Introduction
الهجرة الخلية منسقة للغاية وحيوية لكثير من العمليات الفسيولوجية مثل تطوير الأنسجة، وإصلاح، وتجديد، وكذلك العمليات المرضية مثل ورم خبيث من السرطان وتصلب الشرايين 1. فهم هجرة الخلايا أهمية خاصة بالنسبة إلى العلاجات الناشئة تستخدم لإصلاح الأنسجة التالفة وعلاج الحالات المرضية، بما في ذلك تكنولوجيات زرع الخلايا والأنسجة الاصطناعية التطعيم 2. ونظرا للاهتمام الحالية في دور الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) في التوسط في إصلاح الأنسجة 3، قياس القدرة المهاجرة من هذه الخلايا باستخدام الفحص التي هي قابلة للقياس بدقة، قابلة للتكيف، وفعالة من حيث التكلفة والفائدة. الأهم من ذلك، يجب أن يكون مثل هذا الفحص حساس بما فيه الكفاية للكشف عن التغييرات الطفيفة نسبيا في قدرة المهاجرة الخلوية بعد الضرر. الأساليب الحالية لقياس الهجرة الخلية، بما في ذلك فحوصات الصفر، المقايسات الهجرة غير المشبعة جيدا (بويدن الفصلالكهرمانات)، صفائف micropillar، والمقايسات منطقة الحظر الخلية تمتلك مجموعة من القيود في التكاثر، والتفصيل، الكمي، وفعالية التكاليف 1،4،5. مقايسة الصفر الأمثل الموصوفة هنا يوضح نتائج قوية، وقدرات التحليل قابلة للقياس الكمي والصورة القائمة، وفعالية التكاليف، والقدرة على التكيف مع تطبيقات أخرى.
وقد استخدمت المقايسات الصفر في قدرات متعددة لتقييم هجرة الخلايا وانتشارها في ظل ظروف تجريبية مختلفة 5. الفحص يستلزم بذر خلايا معينة، وتزايد لهم لإكمال أو التقاء القريب، وخدش أحادي الطبقة الناتجة بإبرة معقمة أو طرف الماصة 6. يتم إجراء تحليل الأكثر شيوعا بمقارنة عرض الصفر على نقاط زمنية متعددة في مواقع مختارة عشوائيا 7-9. على الرغم من استخدامه بارز، هو مرتبك فحص الصفر التي كتبها القضايا مع استنساخ النوعي والكمي. التباين فيجيل من الصفر لا يغير فقط المكروية من الخلايا، ولكن يمكن أيضا أن تعيق الهجرة الخلية عن طريق إتلاف سطح اللوحة والكامنة خارج الخلية مصفوفة 5. وتجرى فحوصات في كثير من الأحيان أكثر من 7-12 ساعة، ولكن لخطوط الخلايا التي تظهر الهجرة أبطأ ومرات الفحص أطول، يصبح انتشار والخلط متغير 7،10. وأخيرا، يمكن للخلايا هرمة الناتجة عن عملية الخدش الافراج عن العوامل التي تتداخل مع إشارات الخلية المطلوبة لسد الفجوة في أحادي الطبقة 1. الاستفادة المثلى من مقايسة الصفر يتطلب خلق فجوة متسقة لا تتداخل مع خصائص السطح، والتقليل من فحص طول الوقت، ومنع موت الخلايا غير المرغوب فيها خلال التلاعب. مقايسة سدادة مقرها هو الأمثل لفحص منطقة الحظر الخلية. هذا الاختبار يستخدم سدادة توضع في منتصف البئر الذي يستبعد نمو الخلايا، ولكن يسمح الخلايا المراد بالذهب في جميع أنحاء منطقة الحظر المركزية.لتقييم الهجرة، تتم إزالة السدادة، ويوفر منطقة الحظر الناتجة سطح للهجرة إلى أن يحدث. ومع ذلك، هذا الاختبار الصعب تخصيص أو التكيف مع 10 وبالنسبة لبعض التطبيقات، ويمكن هذا الأسلوب أيضا أن تكلفة باهظة.
