Protocol
이 프로토콜은 인간의 환자 물질로부터 림프 세포의 분리를 설명하고, 따라서 윤리적 승인을 필요로한다. 본 연구에서 수행 된 작업은 웁살라 윤리 심의위원회 (DNR. 387분의 2,013)에 의해 부여했다.
인간 팔라티노 편도선에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 분리
주의 : 혈액, 조직 또는 체액과 같은 인간 기원의 모든 차폐 재료는 잠재적 감염 물질로 간주되어야한다. 따라서, 인간의 조직을 처리하기위한 권장 바이오 안전성 관행에 따라야한다.
참고 : 오염을 방지하기 위해 모든 솔루션 및 세포 배양 장비는 멸균해야합니다. 모든 버퍼와 솔루션은 사전 냉각 얼음에 보관해야합니다. 편도 조직과 분리 된 세포는 보관하고 얼음에 처리되어야한다.
- 편도 또는 tonsillotomy (그림 2)을받은 환자에서 신선한 편도선을 얻습니다. 조직 clum 플 런지5 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 글루타민, 0.05 밀리그램 / 젠타 마이신 및 1 % 항생제 - 안티 곰팡이 믹스 ㎖ (페니실린 빙냉 멸균 된 행크스 평형 염 용액 (HBSS)으로 가득 50 ㎖ 원심 분리 관에 추신 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B).
- 얼음에 항상 잠겨 편도 조직 샘플 튜브를 유지한다. 가능한 빨리 편도선을 처리하려고없고 나중에 제거 수술 후 3 시간 이상.
- 얼음에 60mm 플라스틱 세포 배양 접시에 편도선을 놓고 HBSS에 적신 조직을 유지. 편도선 표면에서 깨끗한 집게로 볼 혈전, 지방과 결합 조직을 제거합니다.
- 5 ㎖의 HBSS를 함유하는 새로운 60mm 세포 배양 플레이트를 사용한다. 가위 및 / 또는 메스의 멸균 쌍을 사용하여 3~10mm의 조각으로 편도선 조직 덩어리를 잘라.
- HBSS 10 ㎖를 함유하는 새로운 60mm 세포 배양 플레이트를 준비하고, HBSS 용액에 100㎛의 플라스틱 셀 스트레이너를 배치했다.
- DISS 이동멸균 집게와 셀 스트레이너에 반사된다 편도 조각. 플라스틱 주사기의 플런저의 단부를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통하여 상기 조직 절편을 짠다. 편도 조각이 완전히 HBSS에 몰입되어 있는지 확인합니다.
- 티슈 남아있는 셀 스트레이너를 폐기하고 50 ㎖ 플라스틱 원심 분리 튜브에 세포를 60mm 배양 접시에서 얻어진 세포 현탁액을 전송. 단계 1.8 및 1.9를 진행하는 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요.
- 편도선 큰 경우, 크기가보다 큰 2cm (도 2), 스트레이너 메쉬에서의 막힘을 방지하기 위해 두 개의 셀 스트레이너에 편도선 단편을 짠다.
- 세포 현탁액 35 ml를 최종 부피를 얻었다.
주 :이 단계에서 그것은 동결 보존 (섹션 2 참조) 세포 현탁액을 제조 할 수있다. - 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 피콜 같은 밀도 구배 용액 10 ㎖를 추가한다. 조심스럽게 세포 suspens 오버레이이온 밀도 구배 용액의 상단에 (단계 1.9). 세포 현탁액 및 밀도 구배 용액의 혼합을 피한다.
주 : 밀도 구배 용액을 RT로 가온되어야한다. - 실온에서 20 분 동안 700 XG에서 스윙 아웃 로터의 세포 현탁액을 원심 분리기. 그라데이션을 방해 할 수 있습니다 빠른 제동과 원심 분리기에 브레이크 기능을 활성화하지 마십시오. 또한, 원심 분리기에서 사용할 수있는 가장 낮은 가속 기능을 사용합니다.
주 :이 원심 분리 단계 이후에, 상기 튜브의 하단에 퇴적물로서 계면에서 무성 백색 층, 및 적혈구, 섬유 아세포와 같은 세포 파편 다국적 관찰. - 조심스럽게 10 ㎖ 피펫을 사용하여 다국적 층을 수집한다. 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 놓습니다.
