Protocol
يصف بروتوكول عزل الخلايا اللمفاوية من المواد البشرية المريض، وبالتالي يتطلب موافقة الأخلاقية. منحت الأعمال المنجزة في هذه الدراسة من قبل أوبسالا مجلس المراجعة الأخلاقية (DNR. 2013/387).
1. عزل الخلايا وحيدة النواة (الشركات المتعددة الجنسيات) من بلاطي اللوزتين الإنسان
وينبغي اعتبار جميع المواد غير المفروزة المنشأ البشري مثل الدم أو الأنسجة أو سوائل الجسم كمادة يحتمل أن تكون مصابة: تنبيه. لذا، ينبغي اتباع ممارسات السلامة الأحيائية الموصى بها لمعالجة الأنسجة البشرية.
ملاحظة: لتجنب التلوث، يجب على جميع الحلول ومعدات زراعة الخلايا تكون عقيمة. جميع مخازن والحلول يجب أن يكون قبل تبريده وأبقى على الجليد. يجب أن تبقى الأنسجة لوزة الحلق والخلايا المعزولة والتعامل معها على الجليد.
- الحصول على اللوزتين جديدة من المرضى الذين يخضعون لاستئصال اللوزتين أو بضع اللوزة (الشكل 2). يغرق clum الأنسجةملاحظة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مليئة العقيمة هانكس محلول ملحي متوازن المثلج (HBSS) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 10 ملي الجلوتامين، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين و 1٪ مزيج مضادات الحيوية مضاد فطري (البنسلين، الستربتومايسين والامفوتريسين B).
- إبقاء الأنابيب مع عينات الأنسجة لوزة دفينة في جميع الأوقات على الجليد. محاولة معالجة اللوزتين في أقرب وقت ممكن، وفي موعد لا يتجاوز 3 ساعات بعد الاستئصال الجراحي.
- وضع لوزة على 60 ملم خلية من البلاستيك لوحة الثقافة على الجليد والحفاظ على نسيج مبلل مع HBSS. إزالة جلطات الدم مرئية، الدهنية والأنسجة الضامة مع ملقط نظيفة من سطح وزة.
- استخدام جديدة 60 ملم لوحة خلية ثقافة تحتوي على 5 مل HBSS. قطع الأنسجة أجمة وزة إلى 3-10 ملم شظايا باستخدام زوج من مقص معقم و / أو مشرط.
- إعداد الجديدة 60 ملم لوحة الثقافة خلية تحتوي على 10 مل من HBSS ووضع 100 ميكرون البلاستيكية مصفاة خلية في حل HBSS.
- نقل ديسشظايا وزة ECTED في مصفاة الخلية مع ملقط معقم. باستخدام نهاية المكبس من حقنة بلاستيكية، ضغط بسلاسة شظايا الأنسجة من خلال مصفاة الخلية. تأكد من أن شظايا وزة مغمورة تماما في HBSS.
- تجاهل مصفاة الخلية التي تحتوي على بقايا الأنسجة ونقل تعليق الخلية الناتجة عن 60 ملم لوحة خلية ثقافة إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي البلاستيك. ترك الأنبوب على الجليد، مع مواصلة العمل خطوات 1.8 و 1.9.
- في حالة اللوزتين كبيرة، أكبر من 2 سم في حجم (الشكل 2)، ضغط على شظايا وزة في اثنين من مصافى الخلية لتجنب انسداد شبكة في مصفاة.
- الحصول على الحجم النهائي من 35 مل من تعليق الخلية.
ملاحظة: في هذه الخطوة فمن الممكن لإعداد تعليق خلية لحفظ البرودة (انظر القسم 2). - إضافة 10 مل من كثافة التدرج حل مثل Ficoll إلى الجديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي. تراكب بلطف suspens الخليةأيون (الخطوة 1.9) على رأس من الحل التدرج الكثافة. تجنب خلط تعليق خلية والحل التدرج الكثافة.
