Abstract
Mit Hühnerembryonen es möglich ist, zur direkten Prüfung der Wirkung von entweder Wachstumsfaktoren oder spezifische Inhibitoren von Signalwegen auf die Gen-Expression und Aktivierung von Signaltransduktionswegen. Diese Technik ermöglicht die Abgabe von Signalmolekülen an genau definierten Entwicklungsstadien für bestimmte Zeiten. Nach dieser Embryonen können geerntet werden und Genexpression untersucht, beispielsweise durch in situ Hybridisierung oder Aktivierung des Signals mit der Immunfärbung beobachtet Übertragungswegen.
In diesem Video-Heparin-Perlen in FGF18 getränkt oder AG 1-X2 Perlen in U0126, ein MEK-Inhibitor eingeweicht, in die Gliedmaßenknospe in ovo gepfropft. Dies zeigt, dass FGF18 induziert die Expression von MyoD und ERK Phosphorylierung und sowohl endogene als auch FGF18 induziert MyoD Expression durch U0126 gehemmt. Perlen in einer Retinsäure Antagonisten getränkt können vorzeitige MyoD Induktion durch FGF18 potenzieren.
Dieser Ansatz kann unsed mit einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsfaktoren und Inhibitoren und wird leicht auf andere Gewebe in den sich entwickelnden Embryo angepasst.
Introduction
Vogelembryonen haben ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung seit vielen Jahren 1 vorgesehen. Eines ihrer nützlichen Eigenschaften ist, dass sie relativ einfach zu manipulieren sind. Externe Entwicklung macht es möglich, das Ei zu öffnen, um den Embryo zugreifen und verschiedene Mikromanipulationen mit Beispielen wie dem klassischen Wachtel-Küken Chimärensystem zur Untersuchung des Zellschicksals 2,3, die Injektion von Retroviren für die Überexpression in bestimmten Geweben während der Entwicklung 4,5 und Explantatkultur entwicklungsSignalQuellen 6 zu identifizieren. Jüngerer Chimären zwischen unmarkiertem Hosts mit Transplantaten von einem transgenen Huhn Linie, die GFP generiert hat gezeigt, dass die Kombination von klassischen Pfropfen und genetische Modifikation kann wichtige Einsichten in die Entwicklung 7,8 bereitzustellen.
Die Leichtigkeit, mit der der Vogelembryo kann manipuliert werden, ist es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung des Körpers gemachtEntwicklungs 9. Anwendung spezifischer Wachstumsfaktoren auf die Entwicklung Gliedmaßen in vivo war maßgeblich an der Identifizierung von Faktoren, die Gliedmaßen Musterung 10,11 verändern und weiterhin Einblicke in diesen Prozess 12 bereitzustellen. Dieser Ansatz ist auch verwendet worden, um die Faktoren, die die Entwicklung der Muskulatur regulieren zu studieren und hat Rollen für zahlreiche Signale wie Wnts 13, 14 und BMPs HGF 15 freigelegt.
Kürzlich wurde diese Technik verwendet, um die Signale, die myogene Genexpression in der Extremitätenknospe untersuchen und zu zeigen, dass Interaktionen zwischen FGF18 und Retinsäure kann das Timing MyoD Expression 16 zu steuern. Mit einer Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, die auf Kügelchen geladen werden kann und dann direkt in spezifischen Geweben in bestimmten Entwicklungsstadien gepfropft die Möglichkeit gibt, zu fast jeder Zeit und Region bei der Entwicklung einzugreifen. Dies wurde verwendet, um INVEstigate viele Prozesse einschließlich Somiten Musterung 17,18, neuronale Spezifikation 19, Neuralleiste Migration 20 und Achse Verlängerung 21.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Pfropfen von Kügelchen in entweder Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren in der Entwicklung Hühnerschenkel eingeweicht. Dies kann genutzt werden, um die Auswirkungen dieser Signale auf myogenesis durch Analysieren muskelspezifische Genexpression in situ-Hybridisierung zu bestimmen. Wir beschreiben Transplantate unter Verwendung von entweder Heparin getränkten Kügelchen, die für Wachstumsfaktoren oder AG 1-X2 Perlen für kleine hydrophobe Moleküle, wie Retinsäure oder Kleinmolekül-Inhibitoren spezifischer Signalwege verwendet. Aber auch andere Perlen sind ebenfalls verfügbar, die verwendet wurden, um sowohl FGFs und Shh 23 22 zu liefern.
