Protocol
Protokollet beskriver isolering av lymfoidceller från human patient material och kräver därför en etiskt godkännande. Det arbete som utförs i den aktuella studien beviljades av Uppsala etikprövningsnämnden (Dnr. 2013/387).
1. Isolering av mononukleära celler (MNC) från human Palatine Tonsiller
VARNING: All oskärmad material av humant ursprung som blod, vävnader eller kroppsvätskor bör betraktas som potentiellt infekterat material. Därför bör rekommenderade biosäkerhet rutiner för hanteringen av de mänskliga vävnader följas.
Obs! För att undvika kontaminering, måste alla lösningar och cellodlingsutrustning vara steril. Alla buffertar och lösningar bör förkyld och hålls på is. Tonsill vävnader och isolerade celler ska förvaras och hanteras på is.
- Skaffa nya tonsiller från patienter som genomgår tonsillektomi eller tonsillotomi (Figur 2). Störta vävnads Clumps i en 50 ml centrifugrör fyllda med iskall steril Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av 5% fetalt bovint serum (FBS), 10 mM glutamin, 0,05 mg / ml gentamicin och 1% antibiotikum-Antimykotisk blandning (penicillin, streptomycin och amfotericin B).
- Förvara rören med nedsänkta tonsill vävnadsprover vid alla tider på is. Försök att behandla tonsillerna så snart som möjligt, dock senast tre timmar efter kirurgiskt avlägsnande.
- Placera tonsill på en 60 mm plastcellodlingsplatta på is och hålla vävnaden fuktad med HBSS. Avlägsna synliga blodproppar, fet och bindväv med en ren pincett från tonsill ytan.
- Använd en ny 60 mm cellodlingsplatta innehållande 5 ml HBSS. Skär tonsill vävnaden klump i 3-10 mm fragment med användning av en steril sax och / eller en skalpell.
- Förbered en ny 60 mm cellodlingsplatta innehållande 10 ml HBSS och placera en 100 pm plast cell sil i HBSS lösningen.
- Överför dissected tonsill fragment in i cell sil med en steril pincett. Använda kolvänden av en plastspruta, smidigt pressa vävnadsfragment genom cell sil. Se till att tonsill fragmenten är helt nedsänkt i HBSS.
- Kassera cellfilter med vävnads resterna och överför den resulterande cellsuspensionen från 60 mm cellodlingsplatta i en 50 ml centrifugrör av plast. Låt röret på is medan du fortsätter med steg 1,8 och 1,9.
- När det gäller stora tonsiller, större än 2 cm i storlek (Figur 2), pressa tonsill fragment i två cell silar för att undvika igensättning av nätet i silen.
- Erhållande av den slutliga volymen av 35 ml av cellsuspensionen.
Obs: I detta steg är det möjligt att framställa cellsuspensionen för frysförvaring (se avsnitt 2). - Tillsätt 10 ml densitetsgradient lösning såsom Ficoll i en ny 50 ml centrifugrör. Overlay försiktigt cell suspensjon (steg 1,9) ovanpå densitetsgradientlösningen. Undvika blandning av cellsuspensionen och densitetsgradientlösningen.
Anmärkning: densitetsgradientlösning måste värmas upp till RT. - Centrifugera cellsuspensionen i en swing-out-rotor vid 700 xg under 20 min vid RT. Aktivera inte bromsfunktionen på centrifugen så fort bromsning kan störa gradienten. Dessutom använder den lägsta accelerations funktion som är tillgänglig på centrifugen.
Anmärkning: Efter detta centrifugeringssteg, observerar MNC som ett fluffigt vitt skikt vid gränsytan, och röda blodkroppar (RBC), fibroblaster och cellrester som sediment på botten av röret. - Försiktigt samla multinationella lagret med hjälp av en 10 ml pipett. Placera cellsuspensionen i en ny 50 ml centrifugrör.
