Abstract
Använda kycklingembryon är det möjligt att direkt testa effekterna av antingen tillväxtfaktorer eller specifika inhibitorer av signalvägar på genuttryck och aktivering av signaltransduktionsvägar. Denna teknik medger avgivning av signalmolekyler vid exakt definierade utvecklingsstadier för specifika tider. Efter denna embryon kan skördas och genexpression undersöks, till exempel genom hybridisering in situ, eller aktivering av signaltransduktionsvägar som observeras med immunfärgning.
I den här videon heparin pärlor indränkt i FGF18 eller AG 1-X2 pärlor indränkt i U0126, en MEK-hämmare, är ympade in lemmen bud in ovo. Detta visar att FGF18 inducerar uttryck av MyoD och ERK fosforylering och både endogen och FGF18 inducerad MyoD uttryck hämmas av U0126. Pärlor indränkt i en retinoinsyra antagonist kan förstärka tidig MyoD induktion av FGF18.
Detta tillvägagångssätt kan vara ossed med ett brett utbud av olika tillväxtfaktorer och inhibitorer och lätt anpassas till andra vävnader i det växande embryot.
Introduction
Fågelembryon har gett ett kraftfullt verktyg för att studera utveckling i många år 1. En av deras mest användbara egenskaper är att de är relativt lätta att manipulera. Extern utveckling är det möjligt att öppna ägget att komma åt embryot och utföra olika micromanipulations inklusive exempel som den klassiska vaktel-chick chimär system för att studera cell öde 2,3, injektion av retrovirus för överuttryck i specifika vävnader under utveckling 4,5 och Explantation kultur att identifiera utvecklingssignalkällor 6. På senare tid Chimärer genereras mellan omärkta värdar med transplantat från en transgen kyckling som uttrycker GFP har visat att kombinationen av klassisk ympning och genetisk modifiering kan ge viktiga insikter i utvecklings 7,8.
Den lätthet med vilken fågelembryo kan manipuleras har gjort den till en utmärkt modell för att studera lemutveckling 9. Tillämpning av särskilda tillväxtfaktorer för att utveckla ben in vivo har varit avgörande för att identifiera faktorer som förändrar lem mönstring 10,11 och fortsätter att ge insikter i denna process 12. Detta tillvägagångssätt har också använts för att studera de faktorer som reglerar muskelutveckling och har avslöjat roller för många signaler såsom Wnts 13, BMP 14 och HGF 15.
Nyligen denna teknik har använts för att undersöka de signaler som styr myogenic genuttryck i extremiteten linda och har visat att interaktioner mellan FGF18 och retinoinsyra kan styra tidpunkten för MyoD uttryck 16. Med en kombination av tillväxtfaktorer och små molekyler som kan lastas på pärlor och sedan ympade direkt till specifika vävnader vid definierade utvecklingsstadier ger möjlighet att ingripa nästan när som helst och regionen under utveckling. Detta har använts för att investigate många processer inklusive somit mönstring 17,18, neural specifikation 19, neurallist migration 20 och axel förlängning 21.
Här beskriver vi en metod för ympning pärlor indränkt i antingen tillväxtfaktorer eller inhibitorer till att utveckla kyckling lemmar. Detta har använts för att bestämma effekterna av dessa signaler på myogenes genom att analysera muskler specifikt genuttryck med in situ hybridisering. Vi beskriver transplantat med användning av antingen heparin dränkts pärlor, som används för tillväxtfaktorer eller AG 1-X2 pärlor för små hydrofoba molekyler, såsom retinsyra eller små molekylhämmare av specifika signalvägar. Men andra pärlor är också tillgängliga som har använts för att leverera både FGF 22 och Shh 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla dessa experiment följer djuromsorg och etiska riktlinjer vid universitetet i Nottingham.
1. Framställning av Heparin Pärlor för Ympning
- Tvätta heparin pärlor noggrant i PBS före användning. Anm: Pärlor kan lagras vid 4 ° C som en uppslamning i PBS.
- Välj pärlor för ympning genom att ta bort dem från lager med en 20 l pipett i en 1 ml droppe PBS. Använd sedan en mikropipett inställd på 2 | j, l för att överföra pärlor i en 20 pl droppe av PBS i en 3 cm petriskål. Välj pärlor baserade på storlek och med hjälp av en stereo dissekera mikroskop, överföra utvalda pärlor med en P2 pipettspets; de omkring 100 um diameter är idealiska.