- 세포 현탁액에 얼음처럼 차가운 PBS의 25 ML을 추가하고 4 ℃에서 스윙 아웃 회에서 5 분 동안 300 XG에 튜브를 회전.
- 25 ML의 피펫을 이용하여 상층 액을 제거세포 펠렛 세척 단계를 두 번 더 반복한다. 마지막으로 15 ml의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁.
주 : 최종 세척 단계 후에, 세포 현탁액을 (섹션 2 참조) cryopreserve하는 것이 가능하다. - 혈구 세포 계수 챔버에 세포 현탁액 10 μL를 적용하고 현미경으로 세포 수를 계산. 세포의 적절한 양을 분배 (예, 2-3 X 107) 이후의 자성 비드의 분리를 위해 15 ml의 원심 분리 튜브에. 단계 3.2까지 얼음이 나누어 보관하십시오.
편도 세포의 2. 냉동 보존
- 냉동 매체 (90 % FBS 10 % DMSO)를 준비하고 얼음에 보관하십시오. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 냉동 보관 매체.
- 혈구 세포 계수 챔버 (단계 1.15)를 이용하여 세포의 수를 결정한다. 냉동 원하는 세포 밀도에 따른 동결 배지의 요구량을 계산한다 (예를 들어, 107 셀S 동결 배지 / ㎖).
- 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 경사 분리하고 (단계 2.1) 빙냉 동결 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 액체 질소에 장기 저장을 위해 설계 멸균 바이알에 세포 현탁액을 1 ml의 분취 량을 분배. 이소프로판올 실에서 튜브를 동결 및 -80 ° CO / N에 저장합니다. 장기 보존을위한 저장 탱크 또는 -140 ° C 세포를 함유하는 냉동 액체 질소로 튜브를 옮긴다.
- 냉동 세포와 튜브를 해동, 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 그들을 따뜻하게. 해동시 바로, (보충제 단계 1.1) 예열 된 HBSS 10 ㎖에 균체 현탁액을 분산 15ml를 원심 분리 관에. (단계 1.1, 보충제), 5 분 동안 300 XG에 스핀 HBSS 튜브를 제거하고 HBSS에서 원하는 세포 밀도에서 세포 펠렛을 재현 탁.
참고 : 다국적 기업의 AF의 가능성을터 해동은 사균의 존재 정제 된 B 및 T 림프구의 최종 수율이 감소하기 때문에, 중요하다.
주 : 세포 분리 효율을 감소시킬 것이다 세포 생존율이 80 % 이하 후 경험하는 방법.
편도 다국적 기업에서 T 림프구 인구 3. 긍정적 인 선택
주 1 :이 프로토콜은 CD3 항체에 결합 된 자성 비드를 이용하여 편도 다국적로부터 인간 CD3 + T 림프구의 포지티브 선택에 기초한다. 그것은 신선한 (1 절) 또는 냉동 (제 2) 다국적 기업에서이 부분을 시작하는 것이 가능하다.
주 2 : 3 × 10 7 다국적 기업과 함께 시작합니다. 분리 컬럼은 막힐 수 있고, 이는 분리 효율을 줄일 수 있기 때문에,이 세포의 수를 초과하지 않는다. 이상의 셀이 처리 될 경우 더 큰 열을 사용합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 양을 실험적 우리 세포의 수에 대해 최적화 된우리의 실험 설정에서 에드.
- 분리 완충액 [PBS (PH 7.2), 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM EDTA]를 준비한다. 4 ° C에서 0.45 μm의 필터와 저장소를 통해 분리 버퍼를 필터링합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 다국적 기업 서스펜션 (단계 1.14)를 스핀. 빙냉 분리 완충액 240 μL로 얻어진 세포 펠렛 (107 세포 당 80 μL)을 재현 탁. 멸균 2 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 셀 솔루션 CD3 자기 항체의 20 μl를 추가합니다. 서스펜션에 세포를 유지하기 위해 지속적으로 부드러운 혼합하여 4 ℃에서 1 시간 동안 튜브를 품어.
- 세포를 세척하기 위해 5 ㎖ 빙냉 분리 완충액을 함유하는 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 모두 전송할.
- 스윙 아웃 회에서 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 튜브를 원심 분리기.
