Abstract
Usando embriões de galinha, é possível testar directamente os efeitos de ambos os factores de crescimento específicos ou inibidores das vias de sinalização sobre a expressão do gene e a activação das vias de transdução de sinal. Esta técnica permite a entrega de moléculas de sinalização em estágios de desenvolvimento definidos com precisão para horários específicos. Após esta embriões podem ser colhidas e a expressão de genes examinados, por exemplo, por hibridação in situ, ou a activação de vias de transdução do sinal observado com a imunocoloração.
Neste contas de heparina vídeo embebido em FGF18 ou grânulos AG 1-X2 embebidas em U0126, um inibidor MEK, são enxertados no botão do membro in ovo. Isto mostra que induz a expressão de FGF18 MyoD e fosforilação de ERK e tanto endógena e FGF18 induzida MyoD expressão é inibida por U0126. Grânulos embebidos em um antagonista do ácido retinóico pode potenciar a indução precoce MyoD por FGF18.
Esta abordagem pode ser-nosed com uma vasta gama de diferentes factores de crescimento e inibidores e é facilmente adaptado a outros tecidos no embrião em desenvolvimento.
Introduction
Embriões de aves forneceram uma ferramenta poderosa para o estudo do desenvolvimento de muitos anos 1. Uma das suas características mais útil é que eles são relativamente fáceis de manipular. Desenvolvimento externo faz com que seja possível abrir o ovo para aceder ao embrião e executar várias micromanipulations incluindo exemplos, tais como o sistema de quimera de codorniz-do pintainho clássica para o estudo de 2,3 destino celular, a injecção de retrovirus para a sobre-expressão em tecidos específicos durante o desenvolvimento 4,5 e cultura explante para identificar fontes de sinalização de desenvolvimento 6. Mais recentemente quimeras gerado entre hosts não marcados com enxertos de uma linha de galinha transgênica expressando GFP mostrou que a combinação de enxertia clássica e modificação genética pode fornecer importantes insights sobre o desenvolvimento 7,8.
A facilidade com que o embrião aviário pode ser manipulado fez-se um excelente modelo para o estudo do membrodesenvolvimento 9. Aplicação de fatores de crescimento específicos para membros em desenvolvimento in vivo tem sido fundamental na identificação de fatores que alteram membro padronização 10,11 e continua a fornecer insights sobre este processo 12. Essa abordagem também tem sido usado para estudar os fatores que regulam o desenvolvimento muscular e descobriu papéis para numerosos sinais como Wnts 13, BMPs 14 e 15 HGF.
Recentemente, esta técnica tem sido utilizada para investigar os sinais que controlam a expressão do gene miogénica nos brotos dos membros e tem mostrado que as interacções entre o ácido retinóico e FGF18 pode controlar o tempo de expressão de 16 MyoD. Usando uma combinação de fatores de crescimento e moléculas pequenas que podem ser carregados em esferas e, em seguida, enxertadas diretamente em tecidos específicos em estágios de desenvolvimento definidas dá a oportunidade de intervir em quase qualquer hora e região durante o desenvolvimento. Isto tem sido utilizado para investigate muitos processos, incluindo somite padronização 17,18, especificação neural 19, migração da crista neural 20 e 21 de extensão do eixo.
Descrevemos aqui um método para o enxerto grânulos embebidos em ambos os factores de crescimento no desenvolvimento de inibidores ou membros de galinha. Este foi usado para determinar os efeitos destes sinais na miogénese, analisando a expressão do gene específico do músculo com a hibridização in situ. Nós descrevemos enxertos utilizando heparina grânulos embebidos, os quais são utilizados para factores de crescimento, ou grânulos AG 1-X2 para pequenas moléculas hidrófobas tais como o ácido retinóico ou pequenas moléculas inibidoras de vias específicas de sinalização. No entanto outros grânulos também estão disponíveis, que têm sido utilizadas para entregar ambas FGF Shh 22 e 23.
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Protocol
Declaração de Ética: Todas estas experiências seguem o cuidado com os animais e as diretrizes éticas da Universidade de Nottingham.
1. Preparação de heparina Beads para enxertia
- Lave cuidadosamente contas de heparina em PBS antes da utilização. Nota: contas podem ser armazenadas a 4 ° C como uma suspensão em PBS.
- Seleccionar os grânulos para enxerto, removendo-os do estoque com uma pipeta de 20 uL a uma queda de 1 ml de PBS. Em seguida, usar uma micropipeta ajustado para 2 ul de transferência de contas em uma gota de 20 ul de PBS numa placa de petri de 3 cm. Escolha grânulos com base no tamanho e, usando um aparelho de som microscópio de dissecação, transferir grânulos selecionados com uma ponteira P2; aqueles em torno de 100 mm de diâmetro são ideais.