- Tillsätt 25 ml iskall PBS till cellsuspensionen och centrifugera röret vid 300 xg under 5 min i en swing-out-rotor vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten med hjälp av en 25 ml pipettoch upprepa cellpelleten tvättsteg två gånger till. Slutligen resuspendera cellpelleten i 15 ml PBS.
Anmärkning: Efter den sista tvättsteget, är det möjligt att cryopreserve cellsuspensionen (se avsnitt 2). - Applicera 10 | il av cellsuspension i hemocytometer cell räknekammare och räkna antalet celler i mikroskop. Dispensera lämplig mängd celler (t.ex., 2-3 x 10 7) i en 15 ml centrifugrör för efterföljande magnetisk pärla separation. Hålla denna alikvot på is tills steg 3.2.
2. Frysförvaring av tonsillpåverkan Celler
- Förbered frysmedium (90% FBS och 10% DMSO) och hålla den på is. För långtidsförvaring hålla frysning media vid -20 ° C.
- Fastställa det totala antalet celler med användning av en hemocytometer cellräkningskammare (steg 1,15). Beräkna den erforderliga mängden frysmediet enligt den önskade frusen celltäthet (t.ex., 10 7-cells / ml frysmedium).
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 xg under 5 minuter. Dekantera supernatanten utan att störa cellpelleten och resuspendera cellpelleten i iskallt frysning medium (från steg 2,1).
- Dispensera 1 ml alikvoter av cellsuspensionen i sterila ampuller avsedda för långtidsförvaring i flytande kväve. Frysa flaskorna i en isopropanol kammare och förvara dem vid -80 ° CO / N. För långsiktigt bevarande överföra flaskorna i en flytande kväve som innehåller lagringstank eller -140 ° C cell frys.
- Tina injektionsflaskor med frusna celler, värma dem snabbt i ett 37 ° C vattenbad. Omedelbart när tinas, skingra cellsuspensionen i 10 ml förvärmd HBSS (med tillägg, steg 1,1) i en 15 ml centrifugrör. Spin röret vid 300 xg under 5 minuter, avlägsna HBSS och resuspendera cellpelleten vid den önskade celltätheten i HBSS (med tillägg, steg 1,1).
Obs! Livskraft multinationella after upptining är av betydelse, eftersom närvaron av döda celler kommer att minska det slutliga utbytet av renad B- och T-lymfocyter.
Obs: Enligt vår erfarenhet cellviabiliteten mindre än 80% kommer att minska cellisolering effektivitet.
3. Positiva Val av T lymfocytpopulation från tonsillpåverkan MNCs
Anmärkning 1: Detta protokoll är baserad på positiv selektion av humana CD3 + T-lymfocyter från tonsill multinationella företag som använder magnetiska kulor kopplade till CD3-antikroppen. Det är möjligt att starta detta avsnitt från färska (1 §) eller frysta (Avsnitt 2) multinationella företag.
Not 2: Börja med 3 x 10 7 multinationella företag. Inte överskrider denna cellnummer, eftersom separationskolonner kan täppa och detta kommer att minska isoleringen effektiviteten. Använd större kolumner om fler celler kommer att hanteras. De mängder som används i detta protokoll har experimentellt optimerad för antalet celler ossed i vår experimentuppställning.
- Förbered separationsbuffert [PBS (pH 7,2), 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA]. Filtrera buffert separation genom ett 0,45 um filter och förvara vid 4 ° C.
- Snurra MNC suspensionen (steg 1,14) vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Resuspendera den erhållna cellpelleten i 240 | il (80 | il per 10 7 celler) iskall separationsbuffert. Överför cellsuspensionen i ett sterilt 2 ml rör.
- Tillsätt 20 pl av CD3 magnetiska antikropp mot cellösningen. Inkubera rören i en timme vid 4 ° C med kontinuerlig varsam blandning för att hålla cellerna i suspension.
- Överföra alla av cellsuspensionen i ett 15 ml rör innehållande 5 ml iskall separationsbuffert för att tvätta cellerna.
- Centrifugera röret vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C i en swing-out-rotor.