- 한편 자기 분리기 및 열을 설정합니다. 스탠드에 자기 분리기를 부착하고 separ에 열을 배치ATOR. 빙냉 분리 완충액 500 μL를 적용하여 컬럼을 세척 하였다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오.
- 열 아래에 새 15 ml의 수집 튜브를 놓습니다. 얼음에 포집 관을 유지합니다.
- 피펫으로 상층 액 (단계 3.5)을 폐기하고 부드럽게 500 μL 분리 버퍼에서 세포 펠렛을 재현 탁. 사전 세척 칼럼의 상단에있는 세포 현탁액을 적용하고 그것을 통해 실행하자.
주 : 세포 덩어리가 열을 막히게함으로써 유량을 감소시킬 수있다. 이 문제를 방지하기 위하여, 컬럼의 상단에 40 μm의 플라스틱 셀 스트레이너를 배치했다. 이 메쉬를 통해 셀을 통과하는 고도로이 방법의 효율성을 향상시킬 것이다. - 분리 버퍼의 1.5 ㎖ (10 7 세포 500 μL)으로 열을 4 회 반복한다. 다음 세척 단계를 적용하기 전에 (어떤 액체가 열에서 관찰 될 수 없습니다) 비어있는 열 저장 기다립니다.
주 : B 림프구 분획으로서 간주 CD3 표지 된 세포를 얻는, 그들이 그대로포집 관에 용출. - 새로운 15 ml의 수집 관에 분리 및 장소에서 열을 제거합니다. 피펫 컬럼 상 분리 완충액 2 ㎖. T 림프구의 비율로 간주된다 긍정적 선택된 T 림프구를 용출 컬럼 공급 플런저 사용.
- 정제 세포 (단계 1.15) 필요한 경우의 수를 결정합니다. 세포 현탁액은 지금 하류 실험에 대한 준비가되어 있습니다.
절연 4. 유동 세포 계측법 분석 편도 B와 T 림프구
주의 : 파라 포름 알데히드 용액을 자극 의심되는 발암 물질이다. 적절한 보호 복, 보호 장갑과 눈 / 안면 보호구를 착용 할 것.
주 1 :이 프로토콜은 (FACS) 분석 정리 형광 활성화 된 세포에 의해 격리 된 B 및 T 세포의 염색을위한 직접적인 방법을 설명한다. 이 단계의 주요 목적은 인구 AF를 격리 세포의 순도를 평가하는 것이다터 CD3 자기 항체 분리. 이 목적을 확립 B 및 T 세포 마커에 대해 형광 공역 모노클로 날 항체 및 CD20-FITC CD2-APC가 사용된다. 또한 이소 제어 항체 포함 높게 CD2 및 CD20 항체 (단계 4.8 참조)의 결합 비특이적 "배경"을 구별 할 것을 권장한다.
2 주 : 염색 할 때까지 4 ° C에서 1 % 파라 포름 알데히드에 어둠 속에서 (PFA) 솔루션을 정제 된 세포 분획을 유지할 수있다 (예를 들면, 다음 날.). 염색 및 FACS 분석 간의 시간 간격이있는 경우에도 동일한 방법을 적용한다. 두 경우 모두에서 세포가 PBSA 염색 또는 FACS 분석하기 전에 버퍼 (PBS가 0.2 % BSA를 포함) 제대로 세척해야 함을 기억하십시오.
- 단계 3.10에서 단계 3.9와 T 림프구 분획에서, B 림프구 분율 (이전 컬럼에 적용하기) 단계 1.15에서 다국적 기업의 6 × 10 6 세포를 꺼내.
- 세포를 스핀스윙 아웃 로터를 사용하여 4 ℃에서 5 분 300 XG에 현탁액.
- 피펫으로 상층 액을 제거하고 얼음 - 냉각 PBSA 1 ㎖로 한번 세포 펠렛을 세척 하였다. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 스핀. 피펫으로 상층 액을 제거하고를 재현 탁 얼음처럼 차가운 PBSA 버퍼 600 μL 세포.
- FACS 튜브의 바닥에 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다.
- PBS는 각 튜브에 10 %의 열 불 활성화 된 인간 혈청을 포함하는 100 μl를 추가, 잘 섞어 ~ 실온에서 1 분 또는 얼음에 20 분 동안 품어.