- Ta bort PBS från kulorna. Avlägsna det mesta av vätskan med en 20 | j, l pipett och den kvarvarande vätskan genom kapillärverkan med fina urmakare pincett. Obs: Det är viktigt att ta bort så mycket som möjligt så att tillväxten factoR inte utspädes när den tillsätts till kulorna.
- Pipettillväxtfaktorn direkt på pärlorna. För FGF18 lägg 0,5 | il rekombinant FGF18 rekonstituerades vid 0,5 mg / ml i 0,1% BSA i PBS. Placera några droppar vatten runt kanterna på skålen för att förhindra att vätskan avdunstar.
- Inkubera pärlorna under 1 h vid RT. Ta bort vattendroppar från skålen med en pasteurpipett och placera på is redo för transplantation.
- Om det behövs (för genomskinliga pärlor) överlåtelse 4-5 pärlor till 2% fenolrött innan ympning hjälpa visualisera dem. Skölj i PBS innan de överförs till embryot.
2. Framställning av AG 1-X2 Pärlor för Ympning
- Före användning derivatisera pärlor med 0,2 N myrsyra.
- För att göra detta använder en spatel för att överföra pärlor till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml 0,2 N myrsyra och tvätta på en skakande plattform under 1 timme.
- Ta sedan bort myrsyran med en P1000 pipett och ersätta med enml vatten. Tvätta i 1 timme och upprepa sex gånger för att avlägsna kvarvarande myrsyra.
- Avlägsna återstående vätskan genom en P1000 pipett och lagra pärlorna vid 4 ° C. Obs: Det är inte nödvändigt att avlägsna alla kvarvarande vattnet i detta skede.
- Avlägsna en liten pellet av pärlor av ca 5-10 | j, l volym från mälden med användning av en liten spatel till en 3 cm petriskål och tillsätt 1 ml DMSO (eller den lösningsmedel läkemedlet upplöses i). Obs: Detta bör ge flera hundra kulor för att välja dem i rätt storlek.
- Använd sedan en P2 pipett inställd på 2 pl att överföra pärlor av cirka 100 um diameter till en 20 l droppe av lösningsmedel i ytterligare 3 cm petriskål.
- Avlägsna lösningsmedel med en 20 | j, l pipett och eventuellt kvarvarande lösningsmedel med en 2 l pipett. Ersätt med 20 pl av det läkemedel som skall appliceras.
OBS: För överensstämmelse lösa upp läkemedlet i en koncentration av 100 pM i DMSO (eller som någonsin lösningsmedel används),alikvot in i 20 | il och förvara vid -80 ° C såsom vissa småmolekylinhibitorer är instabila och det är bäst att undvika upprepad frysning-tining. Om det är nödvändigt sedan späda läkemedlet till den önskade koncentrationen innan blötläggning pärlor. Effektiva koncentrationer kan behöva bestämmas empiriskt för varje läkemedel. - Inkubera i en timme. Skydda mot ljus så många av dessa molekyler är ljuskänsliga.
- Innan ympning överföring 4-5 pärlor med en p2 pipett satt till 2 | il i 20 | il 2% fenolrött upplösta i vatten. Utför detta steg med hjälp av en stereo dissektionsmikroskop att visualisera pärlorna. Ta bort en enda pärla med fina urmakare pincett eller en trådslinga och skölj i PBS innan de överförs till embryot. Lämna inte pärlor i 2% fenolrött i mer än 15 minuter före användning eftersom det kan orsaka förlust av aktivitet.
3. Förbereda Tungsten Needles
- Skär fint volframtråd i 3-4 cm långa. Sätt en bit tråd i slutet avett glas pasteurpipett och smälta i en Bunsenbrännare för att fixera i läge. Förbered upp till 10 nålar för att säkerställa att det finns reservdelar om de skadas under användning.
- Placera änden av tråden till en blåslampa låga och håll den där tills volfram lyser vita och spetsen är vass (ca 2-3 min). Obs: Vid användning nålen kan rengöras och åter slipas i blåslampa behov.
OBS: Dessa nålar kan också användas för att göra slingor för överföring av pärlor. Rör försiktigt nålen till bänken och det kommer att böja att bilda en slinga.
