Protocol
该协议描述了从人类患者材料淋巴细胞的分离，因此，需要一个伦理批准。在本研究中所做的工作给予的乌普萨拉伦理审查委员会（DNR。三百八十七分之二千〇一十三）。
1.分离单个核人力腭扁桃体细胞（MNCs）的
警告：人类起源如血液，组织或体液的所有非屏蔽材料应被视为可能受感染的材料。因此，处理的人体组织推荐的生物安全的做法应该得到遵守。
注意：为了避免污染，所有的解决方案和细胞培养设备必须是无菌的。所有缓冲液和溶液应预先冷却并保持在冰上。扁桃体组织分离出的细胞应保持在冰上处理。
- 获得从接受扁桃体切除术或扁桃体部分切除术（图2）的患者新鲜扁桃体。急跌组织clum的ps到装有冰冷无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）在50毫升离心管中补充有5％胎牛血清（FBS），10mM的谷氨酰胺，0.05毫克/毫升庆大霉素和1％抗菌 - 抗霉菌混合物（青霉素，链霉素和两性霉素B）。
- 保持与淹没扁桃体组织样品管在任何时候都在冰上。尝试尽快处理的扁桃体，并最迟手术切除后3小时。
- 广场上冰60毫米的塑料细胞培养板的扁桃体和保持蘸有HBSS组织。删除可见血栓，脂肪和结缔组织从扁桃体表面干净的镊子。
- 使用含有5ml HBSS中一个新的60毫米细胞培养板。切割扁桃体组织丛成使用无菌剪刀和/或手术刀的3-10毫米的碎片。
- 制备装有10ml HBSS的新60毫米的细胞培养板，并放置一个100μm的塑料的细胞过滤的HBSS溶液。
- 转移迪斯ected扁桃体碎片进入细胞过滤用无菌镊子。使用塑料注射器的柱塞端，顺利地通过细胞过滤器挤压组织碎片。确保扁桃体片段完全沉浸在HBSS中。
- 丢弃细胞过滤与组织遗体和从60毫米细胞培养板转移得到的细胞悬液至50ml塑料离心管中。留在冰上的管继续进行步骤1.8和1.9，而。
- 在大扁桃体的情况下，大于2厘米大小（图2），挤压扁桃体片段在两个细胞滤网，以避免在过滤器网眼堵塞。
- 获得35毫升细胞悬浮液的最终体积。
注意 ：在这一步，可以制备细胞悬浮液为低温保存（参见部分2）。 - 加入10毫升如Ficoll密度梯度溶液例如到一个新的50ml离心管中。轻轻地覆盖在细胞suspens离子上的密度梯度溶液的顶部（步骤1.9）。避免了细胞悬浮液和密度梯度溶液的混合。
注意 ：密度梯度溶液必须被升温至室温。 - 离心细胞悬浮液在水平转子在700×g离心20分钟，在室温。不要激活离心机快制动可能会破坏梯度的制动功能。此外，使用可在离心机的最低加速功能。
注意 ：在此之后的离心步骤，观察跨国公司，为蓬松的白色层在界面处，和红血细胞（红细胞），成纤维细胞和细胞碎片的沉淀物在管的底部。 - 小心地用10毫升移液管收集跨国公司层。将细胞悬浮液到一个新的50ml离心管中。
- 加25毫升冰冷PBS，以细胞悬浮液和旋管中，在300×g离心5分钟以水平转子在4℃下。
- 用25毫升移液管除去上清液并重复细胞沉淀洗涤步骤两次以上。最后重悬细胞沉淀在15ml PBS中。
注意 ：最后的洗涤步骤之后，就可以冷冻保存的细胞悬浮液（参见2）。 - 申请10微升细胞悬液到血球细胞计数室和计数在显微镜下的细胞数。分配细胞的适量（例如，2-3×10 7个）的15ml离心管中用于随后磁珠分离。保持这个等分在冰上，直到步骤3.2。
2.冷冻扁桃体细胞
- 制备冷冻介质（90％FBS和10％DMSO）中，并保持它在冰上。对于长期储存保持冷冻介质在-20℃。
- 确定使用血球细胞计数室（步骤1.15）细胞的总数。根据所需的冷冻的细胞密度计算所需冷冻介质的量（例如，10 7细胞个冰冻培养基/毫升）。
- 离心细胞悬浮液在300×g离心5分钟。滗析出上清液，而不干扰细胞沉淀重悬在冰冷的冷冻介质（来自步骤2.1）将细胞沉淀。
- 分配1ml等分细胞悬浮液成设计用于长期储存在液氮中无菌小瓶。冻结小瓶中的异丙醇室，并将其存储在-80°CO / N。对于长期保存的小瓶转移到含有贮槽或-140℃的细胞冷冻液氮。
- 解冻小瓶冷冻细胞，迅速温暖他们在37℃水浴。解冻时立即，分散细胞悬浮到10ml预温热的HBSS（用补充剂，步骤1.1）在15ml离心管中。旋管中于300×g离心5分钟，除去HBSS和重悬细胞沉淀在于HBSS所需的细胞密度（与补充剂，步骤1.1）。