참고 : B 림프구가 된 Fc 수용체를 실시한다. 된 Fc를 차단하기 위해 정제 된 세포 분획을 10 % 열 불 활성화 인간 혈청과 함께 인큐베이션 수용체. 인간 혈청을 1 시간 동안 56 ℃에서 배양함으로써 열 불 활성화이다. -20 ℃에서 냉동 작은 분량 씩 저장에 열 불 활성화 혈청을 나눈다. - 자상 한 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기보내고 아웃 로터.
- 피펫으로 상층 액을 제거하고 1 ml의 PBSA와 세포 펠렛을 씻는다. 원심 분리 (4 ℃에서 5 분 300 XG)를 반복합니다.
- 얼음에 각각의 튜브에 100 μL PBSA를 추가합니다. 제조자의 권고에 따라, 형광 공역 단클론 항체의 적절한 양을 추가 (예컨대, 항 -CD20 20 μL 및 / 또는 PBSA 100 ㎕의 항 - CD2 항체의 5 μL). 참고 : FACS 분석을위한 충분한 제어 튜브를 할당하는 것을 잊지 마십시오. 이 프로토콜에서 다음 컨트롤 포함한다 : 개별적 안티 CD2 및 항 CD20 항체로 염색 1) 세포를 첨가하지 않은 개별 안티 CD2 및 항 CD20 아이소 타입 컨트롤 항체 및, 3) 세포 염색 2) 세포 항체.
- 간단히 튜브 와동과 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
- PBSA와 함께하는 과정을 2 회 반복한다. 샘플 1 % PFA 용액 2 ㎖를 추가합니다. 셀 4에서 PFA 용액에 남아 있도록76; FACS 분석시까지 어두운 C.
- 즉시 외과 기계에서 샘플을 실행하기 전에, (4 ℃에서 5 분 동안 300 XG)를 PBSA와 셀을 2 회 반복한다. 1 ㎖의 PBS와에 재현 탁 샘플은 이전의 흐름 cytometer의 분리, 빛으로부터 보호, 4 ° C (또는 얼음)하시오.
- 제조업체 흐름 cytometer에서 프로토콜 다음 FACS 정렬 작업을 수행합니다.
고립 된 편도 B와 T 림프구에서 아데노 바이러스의 DNA 5. PCR 검출
주 1 : 아데노 hexon 유전자 AdRJC1 프라이머 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ')이고 AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. 이 프라이머는 139 BP의 증폭 물을 생성한다. 호스트 18S rRNA 유전자는 프라이머 tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') 및 tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3')로 검출 할 수있다. 예상 amplicon의 크기는 300 BP이다.
주 2 : 모든 PCR실행은 음성 대조군 (증류수 H 2 O) 및 인간 아데노 바이러스 5 형 (12)에 감염된 인간 B 세포주 (BJAB)로부터 얻어지는 포지티브 컨트롤 DNA를 포함한다.
- 실리카 막 기반 열 정화 방법을 사용하여 (최소 1 × 10 6 세포 단계 3.11에서) DNA를 추출합니다. 페놀 및 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 솔루션 (13)를 사용하여 RNA를 추출합니다.
- 1X HF 완충액, 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트 믹스 0.2 밀리미터 (의 dNTP), 0.25 각 프라이머 μM 및 20 ㎕의 총 부피에서 고성능 DNA 중합 효소 1 U를 함유하는 반응 혼합물 B 및 T 림프구로부터 100ng의 DNA를 추가한다.
- 다음 사이클의 조건에서 PCR 증폭을 수행 10 초, 67 ° C (hexon) 또는 58 ° C (18S rRNA의) 30 초 72 ° C 98 ° C의 30주기 다음 98 ℃에서 30 초 변성, 30 초 동안. PCR 반응은 72 ℃에서 7 분의 최종 신장 단계를 종료 하였다.
- 결과의 PCR 충전 앰프를 분리1X TBE에서 1.5 % 아가 로스 겔상에서 주시죠 제품 버퍼 핵산 염색으로 염색하여 예상 밴드를 시각화.
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Representative Results
B와 T 림프구의 고순도 소집단에서 편도 다국적 결과의 효율적인 분리. 이는 B 및 T 림프구 집단 각각 (도 3a)을 검출하기 위해 항 -CD20 및 항 CD2 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 확인 하였다. 한편, B 및 T 림프구 아 집단 (도 3b) 모두에서 세포의 혼합물이다 세포 분획 다국적 결과 비효율적 분리.