ملاحظة: الحل التدرج الكثافة أن تكون درجة حرارة تصل إلى RT. - الطرد المركزي تعليق خلية في الدوار سوينغ بها في 700 x ج لمدة 20 دقيقة في RT. لا تنشيط وظيفة الفرامل على أجهزة الطرد المركزي كما الكبح سريع قد يؤدي التدرج. أيضا، استخدام أقل وظيفة تسريع المتاحة في أجهزة الطرد المركزي.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة الطرد المركزي، ومراقبة الشركات المتعددة الجنسيات باعتبارها طبقة رقيق أبيض في واجهة، وخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، الخلايا الليفية والحطام الخلية كما الرواسب في قاع الأنبوب. - جمع بعناية طبقة الشركات المتعددة الجنسيات باستخدام 10 مل الماصة. ضع تعليق خلية في 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي.
- إضافة 25 مل من PBS الجليد الباردة إلى تعليق خلية وتدور الأنبوب في 300 x ج لمدة 5 دقائق في الدوار سوينغ بها في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف باستخدام الماصة 25 ملوكرر بيليه خلية خطوة الغسيل مرتين أخريين. أخيرا resuspend الكرية خلية في 15 مل من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: بعد الخطوة غسل النهائي، فمن الممكن أن cryopreserve تعليق الخلية (انظر القسم 2). - تطبيق 10 ميكرولتر من تعليق خلية في الخلية عدادة الكريات غرفة عد وحساب عدد الخلايا تحت المجهر. الاستغناء عن كمية مناسبة من الخلايا (على سبيل المثال، 2-3 × 10 7) في أنبوب 15 مل الطرد المركزي لفصل لاحق حبة المغناطيسي. إبقاء هذه قسامة على الجليد حتى الخطوة 3.2.
2. الحفظ بالتبريد من الخلايا لوزي
- إعداد تجميد المتوسطة (90٪ FBS و 10٪ DMSO) ويبقيه على الجليد. للتخزين على المدى الطويل حفاظ على وسائل الإعلام تجميد في -20 ° C.
- تحديد العدد الكلي للخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا عدادة الكريات (الخطوة 1.15). حساب الكمية المطلوبة من المتوسط تجميد وفقا لكثافة الخلايا المجمدة المطلوب (على سبيل المثال، 10 7 الخليةق / مل من تجميد المتوسطة).
- الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق. صب طاف دون الإخلال بيليه الخلية و resuspend بيليه خلية في الجليد الباردة المتوسطة تجميد (من الخطوة 2.1).
- الاستغناء 1 مل aliquots من تعليق خلية في قارورة معقمة مصممة للتخزين على المدى الطويل في النيتروجين السائل. تجميد قارورة في غرفة الأيسوبروبانول وتخزينها في -80 درجة CO / N. للحفاظ على المدى الطويل نقل قوارير في النيتروجين السائل التي تحتوي على خزان أو -140 ° C الفريزر الخلية.
- لذوبان الجليد قارورة مع الخلايا المجمدة، تدفئة لهم بسرعة في 37 ° C حمام الماء. على الفور عند إذابة، تفريق تعليق خلية في 10 مل من قبل تحسنت HBSS (مع ملاحق، خطوة 1.1) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور الأنبوب في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة HBSS و resuspend بيليه الخلية في كثافة الخلايا المطلوبة في HBSS (مع ملاحق، خطوة 1.1).
ملاحظة: صلاحية AF الشركات المتعددة الجنسياتثالثا الذوبان هو من أهمية، حيث إن وجود الخلايا الميتة ويقلل من العائد النهائي من B تنقيته والخلايا اللمفية تي.
ملاحظة: وفقا لتجربتنا في بقاء الخلية أقل من 80٪ ويقلل من كفاءة العزل الخلية.
3. إيجابي اختيار T الليمفاوية السكان من الشركات المتعددة الجنسيات لوزي
ملاحظة 1: يعتمد هذا البروتوكول على اختيار الإيجابية للالإنسان الخلايا الليمفاوية CD3 + T من الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية باستخدام الخرز المغناطيسي بالإضافة إلى الأجسام المضادة CD3. فمن الممكن أن يبدأ هذا القسم من جديد (القسم 1) أو المجمدة (القسم 2) الشركات المتعددة الجنسيات.