وعلى النقيض من المقايسات الصفر ومشتقاتها، المقايسات الهجرة غير المشبعة جيدا (أو بويدن المقايسات الغرفة) تقييم الهجرة عن طريق قياس عدد الخلايا التي تتحرك من غرفة واحدة، من خلال غشاء فلتر الصغيرة التي، في غرفة تحتوي على وكلاء الكيميائي 8،11، 12. هذه التقنية قد فائدة محدودة لالخلايا الملتصقة مثل اللجان الدائمة ليلي الهجرة من خلال غشاء مسامي، وخلايا التمسك الجانب غشاء تتعرض لعوامل الكيميائي، ويمكن أن يكون من الصعب تحديد بدقة. في حين أن الاختبار هو قادرة على دراسة بعض أنماط الهجرة ثلاثية الأبعاد، أنواع الخلايا المقيدة التي أنها قادرة على تحديد بدقة الحد هجرة الخلايا فائدتها 10. بديل آخر لفحوصات الصفر يستخدم مجموعة الركن الصغير، والذي يقيس الحركة الخلوية من خلال الفضاء ثلاثي الأبعاد باستخدام قدرة الخلايا على تشوه وتهاجر إلى مجموعة كبديل. Polydimethlysiloxane (PDMS) اللدائن الشفاء أكثر من العفن دقيقة وتعامل مع الأوزون وفبرونيكتين تنتج المكروية متجانسة وغير القابلة للتحلل. ويمكن أيضا أن تختلف تباعد الصغرى دعامة حسب الحاجة لقياس قدرة الخلايا على دخول مجموعة 4. يتم إنشاء قالب من خلال الحفر العميق أيون رد الفعل من رقائق السيليكون لإنشاء نسخة السلبي لارتفاع تبلغ نسبة أبعادها مجموعة 13. بينما يتعزز فحص من قبل التفصيل في، والقدرة على تصميم نموذج الهجرة ثلاثية الأبعاد، وتحليل من خلال رؤية مباشرة من الخلايا المهاجرة، وصعوبة في خلق المصفوفات الدقيقة عمود تعوق اقتصاديا استخدامه على نطاق واسع.
مقايسة الصفر الأمثل الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر كفاءة، كوسفعالية تي طريقة لإنتاج الخدوش تتفق التي يمكن تحليلها باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية. بدلا من قياسات عرض بسيطة مصنوعة عبر نقطة الصفر قبل وبعد الهجرة الخلية، والبرنامج يتيح للمستخدم تحديد مجموع المساحات الصفر قبل وبعد الهجرة. هذا التقدم يحد من قضية محاولة لتحديد مكان نقطة الصفر ينبغي أن تؤخذ القياسات العرض، وإذا كان العرض من نقطة الصفر موحد على طول طول انها. بالإضافة إلى ذلك، ناقش الأمثل دقيق لأعداد الخلايا، التقاء الخلية ونوع ودرجة الأضرار التي لحقت الخلايا من أجل زيادة الاستخدام الأمثل للفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، وخلايا انسجة الوسيطة الرئة (LR-اللجان الدائمة) من أنسجة الرئة القاصي تم عزل إما على أساس التعبير عنها من علامات سطح الخلية (CD45 NEG، CD31 NEG، هيئة السلع التموينية، 1 عالية، Epcam NEG) 14،15، وذلك باستخدام النباتى من النمو 16، أو باستخدام الهضم الأنزيمي 17. كانت ملتصقة LR-اللجان الدائمة المثقف في DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز ولا الجلوتامين، و 15٪ FBS، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري، و 2 ملي الجلوتامين (وسائل الإعلام كاملة من الآن فصاعدا) وحضنت عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. تم passaged LR-اللجان الدائمة 3-4 مرات للتأكد من مجموعة من الخلايا مع خصائص نمو متجانسة نسبيا لفحص الهجرة.
1. إعداد متموجة واحد رقائق
- لفصل اللجان الدائمة من الأطباق الثقافة القياسية 100 ملم، وغسل الخلايا مع 10 مل من 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني قبل تحسنت، نضح PBS وإضافة 4 مل من التربسين (0.25٪). احتضان 3-5 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية. نضح جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في أنبوب مخروطي الشكل، إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق لتكوير أسفل الخلايا.
ملاحظة: حضانة أطول في التربسين يمكن أن يغير مستقبلات سطح الخلية وربما يؤثر على الهجرة. - وسائل الاعلام نضح والخلايا resuspend في وسائل الإعلام كاملة جديدة. عد الخلايا، باستثناء الخلايا الميتة باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان وصفيحة خلايا انسجة 500،000 الوسيطة في 4 مل من وسائل الإعلام كاملة على 60 مم طبق ثقافة الخلية.
ملاحظة: اعتمادا على مصدر للخلايا، وقد تكون الاختبارات اللازمة لتحديد العدد الأمثل من الخلايا اللازمة. - احتضان الخلايا حتى لوحات هي 90٪ متموجة لمرفق الخلية الأمثل والانتشار، وعادة 48-72 ساعة عن اللجان الدائمة.