절연 편도의 B 및 T 림프구 (도 3A) 핵산 분리 등 하류 분석을위한 충분한 품질의이다. 현재 프로토콜에서 DNA와 RNA는 B로부터 추출 및 T 림프구 아데노 바이러스 DNA 및 세포 RNA의 검출에 이용된다. 결과는 편도 T 림프구에서 아데노 바이러스 DNA의 특정 검출을 (그림 4)를 보여줍니다. 편도 B와 T 림프구에서 또한 고립 된 RNA를 downstrea 충분한 질과 양입니다 M 응용 프로그램 (그림 5).
도 편도 림프구 분리 절차 1. 개관. 팔라티노 편도선 샘플 처리되고 편도 다국적는 밀도 구배 원심 분리에 의해 세포 현탁액으로부터 분리된다. B와 T 림프구는 인간 CD3 자기 항체와 T 림프구 분획의 긍정적 인 선택에 의해 소집단으로 정제된다. 이 정제 단계는 상기 격리 된 세포 분획을 평가하는 것을 가능하게한다; 일부 바이러스 종 개체군의 내 농축하는 경우 예를 들어, 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2. 수술 구개 편도를 제거했습니다. 편도 (왼쪽)와 tonsillotomy (오른쪽)에 의해 제거 편도선을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
풍부한 세포 분획의 그림 3. 대표 외과 결과. (A) 앞으로 편도 다국적 기업, T 림프구 및 유출 물 분수에서 측면 산점도 보여주는 B (CD20)와 T (CD2) 림프구 인구 대. 농축 된 세포 분획에서 T 및 B 림프구의 순도는 90 % 이상이다. B 세포는 총 유출 세포의 92 %를 포함 할 수 있기 때문에,이 부분은 B 림프구의 하위 집단으로 지정됩니다. (B) FACS 플롯 B 및 T 세포의 비효율적 SUBP 분리를 도시때문에 열 불충분 한 세척 단계에 적용 다국적 기업의 최적화되지 않은 번호로 opulations. / CD20 - -을 제외하고 자기 활성화 된 셀이 최적화를 정렬의 필요성에서, CD2의 높은 배경이있다. 세포, 외과 염색이 잘 최적화되지 않았 음을 보여줍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
편도 림프구 분획에서 아데노 바이러스 DNA의 PCR도 4 검출. 총 DNA는 B로부터 추출되고, T 림프구는 환자 확관 편도선에서 왼쪽과 오른쪽 편도선으로부터 분리. 엔드 포인트 PCR을 정제 된 DNA 100 ng를 수행한다. 레인 1 : 왼쪽 편도선 B 림프구의 분획 (B); 레인 2 : LEF의 T 림프구 분획 (T)T 편도; 레인 3 : 편도선 오른쪽의 B 림프구 분획 (B); 레인 4 : 오른쪽 편도선의 T 림프구의 비율 (T). 아데노 바이러스 (AD) DNA 격리 T 림프구 분획에서만 검출 가능하다. 내부 통제와 같은 셀룰러 18S rRNA 유전자의 역할은 DNA의 같은 양의 모든 샘플에서 PCR 반응에 사용되는 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
절연 B 및 T 세포 아 집단으로부터 추출도 5 고품질 RNA. 절연 B 및 T 림프구로부터 추출한 총 세포질 RNA는 1 % 아가 로스 겔상에서 분리 하였다. 레인 1 : 왼쪽 편도선 B 림프구의 분획 (B); 레인 2 : 좌측 편도선의 T 림프구 분획 (T); 레인 3 : 편도선 오른쪽의 B 림프구 분획 (B); 레인 4 :오른쪽 편도선의 T 림프구의 비율 (T). 28S rRNA의 마이그레이션 패턴, 18S rRNA의 작은 RNA가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 결과에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중의 하나는 출발 물질로서 신선한 편도 물질의 사용이다. 따라서, 편도선 샘플은 수술 후 3 시간 이내에 처리해야한다. 편도선은 어른과 어린이 모두에서 얻을 수있다. 어린이에서 편도 물질로 인해 편도선 (tonsillotomy)의 부분 제거 수술에 일반적으로 작다. 따라서, 다국적의 수가 적은 편도선 샘플 (1 × 10 8 -2 × 109)과 비교된다 tonsillotomy 샘플 (1 × 10 7 × 10 -1 8)로부터 획득. 그러나, 세포 분리 과정없이 수술의 종류와 동일한 것이다.