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Protocol
Ethics Statement: Alle diese Versuche folgen der Tierpflege und ethischen Richtlinien der University of Nottingham.
1. Herstellung von Heparin-Korne für Pfropfen
- Waschen Sie Heparin Perlen sorgfältig in PBS vor dem Gebrauch. Hinweis: Die Glasperlen können bei 4 ° C als Aufschlämmung in PBS gelagert werden.
- Wählen Perlen zum Pfropfen von ihnen aus dem Lager entfernt mit einer 20 ul Pipette in ein 1 ml Tropfen PBS. Dann mit einem Mikropipette bis 2 & mgr; l eingestellt, um die Kügelchen in eine 20 & mgr; l Tropfen PBS in einer 3 cm Petrischale übertragen. Wählen Perlen basierend auf Größe und mit einem Stereo-Binokular, Transfer ausgewählten Perlen mit einem P2 Pipettenspitze; die um 100 & mgr; m Durchmesser sind ideal.
- Entfernen Sie das PBS aus den Perlen. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit mit einer 20 ul Pipette und der Restflüssigkeit durch Kapillarwirkung mit feinen Uhrmacher Pinzette. Anmerkung: Es ist wichtig, so viel wie möglich, damit das Wachstum facto entfernenR nicht verdünnt, wenn es an den Beads zugegeben.
- Pipettieren den Wachstumsfaktor direkt auf die Perlen. Für FGF18 werden 0,5 ul rekombinanter FGF18 bei 0,5 mg / ml in 0,1% BSA in PBS rekonstituiert. Einige Tropfen von Wasser um die Ränder der Schale, um die Flüssigkeit verflüchtigt.
- Inkubieren der Kügelchen für 1 h bei RT. Nehmen Sie die Tropfen von Wasser aus der Schale mit einer Pasteurpipette und auf Eis bereit für die Transplantation.
- Bei Bedarf (für transparente Kügelchen) Transfer 4-5 Kügelchen bis 2% Phenolrot vor dem Pfropfen zu helfen, zu visualisieren. Spülen in PBS vor der Übertragung auf den Embryo.
2. Herstellung der AG 1-X2 Perlen zum Pfropfen
- Vor derivatisieren Perlen mit 0,2 N Ameisensäure verwenden.
- Verwenden Sie hierzu einen Spachtel, um die Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. In 1 ml 0,2 N Ameisensäure und waschen auf einem Schütteltisch für 1 Stunde.
- Entfernen Sie dann die Ameisensäure mit einer Pipette p1000 und ersetzen 1ml Wasser. Waschen für 1 Stunde und wiederholen Sie sechs Mal zu entfernen restlichen Ameisensäure.
- Entfernen Sie verbleibende Flüssigkeit mit einer Pipette p1000 und die Perlen lagern bei 4 ° C. Anmerkung: Es ist nicht notwendig, alle das Restwasser in dieser Stufe zu entfernen.
- Entfernen Sie ein kleines Pellet von Kügelchen von etwa 5-10 & mgr; l Volumen aus dem Bestand mit einem kleinen Spatel in eine 3 cm Petrischale und 1 ml DMSO (oder je nachdem, was Lösungsmittel der Wirkstoff gelöst in). Hinweis: Diese sollten mehrere hundert Perlen, von denen diejenigen, die richtige Größe zu wählen ist.
- Dann mit einem P2 Pipette 2 ul eingestellt, um die Kügelchen von etwa 100 & mgr; m Durchmesser zu einem 20 ul Tropfen Lösungsmittel in einem anderen 3 cm Petrischale übertragen.
- Entfernung des Lösungsmittels mit einem 20 ul-Pipette und einer restlichen Lösungsmittels mit einem 2 & mgr; l-Pipette. Ersetzen mit 20 ul des Arzneimittels angewandt werden.
HINWEIS: Konsistenz auflösen das Medikament in einer Konzentration von 100 uM in DMSO (oder die überhaupt Lösungsmittel verwendet wird),Aliquot in 20 & mgr; l und bei -80 ° C nach einigen niedermolekularen Inhibitoren sind instabil und es ist am besten wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Gegebenenfalls anschließend die verdünnte Medikament auf die gewünschte Konzentration vor dem Einweichen Perlen. Wirksame Konzentrationen müssen am besten empirisch für jedes Arzneimittel bestimmt. - Inkubation für 1 Std. Vor Licht, da viele dieser Moleküle Licht empfindlich sind.