ملاحظة: لا ينصح 100٪ التقاء، لأن العديد من تعتمد على مرسى تثبيط الخلايا تجربة الاتصال، الأمر الذي قد يغير قدرة هجرتها. سوف وحات مع أقل من 80٪ التقاء يؤدي في الصور غير صالحة للاستعمال بسبب برنامج تحليل الصور وتفسير الفجوةالصورة بين الخلايا كجزء من محيط الصفر (انظر الشكل 1D). - بعد الخلايا قد وصلت 90٪ التقاء، تلف الخلايا بما يتناسب مع التطبيق. لتقييم تلف الخلايا بعد التعرض للذوبان استخراج دخان السجائر (CSE)، وتوليد 100٪ CSE عن طريق رسم الدخان من 1 جامعة كنتاكي البحوث السجائر (3R4F) من خلال 25 مل من وسائل الإعلام كاملة في قارورة بوشنر أكثر من 2 دقيقة 18.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 4 مل 1-4٪ CSE مخففة في وسائل الإعلام كاملة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة الدافئ، قبل أن يحل محل مع 4 مل وسائل الإعلام كاملة جديدة.
ملاحظة: إتلاف الخلايا مع تركيزات عالية من استخراج دخان السجائر (> 5٪) قد يقلل إلى حد كبير التقاء.
2. إنشاء خدش
- في بيئة معقمة، وإزالة الغطاء من 60 ملم لوحة من اللجان الدائمة التالفة، ووضع حافة مستقيمة (على سبيل المثال مسطرة بلاستيكية معقمة) ACروس حافة العلوية للوحة. دون إزالة وسائل الإعلام، واستخدام معقم 200 ميكرولتر طرف الماصة تسترشد معقمة مستقيم الحافة لجعل واحدة إلى أربع الخدوش موازية عبر لوحة ما يقرب من 5 مم وبصرف النظر و 50 مم.
ملاحظة: A حافة مستقيمة يقلل من كمية تعديلات التناوب حاجة إلى لوحة عندما يكون على خشبة المسرح المجهر. ومن الضروري أن الخدوش تظهر عمودية تماما (أو أفقية) على الشاشة. توليد خدوش متعددة على 60 ملم لوحة لا يغير من المكروية في الطريقة التي يؤثر الهجرة الخلية (لا تظهر البيانات)، ولكن قد يكون النظر لأنواع الخلايا الأخرى. لا ينصح استخدام الآبار الصغيرة منذ تقلب الخلايا المتزايد على مقربة من حافة البئر يصبح أكثر وضوحا ويمكن أن تؤثر جيل موحد من الخدوش. - نضح في وسائل الاعلام وغسل بلطف لوحات مع 2 مل من وسائل الإعلام كاملة استعد مسبقا لمنع الخلايا من الانضمام إلى مركز للخدش، وإزالة الخلاياالصورة التي تم خففت من الخدش. استبدال 4 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
- باستخدام علامة دائمة العقيمة، وتسمية كل نقطة الصفر 1-4 على الجانب السفلي من لوحة في الموقع الذي لن تتداخل مع تصوير الخدوش.
ملاحظة: من المهم أن الصور من نفس نقطة الصفر تتم مقارنة قبل وبعد الهجرة، منذ يمكن أن يكون هناك تباين في العرض الصفر.
3. أخذ الصور الأولية للخدش
ملاحظة: إذا تم إجراء الفحص الصفر على لوحات متعددة، فمن المستحسن أن يتم أخذ الصور الأولية لجميع خدوش على لوحة واحدة قبل أن يتم بعمل خدوش على لوحة القادمة.
- استخدام المرحلة المجهر النقيض المقلوب مع كاميرا لتوليد الصور اللازمة للتحليل.
- وضع لوحة الثقافة على المجهر، واستخدام الهدف منخفضة الطاقة (10X) لتحديد موقع نقطة الصفر # 1. إذا التكثيف على غطاء لوحة الثقافة يعوق وايماج اضح (ه) من الخلايا، استخدام مجموعة مرحلة ساخنة إلى 37 درجة مئوية.
- الحفاظ على الصفر أفقي تماما ومركز مجال الرؤية، الحصول على العديد من الصور حسب الضرورة ليشمل 90٪ من طول الصفر ل. الحصول على صور من أجزاء متميزة من نقطة الصفر مع أي تداخل بين الصور.