- Samtidigt inrättades den magnetiska separatorn och kolumn. Fäst den magnetiska separatorn till stativet och placera kolonnen i separtören. Tvätta kolonnen genom att applicera 500 | il iskall separationsbuffert. Kasta flödet genom.
- Placera en ny 15 ml uppsamlingsrör nedanför kolonnen. Håll provröret på is.
- Kassera supernatanten (steg 3,5) med pipett och försiktigt resuspendera cellpelleten i 500 l separation buffert. Applicera cellsuspensionen på toppen av förtvättad kolonnen och låt den rinna igenom.
Obs: cellklumpar kan täppa till kolonnen och sålunda reducera flödeshastigheten. För att förhindra detta problem, placera en 40 pm plast cell sil på toppen av kolonnen. Passerar cellerna genom denna mask kommer mycket att effektivisera denna metod. - Tvätta kolonnen 4 gånger med 1,5 ml separationsbuffert (500 | il i 10 7-celler). Vänta kolumnen behållaren vara tom (ingen vätska bör observeras i kolumnen) innan nästa tvättsteg.
Obs: Skaffa CD3 omärkta celler, betraktas som B lymfocytfraktionen, eftersom de ärelueras in i provröret. - Avlägsna kolonnen från separatorn och placera in i ett nytt 15 ml uppsamlingsrör. Pipettera 2 ml separationsbuffert på kolonnen. Använda kolven medföljer kolonnen eluera positivt selekterade T-lymfocyter, som betraktas som den T-lymfocyt-fraktionen.
- Bestäm antalet renade celler (steg 1.15) om det behövs. Cellsuspensioner är nu redo för experiment nedströms.
4. Flödescytometrisk analys av isolerade Tonsillar B och T-lymfocyter
VARNING: Paraformaldehyd lösning är irriterande och misstänkt cancerframkallande. Använd lämpliga skyddskläder, handskar och ögon / ansiktsskydd.
Not 1: Detta protokoll beskriver förfarandet för direkt färgning av isolerade B- och T-celler genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) -analys. Huvudsyftet med detta steg är att bedöma renheten av den isolerade cellpopulationer after CD3 magnetiska antikroppsseparation. För detta ändamål inrättas B- och T-cellmarkörer, fluorofor-konjugerade monoklonala antikropparna CD20-FITC och CD2-APC, används. Också införandet av isotyp kontrollantikroppar rekommenderas att skilja den icke-specifika "bakgrunden" bindning av CD2 och CD20-antikroppar (se steg 4,8).
Not 2: Det är möjligt att hålla de renade cellfraktionerna i en 1% paraformaldehyd (PFA) lösning i mörker vid 4 ° C tills tiden för färgning (t.ex., nästa dag.). Också samma förfarande tillämpas om det finns ett tidsglapp mellan färgning och FACS-analys. Kom ihåg att i båda fallen celler bör tvättas ordentligt med PBSA (PBS innehållande 0,2% BSA) buffert före färgning eller FACS-analys.
- Ta ut 6 x 10 6 celler av MNC från steg 1,15 (före applicering på kolonnen), B-lymfocyt-fraktionen från steg 3,9 och T lymfocyt fraktionen från steg 3,10.
- Snurra cellensuspensioner vid 300 xg under 5 minuter vid 4 ° C med hjälp av en swing-out rotor.
- Avlägsna supernatanten med pipett och tvätta cellpelleten en gång med 1 ml iskall PBSA. Snurra cellsuspensioner vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten med pipett och suspendera celler i 600 | il iskall PBSA buffert.
- Tillsätt 100 | il av cellsuspensionen till botten av ett FACS-rör.
- Tillsätt 100 ni PBS innehållande 10% värmeinaktiverat humant serum till varje rör, blanda väl och inkubera i ~ 1 min vid RT eller 20 min på is.
Obs: B-lymfocyter bär Fc-receptorer. För att blockera Fc-receptorerna de renade cellfraktioner inkuberas med 10% värmeinaktiverat humant serum. Den humana serumet värmeinaktiverades genom inkubation vid 56 ° C under 1 timme. Dela upp värmeinaktiverat serum i små portioner och lagra frysta vid -20 ° C. - Centrifugera cellsuspensionen vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C i en SWing-out-rotor.