ملاحظة 2: ابدأ مع 3 × 10 7 الشركات المتعددة الجنسيات. لا تتجاوز هذا الرقم الخليوي، منذ الأعمدة الانفصال قد تسد وهذا سوف يقلل من كفاءة العزل. استخدام الأعمدة أكبر إذا كان سيتم التعامل مع أكثر من الخلايا. وحدات التخزين المستخدمة في هذا البروتوكول تم الأمثل تجريبيا لعدد من الخلايا لناإد في الإعداد التجريبية لدينا.
- إعداد المخزن المؤقت فصل [PBS (درجة الحموضة 7.2)، و 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 ملي EDTA]. تصفية المخزن المؤقت الانفصال من خلال 0.45 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تدور تعليق الشركات المتعددة الجنسيات (الخطوة 1.14) في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. resuspend الكرية الناتجة الخلية في 240 ميكرولتر (80 ميكرولتر في 10 7 خلايا) من العازلة فصل الجليد الباردة. نقل تعليق الخلية في أنبوب معقم 2 مل.
- إضافة 20 ميكرولتر من CD3 الأجسام المضادة المغناطيسي لحل الخلية. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر لطيف للحفاظ على الخلايا في التعليق.
- نقل عن لتعليق الخلية في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل الجليد الباردة عازلة فصل لغسل الخلايا.
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار سوينغ بها.
- وفي الوقت نفسه تعيين ما يصل الفاصل المغناطيسي والعمود. إرفاق فاصل المغناطيسي لموقف ووضع عمود في separator. غسل العمود من خلال تطبيق 500 ميكرولتر من العازلة فصل الجليد الباردة. تجاهل التدفق من خلال.
- وضع جديد أنبوب جمع 15 مل تحت العمود. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد.
- تجاهل طاف (الخطوة 3.5) من خلال الماصة و resuspend بلطف بيليه الخلية في 500 ميكرولتر العازلة الفصل. تطبيق تعليق خلية على رأس العمود قبل غسلها والسماح لها من خلال تشغيل.
ملاحظة: كتل الخلية قد يعوق العمود، وبالتالي يقلل من معدل التدفق. لمنع حدوث هذه المشكلة، ضع مصفاة الخلية البلاستيكية 40 ميكرون على رأس العمود. سوف تمر الخلايا من خلال هذه الشبكة تحسن كبير في كفاءة هذا الأسلوب. - غسل العمود 4 مرات مع 1.5 مل من العازلة الفصل (500 ميكرولتر لمدة 10 7 الخلايا). انتظر الخزان العمود ليكون فارغا (يجب أن يلاحظ أي السائل في العمود) قبل تطبيق الخطوة غسل المقبلة.
ملاحظة: الحصول على الخلايا غير المسماة CD3، تعتبر اللمفاويات B جزء، كما هيمزال في أنبوب جمع. - إزالة عمود من الفاصل والمكان إلى الجديد 15 مل أنبوب جمع. ماصة 2 مل من العازلة الفصل على العمود. باستخدام المكبس إمداده العمود أزل الخلايا الليمفاوية T اختيارها بشكل إيجابي، والتي تعتبر T اللمفاويات الكسر.
- تحديد عدد الخلايا تنقيته (الخطوة 1.15) إذا لزم الأمر. تعليق خلية جاهزة الآن للتجارب المصب.
4. تحليل التدفق الخلوي من سكان المناطق المعزولة لوزي B والخلايا اللمفاوية T
تنبيه: الحل لامتصاص العرق هو مهيج ويشتبه مسرطنة. ارتداء ملابس واقية مناسبة، والقفازات، وحماية العين / الوجه.
