Protocol
הפרוטוקול מתאר את הבידוד של תאי הלימפה מחומר מטופל אנושי ולכן דורש אישור אתי. נעשתה במחקר הנוכחי העבודה ניתנה על ידי המועצה לביקורת האתית אופסלה (DNR. 2013/387).
1. בידוד של תאי mononuclear (MNCs) משקדי הפלטין אדם
זהירות: כל חומר unscreened ממקור אנושי כמו דם, רקמות או נוזלי גוף צריכה להיחשב כחומר שעלול להיות נגוע. לכן, צריכים להיות אחרי נהלי בטיחות ביולוגית מומלצים לטיפול ברקמות האנושיות.
הערה: כדי למנוע זיהום, כל הפתרונות וציוד תרבית תאים חייבים להיות סטרילי. כל המאגרים והפתרונות צריכים להיות מראש מקוררים ושמרו על קרח. רקמות שקדים ותאים מבודדים צריכים להישמר וטיפלו על קרח.
- השג שקדים טריים מחולים שעברו כריתת שקדים או tonsillotomy (איור 2). לצלול clum הרקמהנ.ב. לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר מלא פתרון קר כקרח סטרילי הנקס המאוזן מלח (HBSS) בתוספת 5% בסרום שור עוברי (FBS), 10 מ"מ גלוטמין, 0.05 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין ו -1% תערובת אנטיביוטיקת antimycotic (פניצילין, סטרפטומיצין וAmphotericin B).
- שמור את הצינורות עם דגימות רקמת שקדים שקועות בכל העת על קרח. נסה לעבד את השקדים בהקדם האפשרי, ולא יאוחר מאשר 3 שעות לאחר הסרה כירורגית.
- מניחים את השקדים בצלחת תרבית תאי פלסטיק 60 מ"מ על קרח ולשמור על הרקמה טבולה בHBSS. הסר קרישי דם גלויים, שומן ורקמות חיבור עם מלקחיים נקיים ממשטח השקדים.
- השתמש בצלחת תרבית תאים חדשה 60 מ"מ המכילה 5 מיליליטר HBSS. חותך את גוש רקמת שקדים לתוך 3-10 ברי מ"מ בעזרת זוג מספריים סטרילי ו / או אזמל.
- הכן צלחת תרבית תאים חדשה 60 מ"מ המכילה 10 מיליליטר של HBSS ולמקם 100 מיקרומטר מסננת תא פלסטיק בפתרון HBSS.
- העבר את dissשברי שקדים השתקפו למסננת התא עם מלקחיים סטריליות. שימוש בסוף הבוכנה של מזרק פלסטיק, בצורה חלקה לסחוט את שברי רקמות דרך מסננת התא. ודא שברי השקדים שקועים לחלוטין בHBSS.
- מחק את מסננת התא עם שרידי הרקמה ולהעביר את ההשעיה תא וכתוצאה מצלחת תרבית תאי 60 מ"מ לתוך צינור צנטריפוגות פלסטיק 50 מיליליטר. השאר את הצינור על קרח בזמן שתמשיך בצעדים 1.8 ו -1.9.
- במקרה של שקדים גדולים, גדול מ- 2 סנטימטר בגודלם (איור 2), שברי השקדים לסחוט בשתי מסננות תא כדי למנוע סתימה של הרשת במסננת.
- השג את הנפח הסופי של 35 מיליליטר של ההשעיה התא.
הערה: בשלב זה ניתן להכין את ההשעיה התא להקפאה (ראה סעיף 2). - הוסף 10 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות כגון Ficoll לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. בעדינות שכבת suspens התאיון (שלב 1.9) על גבי פתרון שיפוע צפיפות. הימנע ערבוב של ההשעיה התא ופתרון שיפוע צפיפות.
הערה: פתרון שיפוע הצפיפות יש חימם עד RT. - צנטריפוגה ההשעיה התא בהרוטור את נדנדה ב 700 XG במשך 20 דקות ב RT. לא להפעיל את פונקצית הבלם בצנטריפוגות כמו בלימה מהירה עלולים לשבש את השיפוע. כמו כן, להשתמש בפונקצית התאוצה הנמוכה ביותר זמינה בצנטריפוגה.
הערה: לאחר שלב זה צנטריפוגה, להתבונן MNCs כשכבת רכה לבנה בממשק, ותאי דם אדומים (RBCs), fibroblasts ופסולת תא כמשקעים בתחתית של התחתית. - לאסוף בזהירות את שכבת MNCs באמצעות pipet 10 מיליליטר. מניחים את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש.