- Avlägsna supernatanten med pipett och tvätta cellpelleten med 1 ml PBSA. Upprepa centrifuger (300 x g under 5 minuter vid 4 ° C).
- Tillsätt 100 pl PBSA i varje rör på is. Tillsätt en lämplig mängd fluorofor-konjugerad monoklonal antikropp, enligt tillverkarens rekommendation (t.ex. 20 il anti-CD20 och / eller 5 il anti-CD2-antikroppar i 100 pl PBSA). Obs: Glöm inte att tilldela tillräckligt styrrören för FACS-analys. I detta protokoll följande kontroller bör ingå: 1) celler färgade med anti-CD2 och anti-CD20-antikroppar individuellt, 2) celler färgade med anti-CD2 och anti-CD20 isotypisk kontroll antikroppar individuellt och, 3) celler utan tillsats av antikroppar.
- Vortexa kort på röret och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta 2 gånger med PBSA. Tillsätt 2 ml av en% PFA-lösning till proverna. Låt cellerna förblir i PFA-lösning vid 476, C i mörker tills tiden för FACS-analys.
- Omedelbart före kör samplen i FACS-maskin, tvätta cellerna 2 gånger med PBSA (300 xg under 5 min vid 4 ° C). Resuspendera prover i 1 ml PBS och hålla vid 4 ° C (eller på is), skyddad mot ljus, före separation på flödescytometern.
- Gör FACS sortering efter protokollet från flödescytometern tillverkaren.
5. PCR-Detektion av adenovirus-DNA i isolerad Tonsillar B- och T-lymfocyter
Anmärkning 1: adenovirus hexon genen primers är AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') och AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Dessa primrar generera en amplikon av 139 bp. Värden 18S rRNA-genen kan detekteras med primrar tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') och tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). Den förväntade produkten storleken 300 bp.
Not 2: Varje PCRkörningen innefattar en negativ kontroll (destillerat H2O) och en positiv DNA-kontroll erhållet från human B-cellinje (BJAB) infekterade med humant adenovirus typ 5 12.
- Extrahera DNA (från åtminstone 1 x 10 6 celler, steg 3,11) med användning av silika-membranbaserad kolonn reningsmetod. Extrahera RNA med användning av fenol och guanidinisotiocyanat lösning 13.
- Lägg 100 ng DNA från B- och T-lymfocyter till en reaktionsblandning innehållande 1 x HF-buffert, 0,2 mM deoxinukleotidtrifosfat blandning (dNTP), 0,25 ^ M av varje primer och 1 U av hifi-DNA-polymeras i en total volym av 20 | il.
- Utför PCR-amplifiering under följande cykelbetingelser: 30 sek denaturering vid 98 ° C, följt av 30 cykler av 98 ° C under 10 sek, 67 ° C (hexon) eller 58 ° C (18S-rRNA) för 30 sekunder och 72 ° C för 30 sek. PCR-reaktionen avslutades med en slutlig förlängningssteg av 7 min vid 72 ° C.
- Separera den resulterande PCR-amplifblue produkter på en 1,5% agarosgel i 1 x TBE-buffert och visualisera de förväntade banden genom färgning med nukleinsyra fläcken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En effektiv separation av tonsill MNC resulterar i höggradigt renade subpopulationer av B och T-lymfocyter. Detta bekräftades genom FACS-analys med användning av anti-CD20 och anti-CD2-antikroppar för att detektera B och T lymfocyt-populationer, respektive (figur 3A). I motsats därtill en ineffektiv separation av MNC resulterar i cellfraktioner som är en blandning av celler från både B- och T-lymfocyt-subpopulationer (figur 3B).