- Vor der Transplantation Transfer 4-5 Perlen mit einer p2 Pipette 2 ul in 20 ul 2% Phenolrot in Wasser gelöst gesetzt. Führen Sie diesen Schritt mit Hilfe eines Stereo Binokular, um die Perlen zu visualisieren. Entfernen Sie eine einzelne Perle mit feinen Uhrmacher Pinzette oder eine Drahtschleife und spülen in PBS vor der Übertragung auf den Embryo. NOTleave Kügelchen in 2% Phenolrot für mehr als 15 min vor der Verwendung, da dies zu Aktivitätsverlust führen.
3. Vorbereitung Tungsten Nadeln
- Fein geschnitten Wolframdraht in 3-4 cm Länge. Stecken Sie ein Stück Draht in das Endeein Glas Pasteurpipette und Schmelze in einem Bunsenbrenner in Position zu fixieren. Vorbereitung bis zu 10 Nadeln, um sicherzustellen, dass es Ersatzteile, wenn sie während des Gebrauchs beschädigt werden.
- Legen Sie das Ende des Drahtes in einer Lötlampe Flamme und halten Sie ihn dort, bis die Wolfram leuchtet weiß und die Spitze ist scharf (ca. 2-3 min). Hinweis: Während der Verwendung kann die Nadel gereinigt werden und in der Lötlampe nach Bedarf neu geschärft.
HINWEIS: Diese Nadeln können auch verwendet werden, um Schleifen für die Übertragung von Perlen zu machen. Berühren Sie leicht die Nadel auf der Bank, und es wird zu biegen, um eine Schleife zu bilden.
4. Vorbereitung Embryonen für Bead Grafts
- Eier auszubrüten mit dem stumpfen Ende, bis sie die gewünschte Stufe (3-5 Tage für die meisten Gliedmaßenknospe Manipulationen) zu erreichen. Verwendung stumpfen Pinzette Hahn auf dem stumpfen Ende, um die Schale zu brechen und verwenden Sie dann die Zange, um die Schale zu entfernen und setzen den Embryo. Sicherstellen, dass die Eierschalenmembran wird ebenfalls entfernt.
HINWEIS: 1-2 ml PBS mit einer Pasteur-Pipette, um mit Unterstützungs hinzugefügt werdenDies, wenn die Membran klebt an den Dotter. Gently Pipette den PBS auf die Oberfläche des Dotters, fassen Sie die Membran mit der Zange, kümmert sich nicht um das Eigelb beschädigen, und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Ei. - Entfernen Sie bis zu 5 ml Albumin aus dem Ei mit einer 10-ml-Spritze und einer 19 G-Nadel. Sich nur so weit wie notwendig, um den Embryo nicht Kontakt mit dem Band verwendet wird, um das Ei die Entfernung von größeren Volumina abdichten kann Embryoüberlebensraten zu reduzieren gewährleisten.
- Zur Visualisierung der Embryo fügen Sie ein 5-6 Tropfen Künstler Tusche 15 ml PBS mit 100 U Penicillin und Streptomycin 0,1 mg / ml. Injizieren 0,5-1 ml direkt nach dem Embryo mit einer 1 ml Spritze und einer 25 G-Nadel.
- Hinzuzufügen 2-3 ml PBS mit 1% fötalem Kälberserum und 100 U Penicillin und Streptomycin 0,1 mg / ml in das Ei, um den Embryo nicht austrocknen zu gewährleisten. Verwendung geschärft Uhrmacher Pinzette entfernen Sie die Dotterhaut und öffnen Sie das Amnion über die Entwicklung von Extremitätenknospen. Stellen Sie sicher, der Embryo nicht austrocknet und, Falls erforderlich, fügen Sie mehr PBS / FCS.
HINWEIS: Die Extremitätenknospen deutlich als gepaart Auswüchse an der Flanke des Embryos sichtbar. In diesen Stadien der Embryo wird sich solche auf der rechten Seite ist in der Regel nach oben. Als Ergebnis ist es normalerweise einfacher, Perlen in die rechten Schenkel Transplantat mit den Links- als diejenigen kontralateralen Kontrollen. - Verwenden Sie einen geschärften Wolfram-Draht, um einen Einschnitt in die Gliedmaßenknospe, wo der Wulst wird implantiert werden zu machen. Vermeiden Sie das Schneiden den ganzen Weg durch die Gliedmaßenknospe, wo möglich, obwohl in jüngeren Stadien ist dies schwierig.