4. Utarbetande Embryon för Bead Grafts
- Inkubera ägg med den trubbiga änden upp tills de når den önskade scenen (3-5 dagar för de flesta lem knopp manipulationer). Använda trubbig pincett knacka på den trubbiga änden att bryta skalet och sedan använda pincett för att ta bort skalet och exponera embryot. Se till äggskalet membranet avlägsnas också.
OBS: 1-2 ml PBS tillsättas med en Pasteur-pipett för att hjälpa till meddetta om membranet fastnar äggulan. Försiktigt pipett PBS på ytan av äggulan, ta tag i membranet med pincett och var noga med att inte skada äggula, och försiktigt dra bort det från ägget. - Ta bort upp till 5 ml av äggvita från ägg med en 10 ml spruta och en 19 G-nål. Ta bara så mycket som behövs för att säkerställa att embryot inte kommer i kontakt med bandet används för att täta ägget som avlägsnande av större volymer kan minska embryo överlevnad.
- För att visualisera embryot tillsätt 5-6 droppar av artister tusch till 15 ml PBS innehållande 100 U penicillin och 0,1 mg streptomycin / ml. Injicera 0,5-1 ml direkt under embryo med en 1 ml spruta och en 25 G-nål.
- Tillsätt 2-3 ml PBS med 1% fetalt kalvserum och 100 U penicillin och 0,1 mg streptomycin / ml in i ägget för att säkerställa embryot inte dehydratisera. Använda vässade urmakare pincett bort vitellinmembranet och öppna amnion över utvecklings lem knoppar. Se till att embryot inte torka ut och, Om det behövs, tillsätt mer PBS / FCS.
OBS: lem knoppar kan tydligt ses eftersom ihopparade utväxter på flanken av embryot. Vid dessa stadier embryot kommer att vända sådan den högra sidan är normalt uppåt. Som ett resultat är det normalt enklare att ympa pärlor i rätta lemmar och använda vänster oner som kontralaterala kontroller. - Använd en vässad volframtråd för att göra ett snitt i extremitetsanlag där vulsten kommer att implanteras. Undvik att skära hela vägen genom benet bud om möjligt även i yngre stadier är svårt.
OBS: I äldre embryon (HH stadium 22 och ovan) är det möjligt att välja specifika regioner av lemmen bud för ympning men yngre stadier är svårare eftersom lem knopp själv är liten. Det är också viktigt att komma ihåg att den del bud kommer att växa förbi den ympade pärla så, särskilt i yngre stadier, kommer pärlan kvar i proximala lem. - Plocka upp en pärla från antingen tillväxtfaktor eller läkemedel med antingen extra fin watchmakers pincett eller en slinga tillverkad av en volfram nål. Om kulan har dränkts i antingen DMSO eller fenolrött, skölj i PBS innan de ansöker till embryot. Överför vulsten till embryot med pincett / viraslingan. Använd sedan den vässade volframtråd för att infoga vulsten i snittet.
- Tillsätt 1-2 ml PBS / FCS till ägget se till att embryot hålls släckt men undvika att tillämpa direkt på embryot självt eftersom det kan skada embryon och orsaka pärla som ska rubbas. Täta ägget med tejp och återgå till inkubatorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På HH stadium 21 MyoD inte uttrycks i att utveckla lem myoblaster fastän färgning kan ses i myotome av utvecklings somiter (Figur 1A). Figur 1B visar in situ-hybridisering för MyoD 6 timmar efter en FGF18 vulst transplantatet. MyoD induceras i myoblaster nära pärlan medan det inte finns något uttryck i kontralaterala. Co-ympning av en kula indränkt i U0126, en specifik hämmare av MEK, blockerar FGF18 induktion av MyoD (Figur 1C). Likaså ympning en U0126 pärla på HH stadium 21 och letar efter MyoD uttryck efter 24 timmar minskar endogena uttrycket av MyoD jämfört med den obehandlade kontralaterala (Figur 1D, E).