Den isolerade tonsillar B- och T-lymfocyter (Figur 3A) är av tillräcklig kvalitet för efterföljande analyser som nukleinsyraisolering. I det nuvarande protokollet, DNA och RNA extraheras från B- och T-lymfocyter användes för detektion av adenovirus-DNA och cellulärt RNA. Resultaten visar specifik detektering av adenovirus-DNA i tonsill T-lymfocyter (figur 4). Isolerades också RNA från tonsillerna B- och T-lymfocyter är av tillräcklig kvalitet och kvantitet för downstrea m applikationer (Figur 5).
Figur 1. Översikt över tonsillar lymfocytisolering förfarande. Palatine tonsill Samplen behandlas och tonsill-MNC isoleras från cellsuspensionen genom densitetsgradientcentrifugering. B- och T-lymfocyter renas i underpopulationer av en positiv selektion av T-lymfocyten fraktionen med human CD3-magnetiska antikropp. Detta reningssteg gör det möjligt att ytterligare bedöma isolerade fraktionerna cell; till exempel, för att avgöra om några virusart berikas inom något av subpopulationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
jpg "/>
Figur 2. avlägsnas kirurgiskt Palatine tonsiller. Tonsiller avlägsnas genom tonsillektomi (vänster) och tonsillotomi (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representant FACS resultat av fraktionerna anrikade cell. (A) framåt vs sidospridning diagram som visar B (CD20) och T (CD2) lymfocytpopulationer i tonsill multinationella företag, T-lymfocyter och avloppsfraktioner. Renheten hos T- och B-lymfocyter i anrikade cellfraktioner är mer än 90%. Eftersom B-celler innefattar 92% av det totala utflödet celler, är denna fraktion namnges som B-lymfocytdelpopulationen. (B) FACS tomter visar ineffektiv separation av B- och T-cell subpopulations, på grund av icke-optimerade antal multinationella företag som appliceras på kolonnen och otillräckliga tvättsteg. Bortsett från behovet av magnetiskt aktiverad cellsortering optimering, det finns en hög bakgrund av CD2 - / CD20 -. Celler, vilket visar att FACS färgning inte är väl optimerade Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. PCR-detektion av adenovirus-DNA i tonsill lymfocyt fraktioner. Totalt DNA extraheras från B och T-lymfocyter isoleras från den vänstra och högra tonsiller från en patient som genomgår tonsillektomi. Slutpunkt PCR utförs med 100 ng av det renade DNA: t. Bana 1: B-lymfocyt fraktion (B) i vänster tonsill; bana 2: T-lymfocyt fraktion (T) hos LEFt tonsill; bana 3: B lymfocytfraktionen (B) i den högra tonsill; bana 4: T lymfocytfraktionen (T) av rätten tonsill. Adenovirus (Ad) DNA kan endast detekteras i isolerad T-lymfocyt-fraktion. Cellular 18S rRNA genen fungerar som en intern kontroll för att visa att samma mängd DNA används för PCR-reaktionen i alla prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Hög kvalitet RNA extraherat från isolerade B- och T-cell-subpopulationer. Totalt cytoplasmiskt RNA extraherat från den isolerade B- och T-lymfocyter separerades på en 1% agarosgel. Bana 1: B-lymfocyt fraktion (B) i vänster tonsill; bana 2: T-lymfocyt fraktion (T) hos vänster tonsill; bana 3: B lymfocytfraktionen (B) i den högra tonsill; bana 4:T lymfocytfraktionen (T) av rätten tonsill. Migration mönster av 28S rRNA, 18S rRNA och små RNA indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de viktigaste faktorerna som påverkar resultatet av detta protokoll är användningen av färsk tonsillar material som utgångsmaterial. Därför bör de tonsill proverna bearbetas inom 3 h efter kirurgi. Tonsiller kan erhållas från både vuxna och barn. Det tonsillar material från barnen är oftast mindre på grund av den partiella kirurgiskt avlägsnande av tonsiller (tonsillotomi). Därför är antalet av MNC erhölls från tonsillotomi prover (1 x 10 7 -1 x 10 8) är mindre jämfört med tonsillektomi prover (1 x 10 8 -2 x 10 9). Emellertid skulle cellisoleringsprocessen vara densamma oavsett vilken typ av operation.
