Abstract
닭 배아를 사용하여 직접 성장 인자 또는 유전자 발현 및 신호 전달 경로의 활성화에 대한 신호 경로의 어느 특정 억제제의 효과를 테스트 할 수있다. 이 기술은 특정 시간에 대한 정확한 정의 발달 단계에서 신호 전달 분자의 전달을 허용한다. 이 배아 수확 및 유전자 발현 원위치 혼성화, 또는 면역 염색으로 관찰 신호 전달 경로의 활성화에 의해, 예를 들어, 검사 될 수 후.
U0126, MEK 억제제에 적신이 FGF18에 배어 비디오 헤파린 구슬 또는 AG 1-X2 구슬, OVO에서 사지 꽃 봉오리에 이식된다. 이 FGF18가 U0126에 의해 억제된다 MyoD 및 ERK의 인산화 및 내인성 및 FGF18 유도 모두 MyoD 발현의 발현을 유도 것을 보여줍니다. 레티노 산 길항제에 배어 구슬은 FGF18에 의해 조기 MyoD 유도를 강화시킬 수 있습니다.
이러한 접근 방식은 우리가 될 수 있습니다다른 성장 인자 및 억제제와의 광범위한 혼성 쉽게 배아에서 다른 조직으로 구성된다.
Introduction
조류 배아는 몇 년 1 개발의 연구를위한 강력한 도구를 제공하고 있습니다. 가장 유용한 특징 중 하나는 상대적으로 쉽게 조작 할 수 있다는 것이다. 외부 개발은 세포의 운명 2,3- 연구를위한 고전 메추라기 병아리 키메라 시스템과 같은 예를 포함하여 다양한 micromanipulations를 배아 액세스하는 달걀을 열고 수행하는 것을 가능하게 개발 4,5- 동안 특정 조직에서 과발현을위한 레트로 바이러스의 주입 및 이식편 문화는 발달 신호 소스 (6)를 식별합니다. 최근에 GFP를 발현하는 형질 전환 닭 줄에서 이식과 레이블이없는 호스트 사이에 발생하는 키메라 고전 이식 및 유전자 변형의 조합이 개발 7,8에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다.
조류 배아 조작 될 수있는 용이성을 사지 공부 그것을 우수한 모델을 만들었다개발 9. 생체 현상 사지 특정 성장 인자의 적용은 사지 10,11 패터닝을 변경하고이 프로세스 (12)에 대한 통찰력을 제공하고 요소를 식별하는 수단이되고있다. 이 접근법은 또한 근육 발달을 조절하는 인자를 연구하는 데 사용되었으며, 이러한 Wnts 13, 14, BMPs에 HGF (15) 같은 다양한 신호들에 대한 역할을 밝혀냈다.
최근 이러한 기술은 사지 싹 근육 조직의 유전자 발현을 제어하는 신호를 조사하기 위해 사용되었으며, FGF18 및 레티노 산 사이의 상호 작용이 MyoD 식 (16)의 타이밍을 제어 할 수 있음을 보여 주었다. 비드 상에 로딩하고 정의 발달 단계에서 특이 조직에 직접 그래프트 될 수 성장 인자 및 작은 분자의 조합을 이용하여 개발 중에 거의 모든 시간과 지역을 개입 할 수있는 기회를 제공한다. 이것은 INVE하는데 사용 된체절 패터닝 17, 18, 신경 사양 (19), 신경 크레스트 마이그레이션 (20)과 축 연장 (21)를 포함하여 많은 프로세스를 stigate.
여기에서 우리는 닭 사지 개발에 중 성장 인자 또는 억제제에 배어 구슬을 접목하는 방법을 설명합니다. 이것은 계내 혼성화에 근육과 특정 유전자의 발현을 분석하여 이들 신호 근육 생성에 미치는 영향을 결정하기 위해 사용되어왔다. 우리는 레티노 산 또는 특정 신호 전달 경로의 소분자 저해제로서 작은 소수성 분자에 대한 성장 인자, 또는 AG 1-X2 구슬에 사용되는 헤파린 침지 비드를 사용하여 이식 조직을 설명한다. 그러나 다른 구슬도 FGFs (22)과 쉬 (23)을 모두 전달하는 데 사용 된 어떤 사용할 수 있습니다.