ملاحظة 1: يصف هذا البروتوكول طريقة لتلطيخ المباشر للمعزولة B والخلايا T بواسطة الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS) التحليل. والغرض الرئيسي من هذه الخطوة هو تقييم نقاء زنزانة انفرادية السكان AFثالثا CD3 فصل الأجسام المضادة المغناطيسي. لهذا الغرض B ثابتة وعلامات خلية T،-fluorophore مترافق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة CD20-FITC وCD2-APC، وتستخدم. كما ينصح بشدة إدراج الأجسام المضادة isotype السيطرة على التمييز بين "الخلفية" غير محددة ملزمة لCD2 وCD20 الأجسام المضادة (راجع الخطوة 4.8).
ملاحظة 2: من الممكن للحفاظ على الكسور خلية النقاء في امتصاص العرق 1٪ (PFA) حل في الظلام في 4 درجات مئوية حتى وقت تلطيخ (على سبيل المثال، في اليوم التالي). أيضا نفس الإجراء ينطبق إذا كان هناك فجوة زمنية بين تلطيخ وتحليل FACS. تذكر أنه في كلتا الحالتين يجب غسل الخلايا بشكل صحيح مع PBSA (PBS تحتوي على 0.2٪ BSA) العازلة، قبل تلطيخ أو تحليل FACS.
- اخراج 6 × 10 6 خلايا من الشركات المتعددة الجنسيات من الخطوة 1.15 (قبل تطبيق إلى العمود)، B اللمفاوية جزء من الخطوة 3.9 وT اللمفاويات جزء من الخطوة 3.10.
- تدور الخليةتعليق في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ بها.
- إزالة طاف مع الماصة وغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 1 مل من الجليد الباردة PBSA. تدور تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف مع الماصة و resuspend الخلايا في 600 ميكرولتر من الجليد الباردة PBSA العازلة.
- إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أسفل أنبوب FACS.
- إضافة 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10٪ الحرارة المصل البشري المعطل لكل أنبوب، وتخلط جيدا واحتضان ل~ 1 دقيقة في RT أو 20 دقيقة على الجليد.
ملاحظة: الخلايا الليمفاوية B تحمل مستقبلات لكرة القدم. من أجل منع التيسير مستقبلات يتم تحضين الكسور خلية النقاء مع 10٪ الحرارة المصل البشري المعطل. المصل البشري الحرارة المعطل من قبل الحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تقسيم المعطل المصل الحرارة إلى قسامات الصغيرة ومخزن المجمدة في -20 ° C. - الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في جنوب غربالتدريجي جي الدوار.
- إزالة طاف مع الماصة وغسل الخلية بيليه مع 1 مل PBSA. كرر الطرد المركزي (300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية).
- إضافة 100 ميكرولتر PBSA في كل أنبوب على الجليد. إضافة كمية مناسبة من-fluorophore مترافق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، وفقا لتوصية الشركة الصانعة (على سبيل المثال، 20 ميكرولتر من مكافحة CD20 و / أو 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD2 في 100 ميكرولتر من PBSA). ملاحظة: لا تنس أن تعيين أنابيب سيطرة كافية لتحليل FACS. في هذا البروتوكول ينبغي أن تدرج الضوابط التالية: 1) الخلايا ملطخة مكافحة CD2 ومعاداة CD20 الأجسام المضادة بشكل فردي، 2) خلايا ملطخة مكافحة CD2 ومعاداة CD20 isotype السيطرة الأجسام المضادة بشكل فردي، و3) خلايا دون إضافة من الأجسام المضادة.
- لفترة وجيزة دوامة أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل 2 مرات مع PBSA. إضافة 2 مل من 1٪ PFA حل للعينات. دعونا لا تزال الخلايا في حل PFA في 476؛ C في الظلام حتى ذلك الوقت من تحليل FACS.
- مباشرة قبل تشغيل عينات في الجهاز FACS، وغسل الخلايا 2 مرات مع PBSA (300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). عينات resuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني والحفاظ على 4 درجات مئوية (أو على الجليد)، محمية من الضوء، وذلك قبل فصل على قياس التدفق الخلوي.
- هل الفرز FACS بعد بروتوكول من تدفق الكريات الشركة المصنعة.