Maximera renheten hos cellsubpopulationer erhållna från magnetisk aktiverad cellsorteringsmetod kräver viss optimering. Mängden och inkubationstiden med CD3 magnetiska antikropp och antalet multinationella företag som appliceras på kolonnen är de viktigaste faktorer som bör väljerimized. Tillämpa för många celler kommer att resultera i igensättning av kolonnen och ineffektiva anrikning av cellsubpopulationer. Under optimering av detta protokoll, fann vi att tillämpa mer än 3 x 10 7 multinationella företag på separationskolonnen kommer att orsaka en igensättning av kolonnen och efterföljande orena cellfraktioner (Figur 3B). Sålunda, utgående från 3 x 10 7 MNC ger väl anrikade lymfocyt fraktioner med tillräcklig kvalitet och kvantitet för DNA och RNA-extraktion (fig 4 och 5). Det slutliga antalet isolerade B- och T-lymfocyter förväntas vara 1-2 x 10 7 och 5-7 x 10 6, respektive. Således verkar användningen av 20 pl CD3 magnetiska antikropp per 3 x 10 7 MNC vara optimala för framgångsrik B och T lymfocyt separation (figur 3A).
En tidigare rapport har fastställt att B och T-lymfocyter omfattar 60-70% och 30-40% av de tonsill MNC respektive, medan andracelltyper som makrofager, naturliga mördarceller och dendritiska celler utgör 1-8% av de tonsill MNC 14. Liknande cell proportioner uppnåddes med vår isolering protokoll som visas genom immunfärgning av B- och T-lymfocyter med FACS-tekniken (figur 3A).
Antalet tvättsteg och tvättbuffertvolym är kritiska parametrar för ett bra resultat. Följaktligen kommer överdriven tvättning bringa CD3 magnetiska antikropps associerade T-celler att hamna i genomflödet, medan otillräcklig tvättning kommer att minska renheten hos cellfraktionen T.
När de kritiska stegen i protokollet är optimerade för vävnadstyp och de förväntade nedströms analyser, är denna metod enkel, effektiv, okomplicerad och tidsbesparande. Emellertid en begränsning med denna metod är en relativt hög kostnad för kommersiella magnetiska associerade cellsorteringsreagens, som kan begränsa storskalig rening av tonsillaRb och T-lymfocyter.
Sammanfattningsvis detta protokoll ger en strategi för att få B- och T-subpopulationer från Palatine tonsiller och kan modifieras för att isolera cellfraktioner från andra vävnader som mjälte, bräss, lymfkörtlar och blod. Vi tillämpar vidare denna metod för att visa att vi upptäcker en adenovirusinfektion särskilt i tonsillar T-cellfraktionen (Figur 4). Därför bör detta protokoll vara användbar för ett brett område av applikationer, inklusive studier om värd-patogen interaktioner, T-cell cytotoxicitet, T-cellsaktivering, cellsignalering och B och T-cellytan markör uttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175-053 | Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine, 0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix |
| Freezing medium | 90% FBS and 10% DMSO | ||
| MACS buffer | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS containing 0.2% BSA | ||
| PFA | PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles. | ||
| Antibiotic-Antimycotic mix | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecting foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| Straight iris scissors | Fisher Scientific | 12912055 | |
| disposable scalpels | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm plastic cell strainer | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm plastic cell strainers | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml plastic syringe | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62547254 | |
| Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll solution |
| Fetal calf serum | Biological industries | 040071A | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS human CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS separator (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC) | BD Biosciences | 560642 | |
| CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC) | BD Biosciences | 556632 | |
| Human serum | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 software | BD Biosciences | ||
| Nucleospin Blood | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA isolation kit |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596 | RNA isolation reagent |
| Hemocytometer | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | cell counter device |
| GelRed | Biotium | 41003 | Nucleic acid gel stain |
References
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
- Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
- Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
- Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
- Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
- Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
- Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
- Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
- Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
- Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
- Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).
