Abstract
El uso de embriones de pollo es posible probar directamente los efectos de cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización sobre la expresión génica y la activación de vías de transducción de señal. Esta técnica permite la entrega de moléculas de señalización en las etapas de desarrollo definidas con precisión para momentos específicos. Después de esto, los embriones pueden ser cosechadas y examinaron la expresión de genes, por ejemplo mediante hibridación in situ, o activación de las vías de transducción de señales observados con la inmunotinción.
En vídeo perlas de heparina empapados en FGF18 o AG perlas 1-X2 empapados en U0126, un inhibidor de MEK, están injertados en el esbozo de la extremidad in ovo. Esto demuestra que FGF18 induce la expresión de MyoD y la fosforilación de ERK y la expresión MyoD tanto endógenas como inducida FGF18 es inhibida por U0126. Cuentas empapados en un antagonista del ácido retinoico pueden potenciar la inducción prematura MyoD por FGF18.
Este enfoque puede ser nosotrosed con una amplia gama de diferentes factores de crecimiento e inhibidores y se adapta fácilmente a otros tejidos en el embrión en desarrollo.
Introduction
Embriones de aves han proporcionado una poderosa herramienta para el estudio del desarrollo durante muchos años 1. Una de sus características más útiles es que son relativamente fáciles de manipular. Desarrollo externo hace que sea posible abrir el huevo para acceder al embrión y realizar diversas micromanipulaciones incluyendo ejemplos tales como el sistema quimera codorniz-chick clásico para estudiar el destino celular 2,3, la inyección de los retrovirus para la sobreexpresión en tejidos específicos durante el desarrollo 4,5 y la cultura explante para identificar las fuentes de señalización de desarrollo 6. Más recientemente quimeras generada entre hosts sin marcar con injertos de una línea de pollo transgénico que expresa GFP ha demostrado que la combinación de injerto clásica y la modificación genética puede proporcionar importantes conocimientos sobre el desarrollo de 7,8.
La facilidad con la que el embrión aviar puede ser manipulado ha hecho que sea un modelo excelente para el estudio de las extremidadesdesarrollo 9. La aplicación de factores de crecimiento específicos para los miembros en desarrollo in vivo ha sido fundamental en los factores que alteran los patrones extremidad 10,11 y continúa proporcionando conocimientos sobre este proceso 12 identificación. Este enfoque también se ha utilizado para estudiar los factores que regulan el desarrollo muscular y ha descubierto roles para numerosas señales tales como Wnts 13, BMPs 14 y 15 HGF.
Recientemente, esta técnica se ha utilizado para investigar las señales que controlan la expresión génica en myogenic la yema del miembro y ha demostrado que las interacciones entre FGF18 y el ácido retinoico puede controlar el momento de la expresión de MyoD 16. Usando una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas que se pueden cargar en perlas y luego injertados directamente en los tejidos específicos en las etapas de desarrollo definidas da la oportunidad de intervenir en casi cualquier momento y la región durante el desarrollo. Esto ha sido utilizado para investigate muchos procesos incluyendo somito patrones 17,18, especificación neural 19, la migración de la cresta neural 20 y la extensión del eje 21.
Aquí se describe un método para injertar perlas empapadas en cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores en el desarrollo de las extremidades de pollo. Esto ha sido utilizado para determinar los efectos de estas señales en la miogénesis mediante el análisis de la expresión génica específica de músculo con hibridación in situ. Se describen injertos utilizando heparina empapada perlas, que se utilizan para factores de crecimiento, o perlas de AG 1-X2 para las pequeñas moléculas hidrófobas tales como el ácido retinoico o inhibidores de moléculas pequeñas de las vías de señalización específicas. Sin embargo otras perlas están también disponibles que se han utilizado para ofrecer tanto FGFs 22 y 23 Shh.
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Protocol
Declaración de Ética: Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y las directrices éticas de la Universidad de Nottingham.
1. Preparación de perlas de heparina para Injerto
- Lávese las perlas de heparina a fondo en PBS antes de su uso. Nota: los granos se pueden almacenar a 4 ° C como una suspensión en PBS.
- Seleccione los granos para el injerto por sacarlos de la población con una pipeta de 20 l en una gota 1 ml de PBS. A continuación, utilice una micropipeta establece en 2 l para transferir perlas en una gota 20 l de PBS en una placa de Petri 3 cm. Elija cuentas basadas en el tamaño y, usando un estéreo microscopio de disección, la transferencia de granos seleccionados con una punta de pipeta P2; los cerca de 100 m de diámetro son ideales.