HINWEIS: Bei älteren Embryonen (HH-Stufe 22 und höher) ist es möglich, bestimmte Regionen der Extremitätenknospe zum Pfropfen aber in jüngeren Stadien ist dies schwieriger, wenn die Extremitätenknospe selbst klein zu wählen. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass der Extremitätenknospe wird über die gepfropft Perle wachsen so, besonders bei jüngeren Stadien, die Perle in der proximalen Extremitäten bleiben. - Pick-up ein Wulst entweder von der Wachstumsfaktor oder Drogen entweder extra fein watchmakers Zange oder eine Schleife aus einer Wolfram Nadel gemacht. Wenn die Raupe hat entweder DMSO oder Phenolrot getränkt gründlich in PBS vor dem Auftragen auf den Embryo. Übertragen Sie die Perle auf den Embryo mit der Zange / Drahtschleife. Dann nutzen Sie die geschärften Wolfram-Draht, um den Wulst in den Einschnitt einzufügen.
- Fügen Sie 1-2 ml PBS / FCS auf das Ei sicher, dass der Embryo hydratisiert gehalten, aber vermeiden, die Anwendung direkt auf den Embryo selbst, da dies die Embryonen schädigen und die Wulst zu verdrängt werden. Dichten Sie das Ei mit Band und zurück in den Inkubator.
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Representative Results
HH Stufe 21 MyoD ist nicht in sich entwickelnden Gliedmaßen Myoblasten obwohl Färbung kann myotome der Entwicklungs Somiten (1A) zu sehen ist, ausgedrückt. 1B zeigt in situ Hybridisierung für MyoD 6 h nach einer FGF18 Wulst Transplantats. MyoD in Myoblasten dicht an dem Wulst induzierten während es keinen Ausdruck in der kontralateralen Extremität. Co-Pfropfen eines Wulstes in U0126 getränkt, einen spezifischen Inhibitor von MEK, Blöcke FGF18 Induktion von MyoD (Abbildung 1C). Ähnlich Pfropfen eines U0126 Wulst an HH-Stufe 21 und auf der Suche nach MyoD Expression nach 24 Stunden reduziert die endogene Expression von MyoD Vergleich zur unbehandelten kontralateralen Schenkel (1D, E).
In Extremitätenknospen bei HH Stufe 19 FGF18 induziert keine MyoD (1F). Allerdings Co-Pfropfen von Perlen in FGF18 eingeweicht und die Retinsäure-Antagonist BMS493 kann dies zu überwinden und Eileiter MyoD erkannt wird (FiguWieder 1G)
Um sicherzustellen, dass FGF18 Bestätigung durch MEK Embryonen wirkenden wurden 1 Stunde nach Wulst Transplantat geerntet und phosphorylierte ERK immun, das Ziel von MEK. Abbildung 1H zeigt eine Hellfeld-Bild eines FGF18 Wulst 1 h nach der Transplantation, während 1I zeigt, dass FGF18 induziert eine schnelle Phosphorylierung ERK um das gepfropfte Raupe. Figur 1J zeigt eine Überlagerung der Bilder. Kontrollkügelchen in 0,1% BSA eingeweicht ERK-Phosphorylierung induzieren keine (Figur 1K, L, M)
Abbildung 1. MyoD Expression in Gliedmaßen wird von FGF18 und Retinsäure durch ERK Phosphorylierung an HH Stufe 21 geregelt. Unmanipulierten Steuer Gliedmaßen nicht MyoD (A) zum Ausdruck bringen, aber verfrüht Ausdruck erkannt wird 6 Stunden nach der Transplantation ein FGF18 Wulst (B). Co-Pfropfen FGF18 und U0126 Perlen Blöcke diese Induktion (C). Endogene MyoD Expression in HH-Stufe 21 (D) gesehen, aber dies wird durch Pfropfen von Kügelchen in U0126 (E) getränkt blockiert. In früheren Extremitätenknospen vorzeitigen MyoD Expression wird nicht durch FGF18 (F) induziert wird aber von Co-Pfropfen Perlen in FGF18 und der Retinsäure-Antagonist BMS493 (G) eingeweicht induziert. FGF18 Perlen in HH21 Gliedmaßen gepfropft induzieren ERK-Phosphorylierung nach 1 Stunde: Hellfeld (H), Leuchtstoff (I) und zusammengeführt (J) Bilder eines HH21 Extremität für Anti-phosphoERK immungefärbt. Steuer Perlen in BSA getränkt nicht ERK-Phosphorylierung zu induzieren: (K), fluoreszierende (L) und zusammengeführt (M) Bilder eines HH21 Extremität für Anti-phosphoERK immungefärbt. Diese Zahl hat sich von Mok et al, 2014 16 geändert wurde. Schwarz Sternchen: Heparin-Perlen; weiß asteRisiken: AG 1-X2-Perlen; Pfeile zeigen Eileiter MyoD Expression in Extremitätenknospen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Verwendung von Transplantaten Wulst unmittelbar entwickelnden Geweben in ovo angelegt ist ein mächtiges Werkzeug, um die Rolle von Wachstumsfaktor-Signalweges während der Entwicklung geben beispiellose Kontrolle über die Entwicklungsstufe, bei der sie angewendet werden, und die Dauer der Exposition zu sezieren.