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Protocol
윤리 문 : 이러한 모든 실험 동물 관리 및 노팅엄 대학의 윤리 지침을 따르십시오.
손톱에 대한 헤파린 비즈 1. 준비
- 사용하기 전에 PBS에 철저 헤파린 구슬을 씻으십시오. 참고 : 비즈는 PBS의 슬러리로 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- PBS의 1 ml의 드롭에 20 μL 피펫으로 주식에서 그들을 제거하여 이식을 위해 구슬을 선택합니다. 그런 다음 3cm 페트리 접시에 PBS의 20 μL 드롭에 구슬을 전송하는 2 μL로 설정 마이크로 피펫을 사용합니다. P2 피펫 팁으로 선택한 구슬을 전송, 현미경을 해부 스테레오를 사용하여 크기에 따라 구슬을 선택하고, 그 약 100 μm의 직경은 이상적이다.
- 구슬에서 PBS를 제거합니다. 20 μL 피펫 및 미세 워치 집게와 모세관 작용에 의해 잔류 액체와 액체의 대부분을 제거합니다. 주 : 사실상 성장하므로 가능한 한 많이 제거하는 것이 중요이 비드에 첨가 될 때, R는 희석되지 않는다.
- 비드에 직접 성장 인자 피펫. FGF18 위해 PBS에 0.1 % BSA 0.5 ㎎ / ㎖에서 재구성 재조합 FGF18의 0.5 μl를 추가합니다. 증발 액체를 방지하기 위해 접시의 가장자리 주위에 물 몇 방울을 놓습니다.
- RT에서 1 시간 동안 인큐베이션 비즈. 파스퇴르 피펫과 접시에서 물 방울을 제거하고 이식에 대한 준비가 얼음에 배치합니다.
- 를 시각화하기 위해 이식 전에 (투명 구슬) 전송을 2 % 페놀 레드에 4-5 구슬이 필요합니다. 배아에 전송하기 전에 PBS로 씻어.
손톱 확장을위한 AG 1-X2 비즈 2. 준비
- 0.2 N 포름산 유도체 화 비드를 사용하는 종래.
- 이 사용을 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 구슬을 전송하는 주걱을 수행합니다. 0.2 N 포름산의 1ml를 추가하고 1 시간 동안 진탕 플랫폼에 씻는다.
- 그런 다음 P1000 피펫으로 포름산을 제거하고 1로 교체ml의 물. 1 시간 동안 세척하고 포름산 나머지 제거하기 위해 여섯 번 반복합니다.
- P1000 피펫에 남아있는 액체를 제거하고 4 ℃에서 구슬을 저장합니다. 주 :이 단계에서 모든 잔여 수분을 제거 할 필요가 없다.
- 3cm 페트리 접시에 작은 주걱을 사용하여 주식에서 약 5 ~ 10 μL 볼륨의 구슬의 작은 펠렛을 제거하고 DMSO 1 ㎖를 추가 (또는 약물에 용해 용매 중). 참고 :이 적당한 크기의 사람들을 선택할 수있는 수백 개의 구슬을 제공해야한다.
- 그런 다음 다른 3cm 페트리 접시에 용매의 20 μL 드롭에 약 100 μm의 직경 비즈를 전송하는 데 2 μL로 설정 P2 피펫을 사용합니다.
- 20 μL 피펫과 2 μL 피펫과 잔류 용매와 용매 제거합니다. 약 20 μL를 적용 할로 교체하십시오.
주 : 일관성 (또는 이제까지 용매가 사용되는) DMSO에 100 μM의 농도로 약물을 용해 들어일부 작은 분자 억제제 -80 ° C에서 20 μL 및 저장소로 나누어지는이 불안정하고 반복 동결 융해를 방지하는 것이 가장 좋습니다. 필요한 경우 다음 구슬을 몸을 담근 전에 원하는 농도로 약물을 희석. 효과적인 농도는 각각의 약물에 대한 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. - 1 시간 동안 품어. 이러한 분자의 대부분은 민감한 빛으로 빛으로부터 보호합니다.