I lem knoppar på HH stadium 19 FGF18 inducerar inte MyoD (figur 1F). Men samtidig ympning av pärlor indränkt i FGF18 och retinoinsyra antagonisten BMS493 kan övervinna detta och ektopisk MyoD detekteras (Figure 1G)
För att bekräfta att FGF18 agerar genom MEK embryon skördades en timme efter pärla transplantat och immun för fosforylerat ERK, visar målet för MEK. Figur 1H en bright bild av en FGF18 pärla 1 h efter ympning medan figur 1I visar att FGF18 inducerar snabb fosforylering av ERK runt ympade pärlan. Figur 1J visar en överlagring av dessa bilder. Kontroll pärlor indränkt i 0,1% BSA inte framkalla ERK fosforylering (figur 1K, L, M)
Figur 1. MyoD expression i extremiteterna regleras av FGF18 och retinsyra genom ERK-fosforylering. Omanipulerat kontroll lemmar i HH stadium 21 inte uttrycker MyoD (A) men för tidig uttryckning detekteras 6 h efter ympning av en FGF18 vulst (B). Co-ympning FGF18 och U0126 pärlor blockerar denna induktion (C). Endogent MyoD uttryck ses vid HH stadium 21 (D), men detta blockeras av ympning pärlor indränkt i U0126 (E). I tidigare lem knoppar tidig MyoD uttrycket inte induceras av FGF18 (F) men induceras genom samtidig ympning pärlor indränkt i FGF18 och retinsyra antagonisten BMS493 (G). FGF18 pärlor ympade in HH21 lemmar inducerar ERK fosforylering efter 1 timme: bright (H), fluorescerande (I) och slås samman (J) bilder av en HH21 lem immun för anti-phosphoERK. Kontroll pärlor indränkt i BSA inte framkalla ERK fosforylering: (K), fluorescerande (L) och slås samman (M) bilder av en HH21 lem immun för anti-phosphoERK. Denna siffra har ändrats från Mok et al, 2014 16. Svarta asterisker: heparinpärlor; vit asterisker: AG 1-X2 pärlor; Pilarna visar ektopisk MyoD uttryck i lem knoppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av pärla transplantat appliceras direkt till att utveckla vävnader in ovo är ett kraftfullt verktyg för att dissekera roll tillväxtfaktorsignalering under utveckling som ger oöverträffad kontroll över utvecklingsstadium där de tillämpas och exponeringstiden.
Valet av vulsten för varje typ av molekyl är viktig. Små hydrofoba molekyler, såsom inhibitorer beskrivs här och retinsyra, oftast binder väl till derivatiserad AG 1-X2 pärlor även om det är nödvändigt att testa effektiviteten hos varje inhibitor på dessa pärlor empiriskt. Likaså för tillväxtfaktorer kan det vara nödvändigt att testa olika typer av vulsten. Vissa pärlor är transparenta och så kan vara svårt att visualisera under manipulationer men en kort behandling med fenolrött följt av en sköljning i PBS kommer märka dem tillräckligt länge för att utföra transplantatet.
Vid framställning av pärlor, särskilt de som har dränkts med inhibitors, är det viktigt att skydda dem från ljus så mycket som möjligt. Under sin första behandling och under manipulation bör de täckas och bara bort när pärlor överförs. Det är bäst att använda nyligen tinade portioner som en del av dessa reagens är instabila och kan ge missvisande negativa resultat om de inte förvaras på rätt sätt. Det är också viktigt att inte lämna dem blötläggning i fenolrött för länge innan ympning eftersom detta kan minska effekten av pärlan.
De koncentrationer som används för dessa pärla transplantat, både tillväxtfaktorer och droger, är ofta mycket hög; FGF18 pärlor är dränkta i en koncentration av 0,5 mg / ml och pärlor för småmolekylära inhibitorer ofta indränkt i en koncentration av 100 | iM. Även om detta är mycket högre än de koncentrationer som normalt används för att behandla celler i lösning detta är nödvändigt eftersom mängden tillväxtfaktorer och droger absorberas av pärlorna och sedan släppts är svåra att mäta direkt men förmodligen släktente lägre nivåer än detta in vivo. Som ett resultat en serie koncentrationer måste testas för varje molekyl används för att bestämma en effektiv dos.
Denna teknik är också tillämplig på ett brett spektrum av andra vävnader, såsom somiter 24, under utveckling och kan användas på embryon in ovo eller i odlingar, såsom EG kultur 25. Det är även möjligt att odla odlade celler som utsöndrar specifika tillväxtfaktorer som pellets, som därefter kan ympas in i u-embryon på samma sätt 26.
Kombinationen av tillgänglighet, enkel manipulation och låg kostnad gör kycklingembryon en utmärkt modell för utveckling. Som transgena tekniker alltmer tillämpas på fågelarter och genetiskt modifierade linjer i både kycklingar 7 och vaktlar 27 blir tillgängliga kombinationen av klassisk embryo ympning tekniker med dessa modifierade fåglar redan tillhandahålla nya insikter i deveckling 8,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