注：跨国公司房颤的可行性之三解冻是很重要的，因为死细胞的存在将降低纯化的B和T淋巴细胞的最终产率。
注意 ：根据我们的经验细胞存活率小于80％会降低细胞分离效率。
3.积极选择T淋巴细胞人口从扁桃体跨国公司
注 1：该协议是基于正选择从使用耦合到CD3抗体磁珠扁桃体跨国公司人CD3 + T淋巴细胞的。有可能从新鲜（第1）或冷冻（第2节）跨国公司开始本节。
注2：开始用3×10 7跨国公司。不要超过这个手机号码，因为分离柱可能阻塞，这将降低隔离效率。使用大柱，如果更多的细胞将被处理。在这个协议中使用的量已经为我们的细胞的数量被实验优化海关在我们的实验装置。
- 制备分离缓冲液[PBS（pH为7.2），0.5％牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA〕。通过0.45微米的过滤器，并储存在4℃下过滤分离缓冲液。
- 旋转跨国公司悬架（步骤1.14），在300 XG 5分钟，在4℃。重悬的冰冷分离液在240微升所得细胞沉淀（每10 7个细胞80微升）。细胞悬液转移到无菌的2毫升管。
- 加入20微升的CD3磁性抗体与细胞溶液。孵育管1小时，在4℃下用连续轻柔混合，以保持细胞在悬浮液中。
- 传输所有的细胞悬液入15ml试管含有5ml冰冷分离缓冲液洗涤细胞。
- 离心管中，在300×g离心10分钟，在4℃下，在水平转子。
- 同时成立了磁选柱。附加磁性分离到支架和放置列在组合通道员。通过应用500微升冰冷的分离缓冲液洗柱。丢弃通过流。
- 放置柱下方的新款15 ml收集管。保持在冰上收集管。
- 用移液管弃去上清液（步骤3.5）和轻轻悬浮于500μl分离缓冲液的细胞沉淀。应用细胞悬液的预洗塔的顶部，并让它运行通过。
注：细胞团块会堵塞柱，从而降低流速。为了防止出现这种问题，将在塔的顶部的40微米的塑料细胞过滤。通过这个网格传递细胞将大大提高了该方法的效率。 - 用1.5ml的分离缓冲液（500微升，10 7个细胞 ）洗涤塔4倍。等待列储到是空的（没有液体应在塔中观察到的）施加下一洗涤步骤之前进行。
注意：获取CD3未标记细胞，视为乙淋巴细胞部分，因为它们是洗脱到收集管。 - 拆下分离器和地点列到新款15 ml收集管。移液管2毫升分离缓冲液上柱。使用与列提供的柱塞洗脱阳性选择T淋巴细胞，这被认为是T淋巴细胞组分。
- 确定纯化的细胞（步骤1.15），如果必要的数目。细胞悬液现在已经准备好为下游实验。
孤立4.流式细胞仪分析扁桃体B和T淋巴细胞
注意：多聚甲醛溶液有刺激性，并可能致癌。穿戴合适的防护服，手套和防护眼镜/面罩。
注1：该协议描述通过荧光活化细胞的方法中的分离的B和T细胞的直接染色分选（FACS）分析。这个步骤的主要目的是评估所述分离的细胞群自动对焦的纯度之三CD3磁性抗体分离。为此建立B和T细胞标记物，荧光团共轭的单克隆抗体CD20-FITC和CD2-APC，被使用。还列入同种型对照抗体的强烈建议区分非特异性“背景”的CD2和CD20抗体（见步骤4.8）的结合。
注2：有可能保持在1％多聚甲醛的纯化的细胞级分在黑暗中（PFA）溶液，在4℃，直至染色的时间 （例如，第二天。）。也同样地进行适用，如果有染色和FACS分析之间的时间间隔。请记住，在这两种情况下的细胞应该正确地与（含0.2％BSA的PBS）缓冲液，对染色或FACS分析之前PBSA洗涤。
- 取出从步骤1.15跨国公司6×10 6个细胞（前施加到列）从步骤3.10从步骤3.9和T淋巴细胞部分，B淋巴细胞部分。
- 旋转细胞使用水平转子悬浮在300 XG 5分钟，在4℃。
- 用移液管除去上清液并用1ml冰冷的PBSA洗细胞沉淀一次。旋转细胞悬浮液在300×g离心5分钟，在4℃。用吸管去除上清，重悬 细胞在600微升冰冷PBSA缓冲液中。
- 加入100微升细胞悬浮液，以在FACS管的底部。
- 加入100微升含10％热灭活人血清，每管的PBS，拌匀孵育在室温〜1分钟或20分钟冰。
注：B淋巴细胞携带Fc受体。为了阻断Fc受体的纯化的细胞级分一起温育10％热灭活的人血清。的人血清是热在56℃下失活温育1小时。划分热灭活血清分成小等分试样并储存在-20℃。 - 离心细胞悬浮液在300×g离心5分钟，在4℃下，在SW荷兰国际集团出转子。
