구개 편도선은 B와 T 림프구의 풍부한 공급원입니다. 여기에서는 인간 구개 편도선에서 B 림프구와 T 림프구를 분리하기 위한 쉽고 효율적이며 빠른 프로토콜을 제공합니다. 설명된 방법은 편도선염으로 알려진 편도선 염증의 바이러스 병인학 연구에 특별히 적용되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
편도선은 면역 체계의 일부를 형성하여 흡입된 병원체에 대한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 일반적으로 "편도선"이라는 용어는 인두의 구강 부분의 측벽에 위치한 구개 편도선을 나타냅니다. 외과적으로 제거된 구개 편도선은 외부 병원체와 숙주 면역 체계 간의 상호 작용을 연구하기 위해 B 및 T 림프구의 편리한 접근 가능한 공급원을 제공합니다. 이 비디오 프로토콜은 수술로 제거된 인간 구개 편도선의 해부 및 처리에 대해 설명한 다음 동일한 조직 샘플에서 개별 B 및 T 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다. 항체 의존성 친화성 프로토콜(antibody-dependent affinity protocol)을 사용하여 편도선 B 및 T 림프구를 효율적으로 분리하는 방법을 제시합니다. 또한, 우리는 인간 아데노바이러스가 편도선 T 세포 분획을 특이적으로 감염시킨다는 것을 입증하기 위해 이 방법을 사용합니다. 확립된 프로토콜은 일반적으로 편도선 B 및 T 세포 집단을 효율적이고 신속하게 분리하여 편도선 면역 반응에서 다양한 유형의 병원체의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.
서론
편도선은 상부 공기-소화관의 상피 아래에 있고 접촉하는 불완전하게 캡슐화된 림프 조직의 집합체입니다. 일반적으로 "편도선"이라는 용어는 인두의 구강 부분의 측벽에 위치한 구개 편도선을 나타냅니다. 쌍을 이룬 구개 편도선은 비인두 편도선(아데노이드), 쌍을 이룬 난관 편도선 및 설측 편도선과 함께 소위 "발데어 고리"를 구성합니다. 후자는 흡입 또는 섭취 된 병원체와 공기 소화관의 림프 조직 사이의 초기 접촉을 담당합니다1,2. 실제로, 수많은 보고에 따르면 박테리아 항원과 바이러스 항원이 모두 구개 편도선 조직 샘플2-6에서 검출될 수 있습니다.
구개 편도선은 성층화된 편평 비각질화 상피로 덮인 조밀한 림프 조직으로 구성되어 있습니다. 편도선에는 수많은 소낭선(crypt), 상피 침습(epithelial invaginations)이 있으며, 이는 실질(parenchyma)을 관통하여 표면적을 증가시킵니다. 조직학적으로, 구개 편도선에는 B 세포 성숙 및 분화(B 세포 영역)를 위한 장소인 생식 중심이 있는 수많은 림프 여포가 있습니다. 마찬가지로, 구개 편도선은 주로 여포 외 영역(T 세포 영역)에 위치한 T 세포를 포함합니다. B 세포와 T 세포 외에도 다양한 여포 수지상 세포가 구개 편도선에서 검출될....
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프로토콜
이 프로토콜은 인간의 환자 물질로부터 림프 세포의 분리를 설명하고, 따라서 윤리적 승인을 필요로한다. 본 연구에서 수행 된 작업은 웁살라 윤리 심의위원회 (DNR. 387분의 2,013)에 의해 부여했다.
인간 팔라티노 편도선에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 분리
주의 : 혈액, 조직 또는 체액과 같은 인간 기원의 모든 차폐 재료는 잠재적 감염 물질로 간주되어야한다. 따라서, 인간의 조직을 처리하기위한 권장 바이오 안전성 관행에 따라야한다.
참고 : 오염을 방지하기 위해 모든 솔루션 및 세포 배양 장비는 멸균해야합니다. 모든 버퍼와 솔루션은 사전 냉각 얼음에 보관해야합니다. 편도 조직과 분리 된 세포는 보관하고 얼음에 처리되어야한다.
- 편도 또는 tonsillotomy (그림 2)을받은 환자에서 신선한 편도선을 얻습니다. 조직 clum 플 런지5 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 글루타민, 0.05 밀리그램 / 젠타 마이신 및 1 % 항생제 - 안티 곰팡이 믹스 ㎖ (페니실린 빙냉 멸균 된 행크스 평형 염 용액 (HBSS)으로 가득 50 ㎖ 원심 분리 관에 추신 스트렙토 마이신....