- Retire la PBS de las perlas. Retire la mayor parte del líquido con una pipeta de 20 l y el líquido residual por capilaridad con relojeros pinzas finas. Nota: Es importante eliminar tanto como sea posible por lo que el crecimiento de factor no se diluye cuando se añade a las perlas.
- Pipetear el factor de crecimiento directamente sobre las perlas. Para FGF18 añadir 0,5 l de FGF18 recombinante reconstituido a 0,5 mg / ml en 0,1% de BSA en PBS. Coloque varias gotas de agua alrededor de los bordes del plato para evitar que el líquido se evapore.
- Se incuban las perlas durante 1 hora a RT. Retire las gotas de agua del plato con una pipeta Pasteur y colocar en hielo listo para el injerto.
- Si se requiere la transferencia (por bolas transparentes) 4-5 perlas al 2% de fenol rojo antes de injertar para ayudar a visualizar ellos. Enjuague en PBS antes de transferir al embrión.
2. Preparación de Cuentas AG 1-X2 para Injerto
- Antes de su uso derivatizar perlas con 0,2 N de ácido fórmico.
- Para ello use una espátula para transferir cuentas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 ml de 0,2 N de ácido fórmico y lavado en una plataforma de agitación durante 1 hora.
- A continuación, retire el ácido fórmico con una pipeta p1000 y reemplazar con 1ml de agua. Lave durante 1 hora y repetir seis veces para eliminar el resto de ácido fórmico.
- Retire el líquido residual con una pipeta p1000 y almacenar los granos a 4 ° C. Nota: No es necesario eliminar toda el agua residual en esta etapa.
- Retirar una pequeña pellet de perlas de aproximadamente 5-10 l de volumen de las existencias utilizando una pequeña espátula en una placa Petri 3 cm y añadir 1 ml de DMSO (o cualquier disolvente el fármaco se disuelve en). Nota: Esto debería proporcionar varios cientos de cuentas de las que permite seleccionar las del tamaño adecuado.
- A continuación, utilice una pipeta P2 se establece en 2 l de transferir cuentas de aproximadamente 100 m de diámetro a una caída de 20 l de disolvente en otra placa de Petri 3 cm.
- Eliminar el disolvente con una pipeta de 20 l y cualquier disolvente residual con una pipeta de 2 l. Reemplazar con 20 l de la droga que se aplicarán.
NOTA: Para obtener la consistencia disolver el fármaco a una concentración de 100 mM en DMSO (o que se utiliza cada vez disolvente),alícuota en 20 l y se almacena a -80 ° C, ya que algunos inhibidores de moléculas pequeñas son inestables y es mejor evitar repetida congelación-descongelación. Si es necesario después diluir la droga a la concentración deseada antes de remojo los granos. Las concentraciones eficaces pueden necesitar ser determinado empíricamente para cada fármaco. - Incubar durante 1 hora. Proteger de la luz ya que muchas de estas moléculas son sensibles a la luz.
- Antes de injerto de transferencia 4-5 perlas con una pipeta p2 establece en 2 l en 20 l de 2% de fenol rojo disueltos en agua. Realice este paso usando un microscopio de disección estéreo para visualizar las cuentas. Eliminar un solo grano con relojeros pinzas finas o un asa de alambre y enjuague en PBS antes de ser transferido al embrión. No deje perlas en un 2% de rojo fenol durante más de 15 minutos antes de su uso ya que esto puede causar la pérdida de la actividad.
3. Preparación de tungsteno Agujas
- Cortar alambre de tungsteno fino en 3-4 cm de longitud. Inserte un trozo de alambre en el extremo deuna pipeta Pasteur de vidrio y se funden en un mechero Bunsen para fijar en su posición. Prepara hasta 10 agujas para asegurarse de que hay piezas de repuesto si están dañados durante el uso.
- Coloque el extremo del cable en una llama de soplete y mantenerlo allí hasta que el tungsteno se ilumina en blanco y la punta es aguda (unos 2-3 minutos). Nota: Durante el uso de la aguja se puede limpiar y volver a afilarse en el soplete, según sea necesario.
NOTA: Estas agujas también pueden ser utilizados para hacer bucles para la transferencia de perlas. Toque suavemente la aguja para el banco y que se dobla para formar un bucle.
4. Los embriones Preparación de los injertos del grano
- Incubar huevos con el extremo romo hacia arriba hasta que alcanzan la etapa deseada (3-5 días para la mayoría de las manipulaciones extremidad Bud). Con unas pinzas contundente golpe en el extremo romo de romper la cáscara y luego usar las pinzas para quitar la cáscara y exponer el embrión. Asegúrese de que la membrana de la cáscara de huevo también se elimina.