- 물에 용해 2 % 페놀 레드의 20 μL에 2 μL로 설정 P2 피펫으로 전송에게 4-5 구슬을 이식하기 전에. 구슬을 시각화하기 위해 스테레오 해부 현미경을 사용하여이 단계를 수행합니다. 고급 시계 제조 집게와 단일 비드 또는 와이어 루프를 제거하고 배아에 전송하기 전에 PBS로 씻어. 이 활동의 손실이 발생할 수 있으므로 사용하기 전에 15 분 이상 2 % 페놀 빨간색 구슬을 두지 마십시오.
3. 텅스텐 바늘을 준비
- 3-4cm 길이로 미세 텅스텐 와이어를 잘라. 의 끝 부분에 와이어의 한 조각을 삽입분젠 버너에 유리 파스퇴르 피펫과 녹아은 위치에 고정합니다. 그들이 사용하는 동안 손상된 경우 여분이 있다는 것을 확인하기 위해 10 바늘까지 준비합니다.
- 토치 불꽃으로 와이어의 끝을 배치하고 (2 ~ 3 분 정도) 텅스텐 흰색으로 점등과 끝이 날카로운 될 때까지 기다립니다. 주 : 사용 중에 바늘은 세정 될 수 있으며, 필요에 따라 토치에 re-은 날카롭게.
주의 : 이러한 바늘은 또한 비드를 전송하는 루프를 만들기 위해 사용될 수있다. 부드럽게 벤치에 바늘을 터치하고 그 루프를 형성하도록 구부려 것이다.
구슬 이식 4. 준비 배아
- 그들이 원하는 단계 (대부분의 사지 꽃 봉오리 조작 3-5 일)에 도달 할 때까지 무딘 끝이 위로 알을 품어. 쉘을 중단 한 후 껍질을 제거하고 배아를 노출하는 집게를 사용하는 무딘 끝에 무딘 집게 탭을 사용. 달걀 껍질 막 않도록 확인도 제거됩니다.
참고 : PBS의 1-2 ml를 지원하기 위해 파스퇴르 피펫으로 추가 할 수 있습니다이 멤브레인은 노른자을 고수합니다. 부드럽게, 노른자의 표면에 PBS를 피펫 노른자를 손상하지 않도록주의하면서 집게로 막을 잡고 살짝 떨어져 계란에서 잡아 당깁니다. - 10 ML의 주사기와 계란 19 G 바늘에서 알부민 5 ㎖까지 제거합니다. 배아 생존율을 감소시킬 수있다 큰 볼륨의 제거와 같은 계란을 밀봉하는데 사용되는 테이프와 접촉하지 않는 배아를 보장하기 위해 필요한만큼만 받아.
- 배아는 15 (100) U 페니실린을 포함하는 PBS ml의 0.1 mg의 스트렙토 마이신 / ml의 예술가 인도 잉크의 5-6 방울을 추가 시각화합니다. 0.5을 주입 ml로 직접 1 ML의 주사기와 배아와 25 G 바늘 아래.
- 탈수하지 않는 배아를 보장하기 위해 난자에 1 % 소 태아 혈청과 100 U 페니실린과 0.1 mg의 스트렙토 마이신 / ml의 PBS의 2-3 ML을 추가합니다. 날카롭게 시계 제작자의 집게를 사용하여 난황 막을 제거하고 개발 사지 싹 통해 양막을 엽니 다. 배아가 건조하지 않도록하고필요한 경우, 더 PBS / FCS를 추가합니다.