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결과
B와 T 림프구의 고순도 소집단에서 편도 다국적 결과의 효율적인 분리. 이는 B 및 T 림프구 집단 각각 (도 3a)을 검출하기 위해 항 -CD20 및 항 CD2 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 확인 하였다. 한편, B 및 T 림프구 아 집단 (도 3b) 모두에서 세포의 혼합물이다 세포 분획 다국적 결과 비효율적 분리.
절연 편도의 B 및 T 림프구 (도 3A) 핵산 분리 등 하류 분석을위한 충분한 품질의이다. 현재 프로토콜에서 DNA와 RNA는 B로부터 추출 및 T 림프구 아데노 바이러스 DNA 및 세포 RNA의 검출에 이용된다. 결과는 편도 T 림프구에서 아데노 바이러스 DNA의 특정 검출을 (그림 4)를 보여줍니다. 편도 B와 T 림프구에서 또한 고립 된 RNA를 downstrea 충분한 질과 양입니다 M 응용 프로그램
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토론
이 프로토콜의 결과에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중의 하나는 출발 물질로서 신선한 편도 물질의 사용이다. 따라서, 편도선 샘플은 수술 후 3 시간 이내에 처리해야한다. 편도선은 어른과 어린이 모두에서 얻을 수있다. 어린이에서 편도 물질로 인해 편도선 (tonsillotomy)의 부분 제거 수술에 일반적으로 작다. 따라서, 다국적의 수가 적은 편도선 샘플 (1 × 10 8 -2 × 109)과 비교된다 tonsillotomy 샘플 (1 × 10 7 × 10 -1 8)로부터 획득. 그러나, 세포 분리 과정없이 수술의 종류와 동일한 것이다.
방법을 정렬 자기 활성화 된 세포에서 얻은 세포 개체군의 순도를 극대화 약간의 최적화가 필요합니다. 자기 CD3 항체 량 및 인큐베이션 시간과 열에 적용 다국적의 수는 선택되어야 주요 요인imized. 너무 많은 셀을 적용하면 열 및 세포 개체군의 비효율적 인 농.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 스웨덴 암 학회(11 0253, 13 0469), 스웨덴 연구 위원회(K2012-99X-21959-01-3), 마르쿠스 보그스트룀스 재단 및 스웨덴 연구 위원회의 지원을 받았으며 웁살라 RNA 연구 센터(2006-5038-36531-16)에 대한 보조금을 받았습니다. 우리는 FACS 분석에 많은 도움을 준 웁살라 대학의 BioVis 핵심 시설에 빚을 지고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 행크스 균형 소금 용액 (HBSS) | Gibco | 14175-053 | 은 5% 소 태아 혈청(FBS), 10mM 글루타민을 함유하고 있습니다. 0.05 mg/ml 겐타마이신 및 1% 항생제-항진균제 혼합물 |
| 냉동 매체 | 90% FBS 및 10% DMSO | ||
| MACS 완충액 | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA 및 2mM EDTA | ||
| PBSA | 0.2% BSA | ||
| PFA | 함유 PBS 1% 파라포름알데히드(PFA) 함유 PBS. 신선하게 만드십시오. PFA는 발암 물질로 의심됩니다. 장갑과 고글을 착용하십시오. | ||
| 항생제-항진균 혼합물 | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| 해부 포 | Fisher Scientific | 1381241 | |
| 직선 홍채 가위 | Fisher Scientific | 12912055 | |
| 일회용 메스 | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μ m 플라스틱 셀 스트레이너 | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μ M 플라스틱 셀 스트레이너 | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml 플라스틱 주사기 | BD Biosciences | ||
| 15 ml 원뿔형 원심분리기 튜브 | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml 원추형 원심분리기 | 튜브 SARSTEDT | 62547254 | |
| 저속 원심분리기 고정각도 또는 스윙잉 버킷 로터 | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll– Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll 용액 |
| 태아 송아지 혈청 | 생물학 산업 | 040071A | |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS human CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS 분리기 (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 알로피코시아닌에 접합 ( CD2-APC) | BD 바이오사이언스 | ||
| 560642 CD20은 플루오레세인 이소티오시아네이트(CD20-FITC)와 결합 | BD 바이오사이언스 | ||
| 휴먼 세럼 | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS 튜브 | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII 유량계 | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 소프트웨어 | BD Biosciences | ||
| 뉴클레오스핀 블러드 | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA 분리 키트 |
| TRIzol 시약 | Life technologies | 15596 | RNA 분리 시약 |
| 혈구계 | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | cell counter device |
| GelRed | Biotium | 41003 | 핵산 겔 염색 |
참고문헌
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J.
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