- 用移液管除去上清液并用1ml PBSA洗涤细胞沉淀。重复离心（300×g离心5分钟，4℃）。
- 加入100微升PBSA到冰上每管。添加荧光团共轭单克隆抗体的合适量，根据制造商的建议（例如，20微升抗CD20和/或5微升抗CD2抗体在100μlPBSA的）。注意：不要忘记分配足够的对照管的流式细胞仪分析。在这个协议中的下列控制应包括：1）染色单独的抗-CD2和抗CD20抗体的细胞，2）染色的细胞与单独的抗-CD2和抗CD20同种型对照抗体和，3）细胞不加的抗体。
- 短暂涡旋振荡试管并在黑暗中温育30分钟，在4℃。
- 与PBSA洗2次。加入2毫升1％PFA溶液的样品。让细胞保留在煤灰溶液在476下在黑暗直到FACS分析的时间。
- 立即运行样本在FACS仪器之前，（在4℃下300×g离心5分钟）用PBSA洗细胞2次。在1ml PBS中重悬样品保持在4℃（或在冰上），避光，之前在流式细胞仪的分离。
- 做下面的流式细胞仪制造商提供的流量协议的FACS分类。
在隔离扁桃体B和T淋巴细胞5 PCR检测腺病毒的DNA
注1：腺病毒六邻体基因的引物是AdRJC1（5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3'）和AdRJC2（5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3'）11。这些引物产生的139 bp的扩增。主机18S rRNA基因可以与引物tp206（5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3'）和TP207（5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'）进行检测。预期的扩增子大小为300基点。
注2：每个PCR运行包括阴性对照（蒸馏水H 2 O）和从人B细胞系（BJAB）得到的阳性DNA对照感染人类腺病毒5型12。
- 提取的DNA（来自至少1×10 6个细胞，步骤3.11），使用氧化硅膜基于柱纯化方法。采用苯酚和异硫氰酸胍溶液 13中提取RNA。
- 添加从B和T淋巴细胞100 ng的DNA至含有1x HF缓冲液，0.2mM的的三磷酸脱氧核苷酸的混合物（dNTP），0.25μM的每种引物和高保真DNA聚合酶在20微升的总体积1 U的反应混合物。
- 以下循环条件下进行PCR扩增：30秒变性，在98℃下，然后是98℃30个循环持续10秒，67℃（六邻体）或58℃（18S rRNA）的30秒和72℃ 30秒。 PCR反应结束时的7分钟，在72℃最终延伸步骤。
- 分离得到的PCR amplif上于1×TBE 1.5％琼脂糖凝胶ication产品缓冲液和通过用核酸染料染色可视化的预期条带。
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Representative Results
的扁桃体跨国公司结果在B和T淋巴细胞的高度纯化的亚群有效分离。这是通过FACS分析使用抗CD20和抗-CD2抗体，以检测B和T淋巴细胞群，分别（图3A）证实。与此相反，跨国公司导致细胞级分是从两个B和T细胞亚群（图3B）细胞的混合物低效的分离。
分离的扁桃体B和T淋巴细胞（图3A）是足够的质量为下游分析样核酸隔离。在当前的协议，DNA和RNA提取从B和T淋巴细胞被用于检测腺病毒的DNA和细胞的RNA。结果表明腺病毒DNA的扁桃体T淋巴细胞特异检测（图4）。从扁桃体B和T淋巴细胞也分离的RNA具有足够的质量和数量为downstrea米的应用程序（ 图5）。
图扁桃体淋巴细胞分离过程1.概述。腭扁桃体的样品进行处理，扁桃体跨国公司从细胞悬浮液通过密度梯度离心分离。 B和T淋巴细胞通过阳性选择的T淋巴细胞馏分人CD3磁性抗体的纯化成亚群。该纯化步骤，能够进一步评估分离细胞级分;例如，以确定是否某些病毒种类中的任何亚群的丰富。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2.手术切除腭扁桃体，由扁桃体切除术（左）和扁桃体部分切除术（右）去除扁桃腺。 请点击此处查看该图的放大版本。