참고 : 사지 싹이 명확 배아의 측면에 쌍의 outgrowths로 볼 수있다. 이 단계에서 배아는 오른쪽이 일반적으로 가장 위에 켜집니다. 결과는 오른쪽 팔다리에 구슬을 접목과 반대측 컨트롤과 같은 왼쪽 사람을 사용하는 일반적으로 쉽습니다. - 비드가 이식 될 사지 꽃 봉오리에 절개를 만들기 위해 날카롭게 텅스텐 와이어를 사용합니다. 젊은 단계에서이 어렵지만 가능한 사지 꽃 봉오리를 통해 모든 방법을 절단하지 마십시오.
참고 : 구형 배아 (HH 스테이지 22 이상)에서는 그 래프팅뿐만 사지 자체가 작은 봉오리 같이이 더 어렵 이하 단계에서 사지 싹의 특정 영역을 선택할 수있다. 그것은 사지 봉오리 그래서, 특히 젊은 단계에서, 비드는 근위 사지에 남아 이식 비드지나 성장할 것을 기억하는 것이 중요하다. - 어느 극세 WA를 이용한 성장 인자 또는 약물 중 하나에서 비드 데리tchmakers 집게 또는 텅스텐 바늘로 만든 루프. 비드가 DMSO 또는 페놀 레드 하나에 침지 된 경우, 배아에 적용하기 전에 PBS로 헹군다. 집게 / 와이어 루프와 배아에 구슬을 전송합니다. 그런 다음 절개로 비드를 삽입 날카롭게 텅스텐 와이어를 사용합니다.
- 배아가 수화 유지되도록 보장 계란에 PBS / FCS의 1-2 ML을 추가하지만이 배아를 손상 비드가 빠질 될 수 있습니다로 배아 자체에 직접 적용하지 마십시오. 테이프로 계란을 밀봉하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
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Representative Results
HH 단계에서 21 MyoD는 염색이 개발 somites (그림 1A)의 myotome에서 볼 수 있지만, 사지 근육 아세포 개발에 표시되지 않습니다. 그림 1B는 FGF18 구슬 이식 다음 MyoD 6 시간 동안 현장 하이브리드에 보여줍니다. 사지 반대측에는 발현은 없지만 MyoD 비드 부근 아세포에서 유도된다. U0126에 배어 구슬, MEK, MyoD (그림 1C)의 블록 FGF18 유도의 특정 억제제를 공동 이식. 마찬가지로 HH 단계 (21)에서 U0126 비드를 접목하고 24 시간이 치료 반대측 사지 (그림 1D, E)에 비해 MyoD의 내생 발현을 감소 후 MyoD 식을 찾고.
HH 단계 19 FGF18에서 사지 싹에서 MyoD (그림 1 층)을 유도하지 않습니다. Figu (구슬 그러나 공동 이식은 FGF18에 배어 및 레티노 산 길항제는 BMS493이를 극복 할 수 자궁외 MyoD가 검출다시 1G)
그림 1I는 FGF18 빠른 인산화를 유도하는 것을 보여줍니다 동안 그 FGF18을 확인하려면 MEK 배아를 통해 행동하는 것은 1 시간 구슬 이식 후 수확 인산화 된 ERK에 대한 면역 염색 하였다되어, MEK. 그림 1H의 목표는 이식 후 FGF18 비드 1 시간의 시야 이미지를 보여줍니다 이식 비드 주위 ERK의. 그림 1J은 이러한 이미지의 오버레이를 보여줍니다. 제어 비즈 ERK의 인산화를 유도하지 않는 0.1 % BSA에 배어 (그림 1 K, L, M)
사지 그림 1. MyoD 식 MyoD (A)를 표현하지 않는 HH 단계 21. ERK의 인산화를 통해 FGF18 및 레티노 산에 의해 조작되지 제어 사지를 조절되지만 조기 발현은 (FGF18 비드를 이식 후 6 시간을 감지B). 공동 이식 FGF18 및 U0126 구슬 블록이 유도 (C). 내인성 MyoD 발현 HH 스테이지 21의 (D)에서 볼 수있다 그러나 이것은 U0126 (E)에 침지 비드 래프팅에 의해 차단된다. 이전 사지 싹에서 조기 MyoD 표현은 FGF18 (F)에 의해 유도되는 것이 아니라 FGF18 및 레티노 산 길항제 BMS493 (G)에 적신 공동 접목 구슬에 의해 유도된다. 브라이트 (H), 형광등 (Ⅰ) 및 안티 phosphoERK에 대한 면역 염색 HH21 사지의 (J) 이미지를 병합 : HH21 사지로 이식 FGF18 비즈 1 시간 후 ERK의 인산화를 유도한다. BSA에 배어 제어 비즈 ERK의 인산화를 유발하지 말 것 (K), 형광등 (L)를 및 안티 phosphoERK에 대한 면역 염색 HH21 사지의 (M) 이미지를 합병했다. 이 수치는 목 등 2014 년 16에서 수정되었습니다. 블랙 별표 : 헤파린 구슬; 흰색 ASTE위험 : AG 1-X2 비즈; 화살표 사지 싹에서 자궁외 MyoD 식을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
오보에서 조직 개발에 직접 적용 비드 이식편의 사용은 그들이 적용되는 발달 단계 및 노출 기간에 걸쳐 탁월한 제어를주는 개발 중에 성장 인자 신호 전달의 역할을 해부 강력한 도구이다.