- להוסיף 25 מיליליטר של PBS קר כקרח להשעית התא ולסובב את הצינור ב XG 300 במשך 5 דקות בהרוטור את נדנדה על 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant באמצעות pipet 25 מיליליטרוחזור על שלב כביסה תא גלולה פעמים נוספות. לבסוף resuspend התא גלולה ב 15 מיליליטר של PBS.
הערה: לאחר שלב הכביסה האחרון, אפשר cryopreserve ההשעיה התא (ראה סעיף 2). - החל 10 μl של השעיה תא לתא ספירת תאי hemocytometer ולספור את מספר התאים תחת מיקרוסקופ. לוותר את הכמות המתאימה של תאים (לדוגמא, 2-3 x 10 7) בצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות להפרדת חרוז מגנטי שלאחר מכן. שמור aliquot זה על קרח עד שלב 3.2.
2. Cryopreservation של תאי שקדים
- להכין מדיום הקפאה (FBS 90% ו -10% DMSO) ולשמור אותו על קרח. לאחסון לטווח ארוך לשמור על תקשורת ההקפאה ב -20 ° C.
- לקבוע את המספר הכולל של תאים באמצעות תא ספירת תאי hemocytometer (שלב 1.15). לחשב את הכמות הנדרשת של מדיום הקפאה בהתאם לצפיפות התאים קפואים הרצוי (למשל, 10 7 תאs / מיליליטר של מדיום הקפאה).
- צנטריפוגה ההשעיה התא XG ב 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant מבלי להפריע גלולה התא וresuspend התא גלולה במדיום הקפאה קר כקרח (משלב 2.1).
- לוותר על 1 מיליליטר aliquots של ההשעיה התא לתוך צלוחיות סטריליים המיועדות לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי. להקפיא את הבקבוקונים בתא isopropanol ולאחסן אותם ב -80 CO ° / N. לשימור לטווח ארוך להעביר את הבקבוקונים לחנקן נוזלי המכיל מיכל אחסון או מקפיא תא C ° -140.
- להפשיר צלוחיות עם תאים קפואים, לחמם אותם במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מייד כשהפשיר, לפזר את ההשעיה התא לתוך 10 מיליליטר של HBSS המחומם מראש (עם תוספים, שלב 1.1) בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. לסובב את הצינור ב XG 300 במשך 5 דקות, להסיר את HBSS וresuspend התא גלולה בצפיפות תאים הרצויה בHBSS (עם תוספים, שלב 1.1).
הערה: הכדאיות של AF MNCsהפשרת ter היא בעל חשיבות, שכן הנוכחות של תאים מתים תקטין את התשואה הסופית של B מטוהר ולימפוציטים מסוג T.
הערה: על פי הניסיון שלנו כדאיות תא פחות 80% יפחית את יעילות בידוד תא.
3. חיובי בחירה של T לימפוציטים אוכלוסייה מMNCs השקדים
הערה 1: פרוטוקול זה מבוסס על סלקציה חיובית של לימפוציטים CD3 + T האנושי מMNCs שקדים באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים את נוגדן CD3. אפשר להתחיל מסעיף זה טרי (סעיף 1) או (2 סעיף) MNCs הקפוא.
הערה 2: התחל עם 3 x 10 7 MNCs. לא יעלה על מספר תא זה, מאז עמודות ההפרדה עלולות לסתום וזה יפחית את יעילות הבידוד. השתמש בעמודות גדולות יותר אם יותר תאים יטופלו. כרכי שימוש בפרוטוקול זה כבר מותאם באופן ניסיוני למספר תאינואד בהגדרת הניסוי שלנו.
- הכן את חיץ ההפרדה [PBS (pH 7.2), 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 2 מ"מ EDTA]. סנן את חיץ ההפרדה דרך פילטר 0.45 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- ספין ההשעיה MNCs (שלב 1.14) ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולה וכתוצאה מכך התאים ב240 μl (80 μl לכל 10 7 תאים) של חיץ הפרדה קר כקרח. מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור 2 מיליליטר סטרילי.
- הוסף 20 μl של נוגדן מגנטי CD3 לפתרון התא. דגירה הצינורות עבור שעה 1 ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציף כדי לשמור על תאים בתרחיף.