富集的细胞部分的图3。代表FACS结果。（A）正向与侧面的散点图显示B（CD20）和T（CD2）淋巴细胞群在扁桃体跨国公司，T淋巴细胞和污水分数。的T和B淋巴细胞中富集的细胞级分的纯度为90％以上。由于B细胞包含的总流出物的细胞的92％，此级分命名为B淋巴细胞亚群。 （B）的FACS图显示出B和T细胞SUBP低效分离opulations，由于施加到列和洗涤步骤不足跨国公司非优化号码。除了 需要磁激活细胞分选的优化，有CD2的高背景- / CD20 -细胞，这表明FACS染色是不是很好的优化，请点击此处查看该图的放大版本。
图4. PCR检测腺病毒DNA的扁桃体淋巴细胞组分。总DNA是从B中提取和T淋巴细胞中分离从左侧和右侧扁桃体从患者正在接受扁桃体切除术。终点PCR是用100ng纯化的DNA进行的。泳道1：左侧扁桃体B淋巴细胞组分（B）;泳道2：的LEF T淋巴细胞比例（T）牛逼扁桃体;泳道3：右扁桃体B淋巴细胞组分（B）;泳道4：右扁桃体T淋巴细胞组分（T）的。腺病毒（AD）的DNA只有在检测到分离的T淋巴细胞部分。细胞18S rRNA基因作为内部控制，以显示相同的DNA量被用于所有样品中的PCR反应。 请点击此处查看该图的放大版本。
从分离的B和T细胞亚群中提取图5.高质量的RNA。从分离的B和T淋巴细胞中提取总细胞质RNA分离在1％琼脂糖凝胶。泳道1：左侧扁桃体B淋巴细胞组分（B）;泳道2：左扁桃体T淋巴细胞分数（T）;泳道3：右扁桃体B淋巴细胞组分（B）;泳道4：右扁桃体T淋巴细胞组分（T）的。 28S rRNA的迁移模式，18S rRNA和小RNA被显示出来。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
一个影响该协议的结果的最重要因素是使用新鲜扁桃体材料作为原料。因此，扁桃体样品应在3个小时的手术后处理。扁桃体可以从成人和儿童中获得。从孩子扁桃体材料通常是较小的由于局部手术切除扁桃体（扁桃体部分切除术）的。因此，从扁桃体部分切除术的样品（1×10 7 -1×10 8）中得到跨国公司的数目较少相比扁桃体样品（1×10 8 -2×10 9）。然而，细胞分离过程将无论手术的类型是相同的。
最大化从磁激活细胞分选方法获得的细胞亚群的纯度需要一些优化。的量和孵育时间用CD3磁性抗体和上柱跨国公司的数目是应该选择的主要因素imized。运用过多的细胞会导致色谱柱的堵塞和细胞亚群的低效富集。在本协议的优化，我们发现，在分离柱施加大于3×10 7跨国公司将导致塔和随后的不纯细胞级分（图3B）的堵塞。因此，从3×10 7跨国公司给出很好富集淋巴细胞的级分具有足够的质量和数量的DNA和RNA提取（图4和5）。预计孤立B和T淋巴细胞的最终数量为1-2×10 7和5-7×10 6。因此，20微升每3×10 7跨国公司CD3磁性抗体的使用似乎是最佳的成功B和T淋巴细胞分离（图3A）。
以往报告中已经确定，B和T淋巴细胞含有60-70％和扁桃体跨国公司的30-40％，分别为，而其他细胞类型的巨噬细胞样，自然杀伤细胞和树突细胞组成的扁桃体跨国公司14的 1-8％。相似的细胞的比例分别实现与我们的隔离协议如由B和T淋巴细胞用FACS技术（图3A）的免疫染色。
的洗涤步骤的数量和洗涤缓冲液体积是一个很好的结果的关键参数。因此，过度洗涤会导致CD3磁性抗体相关性T细胞，以最终在流通，而洗涤不足会降低T细胞级分的纯度。
一旦该协议的关键步骤是为组织类型和预期的下游分析优化，这种方法简便，高效，直观，节省时间。然而，这种方法的一个限制是商业磁性相关的细胞分选的试剂的成本相对较高，这可能会限制扁桃体的大规模纯化R B和T淋巴细胞。
总之这协议提供的策略用于获得B和T细胞亚群从腭扁桃体和可能被修改，以从其他组织一样脾脏，胸腺，淋巴结和血细胞分离的级分。我们进一步应用此方法表明我们检测腺病毒感染特别是在扁桃体T细胞级分（图4）。因此，该协议在广域应用中，包括在宿主 - 病原体相互作用，T细胞的细胞毒性，T细胞活化，细胞信号传导和B和T细胞表面标志物表达的研究是有用的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175-053 | Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine, 0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix |
| Freezing medium | 90% FBS and 10% DMSO | ||
| MACS buffer | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS containing 0.2% BSA | ||
| PFA | PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles. | ||
| Antibiotic-Antimycotic mix | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecting foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| Straight iris scissors | Fisher Scientific | 12912055 | |
| disposable scalpels | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm plastic cell strainer | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm plastic cell strainers | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml plastic syringe | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62547254 | |
| Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll solution |
| Fetal calf serum | Biological industries | 040071A | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS human CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS separator (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC) | BD Biosciences | 560642 | |
| CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC) | BD Biosciences | 556632 | |
| Human serum | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 software | BD Biosciences | ||
| Nucleospin Blood | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA isolation kit |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596 | RNA isolation reagent |
| Hemocytometer | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | cell counter device |
| GelRed | Biotium | 41003 | Nucleic acid gel stain |
References
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