5. كشف PCR من اتش DNA في عزل وزي B والخلايا اللمفاوية T
ملاحظة 1: اتش الاشعال الجينات hexon هي AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') وAdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. هذه البادئات تخلق amplicon من 139 سنة مضت. ويمكن الكشف عن المضيف 18S الريباسي الجينات مع الاشعال tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') وtp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3). حجم amplicon المتوقع هو 300 سنة مضت.
ملاحظة 2: كل PCRيشمل المدى لمراقبة سلبية (المقطر H 2 O) والتحكم DNA الإيجابية التي تم الحصول عليها من خط الخلية B البشري (BJAB) مصاب نوع اتش البشري 5 12.
- استخراج الحمض النووي (من لا يقل عن 1 × 10 6 خلايا، خطوة 3.11) باستخدام غشاء السيليكا طريقة تنقية عمود أساس. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الفينول وغوانيدين ثيوسيانات حل 13.
- إضافة 100 نانوغرام DNA من B والخلايا اللمفية تي إلى خليط التفاعل التي تحتوي على 1X HF العازلة، 0.2 ملم من مزيج ثلاثي الفوسفات deoxynucleotide (dNTP)، 0.25 ميكرومتر لكل التمهيدي و1 U من عالية الدقة DNA البلمرة في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر.
- أداء PCR التضخيم في ظل الظروف الدراجات التالية: 30 ثانية تمسخ في 98 ° C، تليها 30 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 67 ° C (hexon) أو 58 ° C (18S الريباسي) لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. انتهت تفاعل PCR مع خطوة التمديد النهائي من 7 دقيقة عند 72 ° C.
- فصل الناتجة PCR amplifمنتجات ication على هلام الاغاروز 1.5٪ في 1X TBE العازلة وتصور العصابات التي يتوقعها تلطيخ مع وصمة عار الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في فصل فعال من نتائج الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية فى فئة العالية النقاء من الخلايا الليمفاوية B و T. هذا ما أكده تحليل FACS باستخدام مكافحة CD20 ومكافحة CD2 الأجسام المضادة للكشف B والخلايا اللمفاوية T السكان، على التوالي (الشكل 3A). في المقابل، وفصل غير الفعال للنتائج الشركات المتعددة الجنسيات في الكسور الخلية التي هي مزيج من الخلايا من كل من المجموعات السكانية الفرعية اللمفاويات B و T (الشكل 3B).
المعزول اللوزتين B والخلايا الليمفاوية T (الشكل 3A) هي من نوعية كافية لتحليل المصب مثل عزل الحمض النووي. في البروتوكول الحالي، DNA و RNA المستخرجة من B ويتم استخدام الخلايا الليمفاوية T للكشف عن الحمض النووي RNA واتش الخلوية. وتظهر نتائج الكشف محددة من الحمض النووي اتش في الخلايا الليمفاوية T اللوزية (الشكل 4). RNA معزولة أيضا من اللوزتين B والخلايا الليمفاوية T هو من نوعية وكمية كافية لdownstrea تطبيقات م (الشكل 5).