- להעביר את כל ההשעיה התא לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר חיץ הפרדה קר כקרח כדי לשטוף את התאים.
- צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בהרוטור את נדנדה.
- בינתיים הקים את המפריד ועמודה המגנטיים. צרף את המפריד המגנטי לדוכן ומניח את הטור בseparator. לשטוף את העמודה על ידי החלת 500 μl של חיץ הפרדה קר כקרח. מחק את הזרימה דרך.
- מניחים צינור איסוף חדש 15 מיליליטר מתחת לעמודה. שמור את צינור האיסוף על קרח.
- בטל supernatant (שלב 3.5) על ידי pipet ועדינות resuspend התא גלולה ב500 חיץ הפרדת μl. החל ההשעיה התא על גבי הטור מראש שטף ולתת לו לרוץ דרך.
הערה: גושים סלולריים עלולים להדביק את הטור ובכך להקטין את קצב הזרימה. כדי למנוע בעיה זו, להציב מסננת תא פלסטיק 40 מיקרומטר בראש הטור. עובר תאים דרך רשת זה יהיה מאוד לשפר את היעילות של שיטה זו. - לשטוף את העמודה 4 פעמים עם 1.5 מיליליטר של חיץ הפרדה (500 μl 10 7 תאים). חכה למאגר הטור להיות ריק (לא נוזלי יש לשים לב בעמודה) לפני יישום שלב הכביסה הבא.
הערה: השג את התאים ללא תווית CD3, נחשבים כחלק B לימפוציטים, כפי שהםeluted לתוך צינור האיסוף. - הסר את העמודה מהמפריד והמקום לתוך צינור איסוף 15 מיליליטר חדש. פיפטה 2 מיליליטר של חיץ הפרדה על הטור. באמצעות הבוכנה מסופקת עם הטור elute לימפוציטים מסוג T חיובי שנבחר, אשר נחשבים לחלק הלימפוציטים T.
- לקבוע את מספר התאים מטוהרים (שלב 1.15) במידת צורך. השעיות תא מוכנות לניסויים במורד הזרם עכשיו.
4. ניתוח תזרים Cytometry של מבודד השקדים B ו- T לימפוציטים
זהירות: פתרון Paraformaldehyde הוא גירוי ומסרטן חשוד. ללבוש בגדים מתאימים מגן, כפפות, ועיניים / פנים הגנה.
הערה 1: פרוטוקול זה מתאר שיטה לצביעה ישירה של B המבודד ותאי T-ידי תא קרינה המופעל מיון ניתוח (FACS). המטרה העיקרית של שלב זה היא להעריך את טוהר של התא המבודד אוכלוסיות AFter CD3 הפרדת נוגדן מגנטי. לB זה המטרה הוקם וסמני תא T, נוגדנים חד שבטיים fluorophore מצומדות CD20-FITC וCD2-APC, משמשים. גם ההכללה של נוגדני שליטת אלוטיפ מומלץ מאוד להבחין "הרקע" שאינו ספציפי מחייב של נוגדני CD2 וCD20 (ראה שלב 4.8).
הערה 2: אפשר לשמור על שברי תאים המטוהרים בparaformaldehyde 1% פתרון (PFA) בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד למועד מכתים (למשל, למחרת.). גם באותו ההליך ישים אם קיים פער זמן בין הצביעה וניתוח FACS. זכור כי בשני המקרים יש לשטוף תאים כראוי עם PBSA (PBS המכיל 0.2% BSA) חיץ, לפני מכתים או ניתוח FACS.
- קח את 6 x 10 6 תאים של MNCs מצעד 1.15 (לפני החלת לעמודה), חלק ב 'הלימפוציטים מצעד 3.9 וחלק הלימפוציטים T מצעד 3.10.
- ספין התאהשעיות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס באמצעות הרוטור את נדנדה.
- הסר את supernatant עם pipet ולשטוף את התא גלולה פעם אחת עם 1 מיליליטר של PBSA קר כקרח. ספין השעיות תא XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם pipet וresuspend תאים ב600 μl של חיץ PBSA קר כקרח.
- להוסיף את ההשעיה תא 100 μl לתחתית צינור FACS.
- להוסיף של PBS המכיל סרום אנושי מומת 10% חום לכל צינור 100 μl, מערבב היטב ודגירה ~ 1 דקות ב RT או 20 דקות על קרח.