NOTA: 1-2 ml de PBS se puede agregar con una pipeta Pasteur para ayudar conesto si la membrana se adhiere a la yema. Pipeta suavemente la PBS sobre la superficie de la yema, sujete la membrana con las pinzas, teniendo cuidado de no dañar la yema, y tire de él lejos del huevo. - Remover hasta 5 ml de albumen del huevo con una jeringa de 10 ml y una aguja de 19 G. Tome sólo tanto como sea necesario para asegurar que el embrión no tiene contacto con la cinta utilizada para sellar el huevo como la eliminación de grandes cantidades puede reducir las tasas de supervivencia de embriones.
- Para visualizar el embrión añadir unas 5-6 gotas de artistas tinta china 15 ml de PBS que contenía 100 U de penicilina y estreptomicina 0,1 mg / ml. Inyectar 0,5 a 1 ml directamente bajo el embrión con una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 G.
- Añadir 2-3 ml de PBS con 1% de suero de ternera fetal y 100 U de penicilina y estreptomicina 0,1 mg / ml en el huevo para asegurar el embrión no deshidratar. Usando afiladas pinzas de relojero quitar la membrana vitelina y abrir el amnios en los esbozos de los miembros en desarrollo. Asegúrese de que el embrión no se seque y, Si es necesario, agregue más PBS / FCS.
NOTA: Las yemas de las extremidades se pueden ver claramente como excrecencias emparejados en el flanco del embrión. En estas etapas el embrión se convertirá el lado este derecho es normalmente más alta. Como resultado normalmente es más fácil para injertar cuentas en las extremidades derechas y utilizar las que quedan como controles contralaterales. - Use un alambre de tungsteno afilado hacer una incisión en la yema de la extremidad en la que se implanta la perla. Evite cortar todo el camino a través de la yema de la extremidad cuando sea posible, aunque en etapas más jóvenes esto es difícil.
NOTA: En los embriones de más edad (estadio HH 22 y más) es posible seleccionar regiones específicas de la yema de la extremidad para injertar, pero en etapas más jóvenes esto es más difícil, ya que la extremidad del brote en sí es pequeña. También es importante recordar que el primordio de la extremidad crecerá más allá del talón injertado así, especialmente en las etapas más jóvenes, el cordón se mantendrá en la extremidad proximal. - Recoge un grano, ya sea del factor de crecimiento o de drogas utilizando wa extra finotchmakers fórceps o un lazo hecho de una aguja de tungsteno. Si el cordón se ha empapado en DMSO o rojo de fenol, enjuague en PBS antes de aplicar para el embrión. Transferir el talón al embrión con el fórceps / asa de alambre. A continuación, utilice el alambre de tungsteno afilada para insertar el cordón en la incisión.
- Añadir 1-2 ml de PBS / FCS al huevo asegurar que el embrión se mantiene hidratado pero evite aplicar directamente sobre el propio embrión ya que esto puede dañar los embriones y causar el talón sea desalojado. Sellar el huevo con cinta y volver a la incubadora.
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Representative Results
En la etapa HH 21 MyoD no se expresa en el desarrollo de las extremidades mioblastos aunque la tinción se puede ver en la miotoma de los somitas en desarrollo (Figura 1A). La Figura 1B muestra la hibridación in situ para MyoD 6 hr después de un injerto de talón FGF18. MyoD se induce en mioblastos cercanos a la perla, mientras que no hay expresión en el miembro contralateral. Co-injerto de un grano empapado en U0126, un inhibidor específico de MEK, bloques FGF18 inducción de MyoD (Figura 1C). Del mismo modo injertar un cordón U0126 en HH etapa 21 y en busca de la expresión de MyoD después de 24 horas reduce la expresión endógena de MyoD en comparación con la extremidad contralateral sin tratar (Figura 1 D, E).