Die Wahl der Wulst für jede Art von Molekülen ist wichtig. Kleinen hydrophoben Molekülen, wie den hier beschriebenen Inhibitoren und Retinsäure, normalerweise gut binden derivatisierte AG 1-X2-Perlen obwohl es notwendig ist, um die Wirksamkeit zu testen jedes Inhibitors auf diesen Kügelchen empirisch. Ähnlich wird für Wachstumsfaktoren, kann es notwendig sein, verschiedene Arten von Wulst zu testen. Einige Perlen sind transparent und können so schwer, während der Manipulationen, aber eine kurze Behandlung mit Phenolrot, gefolgt von einer Spülung in PBS visualisieren sie für lang genug, um das Transplantat durchführen zu markieren.
Bei der Herstellung von Perlen, insbesondere solche, die mit Inhibitor eingeweicht worden sind,s, ist es wichtig, sie vor Licht so weit wie möglich zu schützen. Während ihrer ersten Behandlung und während der Manipulation sollten sie abgedeckt werden und nur entfernt, wenn Perlen werden übertragen. Am besten ist es frisch aufgetauten Aliquots verwenden, wie einige dieser Reagenzien sind instabil und können irreführend negativen Ergebnissen führen, wenn nicht richtig gespeichert. Es ist auch wichtig, nicht zu verlassen Einweichen in Phenolrot zu lange vor dem Pfropfen, da dies die Wirksamkeit der Wulst zu reduzieren.
Die für diese Perle Transplantate verwendet, beider Wachstumsfaktoren und Medikamenten-Konzentrationen sind oft sehr hoch; FGF18 Kügelchen werden in einer Konzentration von 0,5 mg / ml und Perlen für kleine Moleküle als Inhibitoren werden häufig in einer Konzentration von 100 uM getränkt getränkt. Obwohl dies ist viel höher als die Konzentrationen, in der Regel verwendet, um Zellen in einer Lösung zu behandeln dies notwendig, da die Mengen der Wachstumsfaktoren und Arzneimitteln, die durch Kügelchen absorbiert und dann freigegeben ist, sich nur schwer direkt zu messen, aber vermutlich Gattungente unteren Ebenen als dieser in vivo. Als Ergebnis einer Reihe von Konzentrationen müssen für jedes Molekül verwendet werden, um eine wirksame Dosis zu bestimmen, untersucht werden.
Diese Technik ist auch anwendbar auf einen weiten Bereich von anderen Geweben, wie Somiten 24, während der Entwicklung und auf Embryonen in ovo oder in Kulturen verwendet werden, wie EC Kultur 25. Es ist auch möglich, kultivierten Zellen, die spezifische Wachstumsfaktoren in Form von Pellets, die dann in der gleichen Weise 26 in sich entwickelnden Embryonen gepfropft werden können sezer wachsen.
Die Kombination aus Zugänglichkeit, einfache Handhabung und niedrige Kosten macht Hühnerembryonen ein ausgezeichnetes Modell der Entwicklung. Als transgene Technologien zunehmend an Vogelarten und gentechnisch veränderten Linien der beiden Hühnern angewendet 7 und Wachteln 27 verfügbar werden die Kombination aus klassischen Embryo Transplantation Techniken mit diesen modifizierten Vögel leistet bereits neue Einblicke in deEntwicklungs 8,28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
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