הערה: לימפוציטים מסוג B נושא קולטנים Fc. כדי לחסום קולטני Fc השברים התא המטוהרים מודגרת עם סרום אנושי מומת 10% חום. הסרום האנושי הוא חום מומת על ידי דגירה על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. מחלקים את סרום החום מומת לaliquots הקטן וחנות קפוא ב -20 ° C. - צנטריפוגה ההשעיה התא XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס בSWing-את הרוטור.
- הסר את supernatant עם pipet ולשטוף את התא גלולה עם 1 מיליליטר PBSA. חזור על צנטריפוגה (300 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס).
- הוספת 100 PBSA μl לתוך צינור אחד על קרח. מוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים חד שבטיים fluorophore מצומדות, על פי המלצת היצרן (לדוגמא, 20 μl של אנטי-CD20 ו / או 5 μl של נוגדנים-CD2 אנטי בPBSA של 100 μl). הערה: אל תשכח להקצות מספיק צינורות שליטה לניתוח FACS. בפרוטוקול זה יש לכלול את הפקדים הבאים: 1) תאים מוכתמים בנוגדנים נגד CD2 ואנטי-CD20 בנפרד, 2 תאים) מוכתמים הנוגדנים נגד CD2 ואנטי-CD20 שליטת אלוטיפ בנפרד ו, 3) תאים ללא תוספת של נוגדנים.
- בקצרה מערבולת צינור דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף 2 פעמים עם PBSA. הוסף 2 מיליליטר של 1% פתרון PFA לדגימות. בואו התאים להישאר בפתרון PFA ב 476; C בחושך עד שהזמן של ניתוח FACS.
- מייד לפני הפעלת הדגימות במכונה FACS, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBSA (300 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס). דגימות Resuspend ב 1 מיליליטר של PBS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס (או על קרח), מוגנות מפני אור, לפני ההפרדה על cytometer את הזרימה.
- האם מיון FACS הבא הפרוטוקול מcytometer זרימת היצרן.
5. PCR איתור של Adenovirus DNA במבודד השקדים B ו- T לימפוציטים
הערה 1: פריימרים גן hexon אדנווירוס הם AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') וAdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. פריימרים אלו ליצור amplicon של 139 נ"ב. גן 18S rRNA המארח יכול להיות מזוהה עם tp206 פריימרים (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') וtp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3 "). גודל amplicon הצפוי הוא 300 נ"ב.
הערה 2: בכל PCRטווח כולל שליטה שלילית (H 2 O מזוקק) ושליטה חיובית DNA המתקבלת מקו B תא האנושי (BJAB) נגועה בסוג אדנווירוס האנושי 5 12.
- תמצית ה- DNA (מלפחות x 1 10 6 תאים, צעד 3.11) בשיטת טיהור טור מבוססת קרום סיליקה. לחלץ RNA באמצעות פנול וisothiocyanate guanidine פתרון 13.
- הוספת 100 DNA ng מ- B ולימפוציטים מסוג T לתערובת תגובה המכילה מאגר 1x HF, 0.2 מ"מ של תערובת אדנוזין deoxynucleotide (dNTP), 0.25 מיקרומטר של כל צבע יסוד ו1 U של האיכות הגבוהה DNA פולימרז בהיקף כולל של 20 μl.
- בצע הגברה PCR בתנאי הרכיבה על אופניים הבאים: 30 שניות בdenaturation 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 30 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 67 ° C (hexon) או 58 ° C (18S rRNA) למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. תגובת PCR הסתיימה בצעד ארכה סופי של 7 דק 'ב 72 מעלות צלזיוס.
- הפרד את מחזקי PCR וכתוצאה מכךמוצרי ication על 1.5% agarose ג'ל ב1x TBE חיץ ולדמיין להקות הצפויות על ידי צביעה עם כתם חומצות גרעין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שקדים בתת אוכלוסיות נקיות במיוחד של לימפוציטים B ו- T. זה אושר על ידי ניתוח FACS באמצעות אנטי CD20 ואנטי-CD2 נוגדנים לזהות B והלימפוציטים T אוכלוסיות, בהתאמה (איור 3 א). לעומת זאת, הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שבברי תאים שהם תערובת של תאים משני תת-אוכלוסיות B ו- T לימפוציטים (איור 3).