En yemas de las extremidades en HH etapa 19 FGF18 no induce MyoD (Figura 1F). Sin embargo co-injerto de cuentas empapado en FGF18 y el antagonista del ácido retinoico BMS493 puede superar esto y se detecta MyoD ectópico (Figure 1G)
Para confirmar que FGF18 está actuando a través de embriones MEK se cosecharon 1 hora después del injerto talón y immunostained para ERK fosforilada, el objetivo de MEK. Figura 1H muestra una imagen de campo claro de un cordón de FGF18 1 hora después del injerto, mientras que la figura 1I muestra que FGF18 induce la fosforilación rápida de ERK alrededor de la cuenta injertado. Figura 1J muestra una superposición de estas imágenes. Cuentas de control sumergen en un 0,1% de BSA no inducir la fosforilación de ERK (Figura 1K, L, M)
Figura 1. MyoD expresión en las extremidades está regulada por FGF18 y el ácido retinoico través de la fosforilación de ERK. Extremidades de control no manipulados en HH etapa 21 no expresan MyoD (A), pero la expresión prematura se detecta 6 horas después de injerto de un cordón de FGF18 (B). FGF18 y U0126 cuentas bloques Co-injerto esta inducción (C). MyoD expresión endógena se ve en HH etapa 21 (D), pero esto se bloquea por injerto de perlas empapadas en U0126 (E). En anteriores yemas de las extremidades MyoD expresión precoz no es inducida por FGF18 (F), pero se induce por la co-injerto perlas empapadas en FGF18 y el antagonista del ácido retinoico BMS493 (G). Perlas de FGF18 injertadas en extremidades HH21 inducen la fosforilación de ERK después de 1 hora: campo claro (H), fluorescente (I) y se fusionaron (J) imágenes de un miembro HH21 immunostained para anti-phosphoERK. Bolas de control empapadas en BSA no inducen la fosforilación de ERK: (K), fluorescente (L) y (M) se fusionaron imágenes de una extremidad HH21 inmunotinción para anti-phosphoERK. Esta cifra ha sido modificado desde Mok et al, 2014 16. Asteriscos negros: gotas de heparina; aste blancoriesgos: AG perlas 1-X2; flechas muestran la expresión de MyoD ectópico en esbozos de los miembros. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso de injertos de cuentas aplicados directamente al desarrollo de tejidos in ovo es una herramienta poderosa para diseccionar el papel de la señalización del factor de crecimiento durante el desarrollo dando un control sin precedentes sobre el estado de desarrollo en que se aplican y la duración de la exposición.
La elección del talón para cada tipo de molécula es importante. Moléculas hidrofóbicas pequeños, tales como los inhibidores aquí descritos y el ácido retinoico, por lo general se unen bien a AG derivatizado perlas de 1-X2 aunque es necesario para poner a prueba la eficacia de cada inhibidor en estas perlas empíricamente. Del mismo modo, para los factores de crecimiento puede ser necesario para probar diferentes tipos de perlas. Algunas cuentas son transparentes y por lo que puede ser difícil de visualizar durante las manipulaciones, pero un corto tratamiento con rojo de fenol, seguido de un enjuague en PBS se etiquetarlos durante el tiempo suficiente para realizar el injerto.
En la preparación de perlas, particularmente aquellos que se han empapado con inhibidors, es importante para protegerlos de la luz medida de lo posible. Durante su tratamiento inicial y durante la manipulación que se deben cubrir y sólo eliminan cuando se están transfiriendo cuentas. Es mejor utilizar alícuotas recién descongelado es como algunos de estos reactivos son inestables y pueden dar resultados negativos engañosas si no se almacenan correctamente. También es importante no dejar ellos remojo en rojo de fenol durante demasiado tiempo antes del injerto ya que esto puede reducir la eficacia de la perla.
Las concentraciones utilizadas para estos injertos de talón, de ambos factores de crecimiento y drogas, son a menudo muy alta; Perlas de FGF18 se remojan en una concentración de 0,5 mg / ml y los granos de inhibidores de moléculas pequeñas a menudo se empapan a una concentración de 100 mM. Aunque se trata de mucho más alto que las concentraciones normalmente utilizadas para el tratamiento de las células en solución de esto es necesario ya que las cantidades de factores de crecimiento y fármacos absorbidos por los granos y luego liberados son difíciles de medir directamente, pero presumiblemente génerosTe niveles más bajos que este in vivo. Como resultado un intervalo de concentraciones debe probarse para cada molécula utilizada para determinar una dosis eficaz.
Esta técnica también es aplicable a una amplia gama de otros tejidos, tales como somitas 24, durante el desarrollo y puede ser utilizado en embriones in ovo o en cultivos, tales como la cultura CE 25. También es posible cultivar células cultivadas que secretan factores de crecimiento específicos como pellets que luego pueden ser injertadas en los embriones en desarrollo de la misma manera 26.
La combinación de accesibilidad, facilidad de manipulación y bajo costo hace que los embriones de pollo un excelente modelo de desarrollo. Dado que las tecnologías transgénicas se aplican cada vez más a las especies de aves y líneas modificadas genéticamente de ambos pollos 7 y 27 codornices que se disponga de la combinación de embrión clásica técnicas de injerto con estas aves modificados ya está proporcionando nuevos conocimientos sobre dedesarrollo 8,28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
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