الشكل 1. نظرة عامة على إجراء اللمفاويات العزلة لوزي. تتم معالجة عينات اللوزة الحنكية وعزلت الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية من الايقاف الخلية التدرج الكثافة الطرد المركزي. ويتم تنقية B والخلايا اللمفية تي في القطعان التي كتبها مجموعة إيجابية من الخلايا اللمفاوية T مع جزء من حقوق الإنسان CD3 الأجسام المضادة المغناطيسي. هذه الخطوة تنقية يجعل من الممكن لمواصلة تقييم الكسور خلية معزولة. على سبيل المثال، لتحديد ما إذا كان يتم إثراء بعض الأنواع الفيروسية ضمن أي من الفئات السكانية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
JPG "/>
الشكل 2. ازالتها جراحيا اللوزتين الحنكي. اللوزتين إزالتها عن طريق استئصال اللوزتين (يسار) وبضع اللوزة (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
النتائج الشكل 3. ممثل FACS من الكسور الخلية المخصبة. (A) إلى الأمام مقابل الجانب مؤامرة مبعثر يظهر B (CD20) وT (CD2) السكان اللمفاويات في الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية، T اللمفاوية والكسور النفايات السائلة. نقاء الخلايا الليمفاوية T و B في أجزاء الخلية المخصبة أكثر من 90٪. منذ خلايا B وتشمل 92٪ من مجموع الخلايا السائلة، يدعى هذا الجزء بمثابة حيوانية B اللمفاوية. (B) المؤامرات FACS تظهر الانفصال غير الكفء للB والخلايا التائية subpopulations، نظرا لعدد غير الأمثل من الشركات المتعددة الجنسيات تطبيقها على عمود وخطوات الغسيل غير كافية. وبصرف النظر عن الحاجة إلى خلية المغناطيسي تنشيط فرز الأمثل، هناك خلفية عالية من CD2 - / CD20 - الخلايا، مما يدل على ان FACS تلطيخ لا أمثل بشكل جيد الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم استخراج الشكل 4. الكشف PCR من DNA اتش في الكسور لمفاوية اللوزية. إجمالي DNA من اللمفاوية البائية والتائية معزولة من اليسار واليمين اللوزتين من خضوعه استئصال اللوزتين المرضى. يتم تنفيذ نقطة النهاية PCR مع 100 نانوغرام من الحمض النووي المنقى. حارة 1: B اللمفاوية جزء (ب) من لوزة اليسرى. 2 لين: T اللمفاويات جزء (T) من LEFر وزة. حارة 3: B اللمفاوية جزء (ب) من لوزة اليمنى. حارة 4: T اللمفاويات جزء (T) لوزة الصحيحة. اتش (الإعلان) DNA هو كشفها فقط في معزولة T اللمفاويات الكسر. أعمال الجينات الخلوية 18S الريباسي باعتبارها الرقابة الداخلية لإظهار يستخدم هذا المبلغ نفسه من الحمض النووي للتفاعل PCR في جميع العينات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فصلت الرقم 5. جودة عالية الحمض النووي الريبي المستخرج من معزولة B و T القطعان الخلية. مجموع RNA حشوية المستخرجة من معزولة B والخلايا الليمفاوية T على هلام الاغاروز 1٪. حارة 1: B اللمفاوية جزء (ب) من لوزة اليسرى. 2 لين: T اللمفاويات جزء (T) لوزة اليسرى. حارة 3: B اللمفاوية جزء (ب) من لوزة اليمنى. حارة 4:T اللمفاويات جزء (T) لوزة الصحيحة. نمط الهجرة من 28S الريباسي، يشار 18S الريباسي وRNA الصغيرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واحدة من أهم العوامل التي تؤثر على نتائج هذا البروتوكول هو استخدام المواد اللوز الطازج كمادة البداية. ولذلك، ينبغي معالجة عينات وزة ضمن 3 ساعات بعد الجراحة. يمكن الحصول على اللوزتين من كل من البالغين والأطفال. المواد اللوزية من الأطفال هي عادة ما تكون أصغر بسبب الاستئصال الجراحي جزئية في اللوزتين (بضع اللوزة). ولذلك، فإن عددا من الشركات المتعددة الجنسيات الحصول عليها من عينات بضع اللوزة (1 × 10 7 -1 × 10 8) هو أقل مقارنة عينات استئصال اللوزتين (1 × 10 8 -2 × 10 9). ومع ذلك، فإن عملية عزل الخلايا تكون هي نفسها بغض النظر عن نوع الجراحة.