השקדים B המבודד ולימפוציטים מסוג T (איור 3 א) הם באיכות מספיק לניתוח במורד הזרם כמו בידוד חומצות גרעין. בפרוטוקול הנוכחי, DNA ו- RNA שחולצו מB ולימפוציטים מסוג T משמש לזיהוי של ה- DNA ו- RNA אדנווירוס הסלולרי. התוצאות מראות זיהוי ספציפי של DNA אדנווירוס בלימפוציטים מסוג T שקדים (איור 4). RNA גם מבודד מהשקדים B ולימפוציטים מסוג T הוא באיכות מספקת וכמות לdownstrea יישומים מ '(איור 5).
איור 1. סקירה כללית של הליך בידוד הלימפוציטים שקדים. דגימות שקדים הפלטין מעובדות וMNCs שקדים מבודדים מהשעית תא על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. לימפוציטים B ו- T הם מטוהרים לאוכלוסיות משנה על ידי בחירה חיובית של חלק הלימפוציטים T עם נוגדן מגנטי CD3 אדם. צעד טיהור זה עושה את זה ניתן להעריך עוד יותר את השברים תא המבודדים; לדוגמא, כדי לקבוע אם כמה מינים נגיפיים מועשרים בתוך כל אחת מהאוכלוסיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
jpg "/>
איור 2. מוסר בניתוח שקדים הפלטין. שקדים הוסרו על ידי כריתת שקדים (משמאל) וtonsillotomy (מימין). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות איור 3. הנציגים FACS של השברים תא המועשר. () קדימה לעומת B עלילת פיזור הצד מראה (CD20) ואוכלוסיות לימפוציטים T (CD2) בMNCs שקדים, הלימפוציטים T ושברים בשפכים. טוהר לימפוציטים מסוג T ו- B שבברי תאים מועשר הוא יותר מ -90%. מאז תאי B מהווים 92% מתאי השפכים הכולל, חלק זה נקרא כמו תת-האוכלוסיה B לימפוציטים. מגרשים (ב) FACS מראים הפרדה יעילה של B ותאי T subpopulations, בשל מספר מותאם שאינו של MNCs להחיל את הטור ושלבים כביסה מספיקים. מלבד הצורך בתא-מגנטי הופעל מיון אופטימיזציה, יש רקע גבוה של CD2 - / CD20 -. תאים, מה שמראה שמכתים FACS אינו מותאמת היטב אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. זיהוי PCR של DNA אדנווירוס שבברי שקדים הלימפוציטים. סה"כ DNA מופק B ולימפוציטים מסוג T מבודד מהשמאל והשקדים תקין מכריתת שקדים עוברים את חולה. נקודת סיום PCR מתבצע עם של ה- DNA המטוהר 100 ng. ליין 1: חלק ב 'הלימפוציטים (ב) לשקדי השמאל; מסלול 2: חלק T לימפוציטים (T) של LEFשקדים לא; מסלול 3: חלק ב 'הלימפוציטים (ב) לשקדים תקין; מסלול 4: חלק T לימפוציטים (T) של השקדים תקין. אדנווירוס DNA (מודעות) הוא זיהוי רק בחלק קטן הלימפוציטים T מבודד. מעשי גן הסלולרי 18S rRNA כבקרה פנימית כדי להראות שאותה כמות של DNA משמשת לתגובת PCR בכל הדגימות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. RNA איור באיכות גבוהה המופק מB המבודד ותת-האוכלוסיות של תאי T. RNA cytoplasmic סה"כ מופק B המבודד ולימפוציטים מסוג T הופרד על 1% agarose ג'ל. ליין 1: חלק ב 'הלימפוציטים (ב) לשקדי השמאל; מסלול 2: חלק T לימפוציטים (T) של השקדים השמאל; מסלול 3: חלק ב 'הלימפוציטים (ב) לשקדים תקין; מסלול 4:חלק T לימפוציטים (T) של השקדים תקין. דפוס הגירה של 28S rRNA, 18S rRNA ו- RNA הקטן מצויינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על התוצאה של פרוטוקול זה הוא השימוש בחומר שקדים טרי כחומר מוצא. לכן, צריכים להיות מעובד דגימות השקדים בתוך 3 שעות לאחר ניתוח. ניתן להשיג שקדים משני מבוגרים וילדים. חומר השקדים מהילדים הוא בדרך כלל קטן יותר עקב הסרה כירורגית החלקית של השקדים (tonsillotomy). לכן, מספר MNCs מתקבל מדגימות tonsillotomy (1 x 10 x 10 7 -1 8) הוא פחות בהשוואה לדגימות כריתת שקדים (1 x 10 x 10 8 -2 9). עם זאת, תהליך בידוד התא יהיה זהה ללא קשר לסוג הניתוח.