분자의 각 유형에 대한 비드의 선택은 중요하다. 그것은 각각 실험적 이들 비드에 억제제의 효과를 시험 할 필요가 있지만, 여기에 설명 된 이러한 억제제 및 레티노 산 작은 소수성 분자는 보통 유도 AG 1-X2 비드에 잘 결합한다. 유사 성장 인자 것이 비드의 다른 유형을 테스트 할 필요가있을 수있다. 일부 구슬 이식을 수행 할 수있을만큼 오랫동안 그 레이블을 것이다 조작하지만 PBS에 린스 페놀 레드 짧은 치료 기간 동안 시각화하기 어려울 수 있도록 투명하고 있습니다.
구슬을 준비 할 때, 특히 억제제로 적셔되어있는S, 그것을 가능한 한 광으로부터 보호하는 것이 중요하다. 초기 치료 기간 동안 및 조작하는 동안 그들은 포함되어야하고, 구슬이 전송되는 경우에만 제거. 이 시약 중 일부는 불안정 제대로 저장되지 않은 경우 오해의 소지가 부정적인 결과를 줄 수있는 것처럼 갓 해동 분취 액을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 또한 비드의 효과를 감소시킬 수있는이 같은 이식 전에 너무 오랫동안 페놀 레드에 침지를 남기지없는 것도 중요하다.
양 성장 인자 및 약물, 이들 비드 이식에 사용 농도는 종종 매우 높다; FGF18 비드는 종종 100 μM의 농도로 적셔 소분자 억제제 0.5 ㎎ / ㎖ 및 비드 농도에 침지된다. 이것은 일반적으로이 비드에 의해 흡수하고 방출 성장 인자 및 약물의 양이 필요하다 용액에 세포를 치료하는 데 사용되는 농도보다 훨씬 높지만 직접하지만 아마도 장군을 측정하기 어려운이 생체 내에서보다 낮은 수준의 테. 결과적으로 농도의 범위는 유효 용량을 결정하기 위해 사용되는 각각의 분자에 대해 테스트되어야한다.
개발하는 동안, 24 somites 및 EC 배양 (25), 오보 또는 배양에서 배아에 사용될 수있는 바와 같이,이 기술은 또한, 다른 조직의 넓은 범위에 적용 등이다. 그 다음 동일한 방식으로 (26)에 현상 배아에 그래프트 될 수 펠릿 등의 특정 성장 인자를 분비하는 세포를 배양하여 성장하는 것이 또한 가능하다.
접근성의 조합, 조작의 용이성 및 저비용 닭 배아 발달의 우수한 모델을 만든다. 형질 전환 기술이 점점 조류 종 모두 닭의 유전자 변형 라인에 적용되면 7 메추라기 (27)는 이미 드에 새로운 통찰력을 제공하고 이러한 수정 조류와 기술을 접목 고전 배아의 조합을 가능하게velopment 8,28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
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