されている小分子阻害剤のために0.5 mg / mlのビーズ濃度に浸漬されています。これは、典型的には、ビーズによって吸収され、その後、放出された成長因子および薬物の量を直接測定することは難しいが、おそらく属であるため、これが必要である溶液で細胞を処置するために使用される濃度よりもはるかに高いがこのin vivoでのより低いレベルのTE。その結果、濃度の範囲は、有効用量を決定するために使用される各分子のために試験しなければなりません。
開発中に、24体節や、EC培地25として、卵内または培養物中の胚に使用することができるように、この技術はまた、他の組織の広い範囲に適用可能なものです。その後、同じ方法26で発生中の胚に移植することができ、ペレットのような特定の増殖因子を分泌する培養細胞を成長させることも可能です。
アクセシビリティの組み合わせ、操作と低コストの容易さは、ニワトリ胚の開発の優れたモデルになります。トランスジェニック技術はますます鳥類との両方鶏の遺伝的に改変された行に適用されると7とウズラ27は既にデに新たな洞察を提供しているこれらの修正された鳥とグラフト技術古典胚の組み合わせ利用可能になりますvelopment 8,28。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
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