למקסם את טוהר של אוכלוסיות תאים המתקבלות מתא-מופעל מגנטי מיון שיטה דורש קצת אופטימיזציה. הסכום ודגירת הזמן עם נוגדן מגנטי CD3 ומספר MNCs להחיל את הטור הם הגורמים העיקריים שיש לבחורimized. החלת יותר מדי תאים תגרום סתימה של הטור וההעשרה יעילה של תת-אוכלוסיות של תאים. במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה, מצאנו כי החלת יותר מ 3 x 10 7 MNCs על עמודת ההפרדה תגרום סתימת הטור ושהברים שלאחר מכן טמאים תא (איור 3). לפיכך, החל עם 3 x 10 7 MNCs נותן שברים גם מועשר הלימפוציטים עם איכות וכמות מספקות להפקת DNA ו- RNA (איורים 4 ו -5). המספר הסופי של לימפוציטים מסוג B ו- T המבודד צפוי להיות 1-2 x 10 7 ו5-7 x 10 6, בהתאמה. לפיכך, שימוש של 20 μl של נוגדן מגנטי CD3 ל3 x 10 7 MNCs נראה אופטימלי עבור B המוצלח והפרדת T לימפוציטים (איור 3 א).
דו"ח קודם קבע כי לימפוציטים B ו- T מהווים 60-70% ו30-40% מMNCs השקדים בהתאמה, בעוד אחריםסוגי תאים כמו מקרופאגים, תאי רוצח טבעיים ותאים דנדריטים לפצות 1-8% מMNCs השקדים 14. פרופורציות תא דומות הושגו עם פרוטוקול הבידוד שלנו, כפי שמוצגות על ידי immunostaining של לימפוציטים מסוג B ו- T עם טכניקת FACS (איור 3 א).
מספר צעדי כביסה וכביסת חיץ הנפח הם פרמטרים קריטיים לתוצאה טובה. בהתאם לכך, שטיפה מוגזמת תגרום לתאי T הקשורים הנוגדן המגנטי CD3 בסופו של הזרימה דרך, ואילו כביסה מספיקה תפחית את טוהר של שבריר תא T.
ברגע שהשלבים הקריטיים בפרוטוקול מותאם לסוג הרקמה וניתוחים במורד הזרם הצפוי, שיטה זו היא פשוטה, יעילה, פשוטה וחיסכון בזמן. עם זאת מגבלה אחת של שיטה זו היא עלות גבוהה יחסית של חומרים כימיים מיון תא הקשורים מגנטיים מסחריים, אשר עשוי להגביל את הטיהור בקנה מידה גדולה של tonsillar B ולימפוציטים מסוג T.
בסיכום פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה להשגת B ותת-אוכלוסיות T משקדי הפלטין ועשוי להיות שונה כדי לבודד שברים תא מרקמות אחרות כמו טחול, בלוטת התימוס, בלוטות הלימפה ודם. בנוסף, אנו ליישם את השיטה כדי להראות שאנו מזהים זיהום אדנווירוס במיוחד בחלק תא T השקדים (איור 4). כך, פרוטוקול זה צריך להיות שימושי עבור שטח רחב של יישומים, כוללים מחקרים על אינטראקציות מארח הפתוגן, רעיל T תא, הפעלת תא T, איתות תא ו- B וביטוי סמן תא שטח T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175-053 | Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine, 0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix |
| Freezing medium | 90% FBS and 10% DMSO | ||
| MACS buffer | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS containing 0.2% BSA | ||
| PFA | PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles. | ||
| Antibiotic-Antimycotic mix | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecting foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| Straight iris scissors | Fisher Scientific | 12912055 | |
| disposable scalpels | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm plastic cell strainer | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm plastic cell strainers | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml plastic syringe | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62547254 | |
| Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll solution |
| Fetal calf serum | Biological industries | 040071A | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS human CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS separator (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC) | BD Biosciences | 560642 | |
| CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC) | BD Biosciences | 556632 | |
| Human serum | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 software | BD Biosciences | ||
| Nucleospin Blood | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA isolation kit |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596 | RNA isolation reagent |
| Hemocytometer | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | cell counter device |
| GelRed | Biotium | 41003 | Nucleic acid gel stain |
References
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
- Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
- Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
- Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
- Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
- Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
- Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
- Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
- Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
- Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
- Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).