تعظيم نقاء القطعان الخلية التي تم الحصول عليها من خلية المغناطيسي تنشيط فرز طريقة يتطلب بعض التحسين. كمية والحضانة الوقت مع CD3 الأجسام المضادة المغناطيسي وعدد من الشركات المتعددة الجنسيات تطبيقها على العمود هي العوامل الرئيسية التي يجب أن تختارimized. وتطبيق العديد من الخلايا يؤدي إلى انسداد العمود والإثراء غير الكفء للالقطعان الخلية. خلال الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول، وجدنا أن تطبيق أكثر من 3 × 10 7 الشركات المتعددة الجنسيات على عمود الفصل سوف يتسبب في انسداد العمود والكسور خلية النجاسة اللاحقة (الشكل 3B). وهكذا، بدءا من 3 × 10 7 الشركات المتعددة الجنسيات يعطي كسور اللمفاويات المخصب بشكل جيد مع نوعية وكمية كافية لاستخلاص DNA و RNA (أرقام 4 و 5). ومن المتوقع أن تكون 1-2 × 10 7 و5-7 × 10 6 على التوالي العدد النهائي للB والخلايا اللمفية تي المعزولة. وبالتالي، استخدام 20 ميكرولتر من CD3 الأجسام المضادة المغناطيسي في 3 × 10 7 الشركات المتعددة الجنسيات ويبدو أن الأمثل لنجاح B والخلايا اللمفاوية T الفصل (الشكل 3A).
أنشأت تقرير سابق أن اللمفاوية البائية والتائية تشمل 60-70٪ و30-40٪ من الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية على التوالي، في حين أن البعضأنواع الخلايا مثل الضامة، الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الجذعية تشكل 1-8٪ من الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية 14. وقد تم تحقيق نسب خلية مماثلة مع بروتوكول عزلتنا كما هو موضح من قبل المناعية للB والخلايا اللمفية تي مع تقنية FACS (الشكل 3A).
عدد خطوات الغسيل وحجم غسل العازلة معلمات حرجة للحصول على نتيجة جيدة. وفقا لذلك، وغسل المفرط يتسبب في CD3 الأجسام المضادة الخلايا T المغناطيسي المرتبطة في نهاية المطاف في التدفق من خلال، في حين أن عدم كفاية غسل سوف يقلل من نقاء الخلية جزء T.
مرة واحدة هي الأمثل الخطوات الحاسمة في البروتوكول لنوع الأنسجة والتحليلات النهائية من المتوقع، وهذه الطريقة بسيطة وفعالة، واضحة وتوفير الوقت. ومع ذلك الحد واحد من هذا الأسلوب هو التكلفة العالية نسبيا من الخلايا فرز الكواشف المغناطيسي المصاحب التجارية، والتي قد تحد من نطاق واسع تنقية اللوزةص B والخلايا اللمفية تي.
باختصار يتيح هذا البروتوكول استراتيجية للحصول على B وT القطعان من اللوزتين الحنكي ويمكن تعديلها لعزل أجزاء الخلية من الأنسجة الأخرى مثل الطحال والغدة الصعترية، والعقد اللمفاوية والدم. نحن أيضا تطبيق هذه الطريقة لإظهار أن نكتشف وجود عدوى اتش تحديدا في جزء الخلية اللوزتين T (الشكل 4). وبالتالي، يجب أن يكون هذا البروتوكول مفيد لمنطقة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك دراسات حول التفاعلات المضيف الممرض، T السمية لخلايا، تنشيط الخلايا T، الخلايا مما يشير الى وباء وT سطح الخلية علامة التعبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175-053 | Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine, 0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix |
| Freezing medium | 90% FBS and 10% DMSO | ||
| MACS buffer | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS containing 0.2% BSA | ||
| PFA | PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles. | ||
| Antibiotic-Antimycotic mix | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecting foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| Straight iris scissors | Fisher Scientific | 12912055 | |
| disposable scalpels | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm plastic cell strainer | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm plastic cell strainers | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml plastic syringe | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62547254 | |
| Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll solution |
| Fetal calf serum | Biological industries | 040071A | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS human CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS separator (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC) | BD Biosciences | 560642 | |
| CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC) | BD Biosciences | 556632 | |
| Human serum | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 software | BD Biosciences | ||
| Nucleospin Blood | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA isolation kit |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596 | RNA isolation reagent |
| Hemocytometer | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | cell counter device |
| GelRed | Biotium | 41003 | Nucleic acid gel stain |
References
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
- Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
- Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
- Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
- Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
- Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
- Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
- Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
- Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
- Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
- Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).