방법을 정렬 자기 활성화 된 세포에서 얻은 세포 개체군의 순도를 극대화 약간의 최적화가 필요합니다. 자기 CD3 항체 량 및 인큐베이션 시간과 열에 적용 다국적의 수는 선택되어야 주요 요인imized. 너무 많은 셀을 적용하면 열 및 세포 개체군의 비효율적 인 농축의 막힘 발생합니다. 이 프로토콜의 최적화 동안, 우리는 분리 컬럼에 이상 3 × 10 7 다국적 기업을 적용하는 열 이후의 불순한 세포 분수 (그림 3B)의 막힘의 원인이됩니다 것을 발견했다. 따라서, 3 × 10 7 다국적 기업으로 시작하여 DNA와 RNA 추출을위한 충분한 품질과 수량도 풍부한 림프구 분획 제공합니다 (그림 4, 5). 절연 B와 T 림프구의 수는 최종 각각 1-2 X 107 및 5-7 × 106이 될 것으로 예상된다. 따라서, 3 × 10 7 다국적 기업 당 CD3 자기 항체의 20 μL의 사용은 성공적으로 B와 T 림프구 분리 (그림 3A)에 대한 최적의 것으로 보인다.
이전 보고서는 B와 T 림프구가 다른 동안, 각각 60~70% 및 편도 다국적 기업 30 ~ 40 %로 포함하는 것을 설립대 식세포와 같은 종류의 세포, 자연 살해 세포와 수지상 세포는 편도 다국적 기업 (14) 1-8 %를 차지. FACS 기술 (도 3a)와 B와 T 림프구의 면역 염색에 의해 도시 된 바와 같이, 유사한 세포가 우리의 비율 분리 프로토콜에 의해 달성 하였다.
세척 단계의 수와 세척 완충액 용적은 좋은 결과에 대한 중요한 파라미터이다. 따라서, 과잉 세척이 불충분 세척 T 세포 분획의 순도를 감소하는 반면 자기 CD3 항체 관련 T 세포가 관류에서 종료 될 것이다.
프로토콜의 중요한 단계는 조직 유형 및 기대 하류 분석에 대해 최적화되면,이 방법은 간단하고 효율적이고 간단하고 시간이 절약된다. 그러나이 방법의 하나의 제한은 tonsilla 대규모 정제를 제한 할 수있는 상용 자기 - 정렬 연관된 셀 시약의 상대적으로 높은 비용은이며R B와 T 림프구.
요약하면이 프로토콜은 구개 편도선에서 B와 T의 소집단을 얻기위한 전략을 제공하고, 비장, 흉선, 림프절 및 혈액과 같은 다른 조직에서 세포 분획을 분리하도록 수정 될 수 있습니다. 우리는 또한 우리는 편도 T 세포 부분에서 구체적으로 (그림 4) 아데노 바이러스 감염을 감지 것을 보여주기 위해이 방법을 적용 할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 호스트 병원체 상호 작용, T 세포의 세포 독성 T 세포 활성화, 세포 신호와 B 및 T 세포 표면 마커의 발현에 관한 연구를 포함하여 애플리케이션의 광역에 유용해야한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175-053 | Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine, 0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix |
| Freezing medium | 90% FBS and 10% DMSO | ||
| MACS buffer | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS containing 0.2% BSA | ||
| PFA | PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles. | ||
| Antibiotic-Antimycotic mix | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecting foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| Straight iris scissors | Fisher Scientific | 12912055 | |
| disposable scalpels | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm plastic cell strainer | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm plastic cell strainers | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml plastic syringe | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62547254 | |
| Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll solution |
| Fetal calf serum | Biological industries | 040071A | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS human CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS separator (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC) | BD Biosciences | 560642 | |
| CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC) | BD Biosciences | 556632 | |
| Human serum | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 software | BD Biosciences | ||
| Nucleospin Blood | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA isolation kit |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596 | RNA isolation reagent |
| Hemocytometer | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | cell counter device |
| GelRed | Biotium | 41003 | Nucleic acid gel stain |
References
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