- Remover o PBS a partir dos grânulos. Remover a maior parte do líquido, com uma pipeta de 20 uL e o líquido residual por acção capilar com fórceps de relojoeiro finas. Nota: É importante remover tanto quanto possível de modo que o crescimento factoR não é diluído quando é adicionado aos grânulos.
- Pipetar o factor de crescimento directamente sobre as esferas. Para FGF18 adicionar 0,5 mL de FGF18 recombinante reconstituído a 0,5 mg / ml em 0,1% de BSA em PBS. Coloque várias gotas de água em torno das bordas do recipiente para evitar que o líquido se evapore.
- Incubar os grânulos durante 1 h à TA. Retirar as gotas de água do prato com uma pipeta Pasteur e colocar em gelo pronto para enxertia.
- Se necessário (para contas transparente) a transferência de contas de 4-5 a 2% de fenol vermelho antes de enxertia para ajudar a visualizar-los. Enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião.
2. Preparação de grânulos AG 1-X2 para enxertia
- Antes de usar derivatizar os grânulos com 0,2 N de ácido fórmico.
- Para fazer isso uso de uma espátula para transferir esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1 mL de 0,2 N de ácido fórmico e lavar numa plataforma de agitação durante 1 h.
- Em seguida, retire o ácido fórmico com uma pipeta P1000 e substituir por umml de água. Lavar durante 1 hora e repetir seis vezes para remover o restante ácido fórmico.
- Remover o líquido remanescente com uma pipeta P1000 e armazenar as pérolas a 4 ° C. Nota: Não é necessária para remover a água residual todos nesta fase.
- Retirar uma pequena pastilha de grânulos de cerca de 5-10 ul de volume a partir do estoque usando uma pequena espátula numa placa de petri de 3 cm e adicionar 1 ml de DMSO (ou qualquer outro solvente, o fármaco é dissolvido em). Nota: Isso deve fornecer várias centenas de grânulos a partir da qual para selecionar aqueles do tamanho certo.
- Em seguida, utilizar uma pipeta P2 definido para 2 ul para transferir os grânulos de cerca de 100 um de diâmetro para uma gota de 20 ul de solvente na outra placa de Petri de 3 cm.
- Remover o solvente com uma pipeta de 20 uL e qualquer solvente residual com uma pipeta de 2 ul. Substituir com 20 ul de fármaco a ser aplicado.
NOTA: Para consistência dissolver o medicamento a uma concentração de 100 uM em DMSO (ou que nunca é utilizado solvente),aliquota em 20 ul e armazenar a -80 ° C, tal como algumas pequenas moléculas inibidoras são instáveis e é melhor para evitar ciclos repetidos de congelação-descongelação. Se necessário, em seguida diluir a droga para a concentração desejada antes de embeber os grânulos. As concentrações eficazes podem necessitar de ser determinada empiricamente para cada fármaco. - Incubar durante 1 h. Proteger da luz como muitas destas moléculas são sensíveis à luz.
- Antes de enxerto de transferência 4-5 grânulos com uma pipeta P2 definido para 2 mL em 20 mL de 2% de fenol vermelho dissolvidos em água. Execute esta etapa utilizando um microscópio de dissecação estéreo para visualizar as esferas. Remover um único talão com relojoeiros pinça fina ou um laço de arame e enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião. Não deixe grânulos em 2% de fenol vermelho por mais de 15 min antes do uso, pois isso pode causar perda de atividade.
3. Preparação de tungstênio Needles
- Corte fino fio de tungstênio em 3-4 comprimentos cm. Inserir um pedaço de fio para dentro da extremidade deuma pipeta de Pasteur de vidro e derreter em um bico de Bunsen para fixar na posição. Prepare-se para 10 agulhas para garantir que não há peças de reposição se eles estiverem danificados durante a utilização.
- Coloque a extremidade do fio em uma chama maçarico e mantê-lo lá até que o tungstênio brilha branco e na ponta é afiada (cerca de 2-3 min). Nota: Durante a utilização a agulha pode ser limpo e re-afiada no maçarico, conforme necessário.
NOTA: Estes agulhas também pode ser usado para fazer ciclos de transferência de grânulos. Toque suavemente a agulha para o banco e que se curva para formar um laço.
4. Os embriões Preparando para Bead Enxertos
- Incubar os ovos com o brusco fim até que eles atinjam o estágio desejado (3-5 dias para a maioria das manipulações de bud membro). Usando uma pinça sem corte torneira no fim brusco para quebrar a casca e depois usar a pinça para remover a casca e expor o embrião. Certifique-se a membrana da casca do ovo também é removido.
NOTA: 1-2 ml de PBS pode ser adicionado com uma pipeta de Pasteur para auxiliarisso se a membrana adere à gema. Pipeta suavemente o PBS sobre a superfície da gema, segure a membrana com a pinça, tomando cuidado para não danificar a gema, e puxe-o para longe do óvulo. - Remove-se a 5 ml de albumina de ovo com uma seringa de 10 ml e uma agulha 19 G. Leve somente tanto quanto necessário para assegurar o embrião não faz contato com a fita usada para selar o ovo como a remoção de volumes maiores podem reduzir as taxas de sobrevivência de embriões.
- Para visualizar o embrião adicionar 5-6 gotas de tinta india artistas para 15 mL de PBS contendo 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml. Injectar 0,5-1 ml diretamente sob o embrião com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25 G.
- Adicionar 2-3 ml de PBS com 1% de soro fetal de vitelo e 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml para dentro do ovo para assegurar o embrião não desidrata. Usando afiadas relojoeiros fórceps remover a membrana vitelina e abrir o amnion ao longo dos brotos de membros em desenvolvimento. Certifique-se de que o embrião não secar eSe necessário, adicione mais PBS / FCS.
NOTA: Os brotos dos membros pode ser visto claramente como excrescências emparelhados sobre o flanco do embrião. Nessas etapas o embrião vai virar o lado direito é tal normalmente mais elevada. Como resultado, é normalmente mais fácil de enxertar miçangas nas extremidades direita e use os que foram deixados como controle contralateral. - Usar um fio de tungsténio afiada para fazer uma incisão no botão do membro em que o talão irá ser implantado. Evite cortar todo o caminho através do botão do membro, sempre que possível, embora em estágios mais jovens isso é difícil.
NOTA: Em embriões mais velhos (HH estágio 22 e acima) é possível seleccionar regiões específicas do broto de membro para enxertia, mas em estágios mais jovens isto é mais difícil como o membro brotar em si é pequeno. É também importante recordar que o botão de membro irá crescer passado o grânulo enxertado assim, especialmente nas fases mais jovens, o rebordo irá permanecer no coto proximal. - Pegar um talão de qualquer fator de crescimento ou de drogas usando wa extra finotchmakers fórceps ou um laço feito de uma agulha de tungstênio. Se o talão foi embebido em DMSO ou vermelho de fenol, lavar em PBS antes de se aplicar ao embrião. Transferir o talão para o embrião com o ciclo de fórceps / fio. Em seguida, use o fio de tungstênio afiadas para inserir o talão na incisão.
- Adicionar 1-2 ml de PBS / FCS para o ovo assegurar que o embrião é mantido hidratado mas evitar aplicar directamente sobre o próprio embrião como esta pode danificar os embriões e fazer com que o cordão de ser desalojado. Fecha-se o ovo com fita e voltar para a incubadora.
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Representative Results
Na fase HH 21 MyoD não é expresso em mioblastos em desenvolvimento de membros embora coloração pode ser visto na miótomo dos somitos em desenvolvimento (Figura 1A). A Figura 1B mostra a hibridização in situ para MyoD 6 horas no seguimento de um enxerto FGF18 grânulo. MyoD é induzida em mioblastos perto do rebordo, enquanto não há expressão no membro contralateral. Co-enxerto de um grânulo embebido em U0126, um inibidor específico da MEK, a indução de blocos FGF18 MyoD (Figura 1C). Da mesma forma um talão U0126 miocárdio na fase HH 21 e olhando para a expressão MyoD após 24 h reduz a expressão endógena de MyoD em comparação com o membro contralateral não tratado (Figura 1D, E).
Em brotos de membros no HH estágio 19 FGF18 não induz MyoD (Figura 1F). No entanto a co-enxerto dos grânulos embebidos em FGF18 e o antagonista do ácido retinóico BMS493 podem ultrapassar este e MyoD ectópica é detectado (Figure 1G)
Para confirmar que o FGF18 actuar através de embriões de MEK foram colhidas 1 hora depois do grânulo do enxerto e imunocoradas para a ERK fosforilada, o alvo da MEC. A Figura 1H mostra uma imagem de campo claro de um FGF18 talão 1 h após o enxerto enquanto a Figura 1I mostra que FGF18 induz fosforilação rápida de ERK em torno do cordão enxertado. Figura 1J mostra uma sobreposição destas imagens. Esferas de controlo embebidos em BSA a 0,1% não induzir fosforilação de ERK (Figura 1K, G, H)
Figura 1. MyoD expressão nos membros é regulada por FGF18 e ácido retinóico através de fosforilação de ERK. Membros de controlo não manipuladas na fase HH 21 não expressam MyoD (A), mas é detectada expressão prematura 6 horas após a enxertia de um grânulo FGF18 (B). Co-enxerto FGF18 e U0126 contas blocos esta indução (C). MyoD expressão endógena é visto na fase HH 21 (D), mas este é bloqueado por enxerto de grânulos embebidos em U0126 (E). Em brotos de membros anteriores de expressão MyoD prematura não é induzida por FGF18 (F), mas é induzida pela co-grânulos embebidos em FGF18 enxertia e o antagonista do ácido retinóico BMS493 (L). Grânulos FGF18 enxertadas em membros HH21 induzir fosforilação ERK após 1 hr: brightfield (H), fluorescentes (I) e fundiu imagens (J) de um membro HH21 histoquímica para anti-phosphoERK. Esferas de controlo embebidos em BSA não induzem a fosforilação ERK: (K), fluorescentes (L) e fundiu imagens (M) de um membro HH21 histoquímica para anti-phosphoERK. Este valor foi modificado a partir Mok et al, 2014 16. Asteriscos Preto: esferas de heparina; aste brancoriscos: AG pérolas 1-X2; setas mostram expressão MyoD ectópica em brotos dos membros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A utilização de enxertos de talão aplicados directamente para o desenvolvimento de tecidos in ovo é uma ferramenta poderosa para dissecar o papel do crescimento factor de sinalização durante o desenvolvimento dando controlo sem paralelo através da fase de desenvolvimento em que elas são aplicados e a duração da exposição.
A escolha de grânulo para cada tipo de molécula é importante. Pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como os inibidores aqui descritos e ácido retinóico, geralmente liga bem ao AG derivatizado grânulos 1-X2, embora seja necessário para testar a eficácia de cada inibidor sobre estes grânulos empiricamente. Da mesma forma, para os factores de crescimento, pode ser necessário para testar diferentes tipos de grânulo. Algumas contas são transparentes e por isso pode ser difícil de visualizar durante as manipulações, mas um curto tratamento com vermelho de fenol seguido por uma lavagem em PBS vai classificá-los por tempo suficiente para realizar o enxerto.
Ao preparar grânulos, particularmente aqueles que foram encharcados com inibidors, é importante para os proteger da luz tanto quanto possível. Durante o tratamento inicial e durante a manipulação devem ser cobertos e apenas removidos quando os grânulos estão a ser transferidos. É melhor usar alíquotas recém-descongeladas como alguns destes reagentes são instáveis e podem dar resultados negativos enganadores se não forem armazenados corretamente. Também é importante para não deixar embeber em vermelho de fenol por muito tempo antes de serem enxertados como isto pode reduzir a eficácia do grânulo.
As concentrações utilizadas para estes enxertos de grânulo, de ambos os factores de crescimento e de drogas, são muitas vezes muito elevado; FGF18 grânulos são embebidos numa concentração de 0,5 mg / ml e os grânulos para os inibidores de moléculas pequenas são frequentemente embebido numa concentração de 100 uM. Embora este seja muito mais elevada do que as concentrações normalmente utilizadas para o tratamento de células em solução Isto é necessário porque as quantidades de factores de crescimento e medicamentos absorvidos por esferas e, em seguida, libertados são difíceis de medir directamente, mas presumivelmente géneroste níveis mais baixos do que este in vivo. Como resultado, uma gama de concentrações devem ser testados para cada molécula utilizada para determinar uma dose eficaz.
Esta técnica é também aplicável a uma vasta gama de outros tecidos, tais como somitos 24, durante o desenvolvimento e pode ser usado em embriões in ovo ou em culturas, tais como a cultura CE 25. Também é possível cultivar as células cultivadas que segregam factores de crescimento específicos como pílulas grandes que podem então ser enxertadas em embriões em desenvolvimento da mesma forma 26.
A combinação de acessibilidade, facilidade de manipulação e de baixo custo torna embriões de galinha um excelente modelo de desenvolvimento. Como as tecnologias transgênicas estão cada vez mais aplicada a espécies de aves e linhas geneticamente modificados, de ambos os galinhas e codornas 7 27 tornam-se disponíveis a combinação de embrião clássica técnicas com essas aves modificadas enxerto já está fornecendo novos insights sobre desenvolvimento 8,28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
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