ملاحظة: انكسار الضوء على حواف الطبق الثقافة overexposes الصور، مما يجعلها مستحيلة لتحليلها. لذلك، لا تأخذ الصور من الاول والاخير 5٪ من طول الصفر ل. - حفظ الصور من كل نقطة الصفر في مجلد منفصل.
- كرر الخطوات من 3،2-3،4 لخدوش 2 و 3 و 4.
- العودة إلى لوحات الحاضنة مباشرة بعد التصوير الأولي. السماح تهاجر الخلايا لل7/4 ساعة.
ملاحظة: 7 ساعة هو الأمثل عند تقييم اللجان الدائمة التالفة مع CSE. احتضان الخلايا لمدة تزيد عن 7 ساعات غير مستحسن بسبب تكاثر الخلايا يمكن أن تكون بمثابة متغير الخلط للهجرة الخلايا (انظر اختياري ملاحظة 8.2 أدناه).
الطبقة = "jove_title"> 4. تحليل الأولية خدش الصور
- تحميل يماغيج وتثبيت الجرح أداة شفاء المساعد (يرجى الرجوع إلى جدول المواد / المعدات).
- فتح ملف الصورة في يماغيج، ثم انقر فوق "عملية" و "البحث عن الحواف" لتسليط الضوء على الخلايا المحيطة الصفر لأداة شفاء الجروح لحساب مساحة الصفر (الشكل 2B). التالي، انقر فوق "صورة"، "ضبط"، "اللون عتبة" و في القائمة المنسدلة المسمى "عتبة اللون" تغيير القيمة إلى "B & W".
- ضمن القائمة "اللون عتبة"، وضبط كل من المتزلجون عتبة سطوع حتى يتحقق النقيض الأمثل بين الصفر وخلية الجبهة. لإتاحة الفرصة لأكبر مجموعة عند محاولة إنشاء التباين في الصورة، حرك شريط التمرير السفلي تماما إلى اليمين (صورة سوداء تماما)، ثم ضبط شريط التمرير الأعلى لتوليد أقصى قدر من التباين.
- ضبط ببطء بري كبارالمنزلق ghtness من اليسار إلى اليمين حتى تكون الصورة يعرض نظيفة كفاف من الصفر (الشكل 2C). مرة واحدة وقد تم التعرف على حواف الصفر، وانقر على زر "المزيد من أدوات" في شريط الأدوات يماغيج، حدد "MRI_Wound_Healing_Tool" من القائمة المنسدلة، ثم اضغط على زر "م" (الذي سيظهر في شريط الأدوات يماغيج) لتسليط الضوء على منطقة الصفر والإخراج المنطقة المحسوبة في نتائج نافذة المنبثقة (الشكل 2D).
- نسخ ولصق كل الأرقام من نتائج نافذة (الشكل 2E) إلى جداول اكسل. تأكد من فصل البيانات من الخدوش الفردية.
5. أخذ الصور النهائية للخدش
- بعد الخلايا هاجر (4-7 ساعة)، كرر الخطوات من 3،2-3،4. صورة لوحات في نفس الترتيب الذي تم خدش بحيث كان الخلايا على كل لوحة وقتا متساويا للهجرة.
ملاحظة: هذه الخلايا يمكن تصويرها عند نقاط زمنية متعددة، اعتمادا على سينسي بهمالناقلية إلى كل من درجة الحرارة ودرجة الحموضة التغييرات. بدلا من ذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية تستخدم لمتابعة الخلايا في الوقت الحقيقي كما تهاجر.
6. تحليل نهائي خدش الصور
- كرر الخطوات من 4،2-4،5 للصور خدش النهائية.
7. حساب المساحة خدش لقياس الهجرة
- حساب منطقة ما قبل الهجرة متوسط عن طريق حساب متوسط القيم المنطقة الأولى من الخدوش منها.
- حساب المبلغ الإجمالي للهجرة عن طريق طرح منطقة الهجرة النهائية لكل صورة، وتحسب في الخطوة رقم 6 من متوسط منطقة ما قبل الهجرة (الخطوة 7.1). إنشاء قائمة من القيم لكل الصفر يمثل التغير في الهجرة.
- تجميع البيانات من الخدوش متعددة ضمن المجموعة اختبار نفس (أي جميع لوحات وجميع خدوش على الخلايا المعرضة ل0٪ CSE). استخدام تحليل التباين اختبار لتحليل الاختلافات بين المجموعات التجريبية.
- إذا كانت الخلايا بطيئة للهجرةوتتطلب وقتا أطول الحضانة بعد الخدش (أكبر من 10-12 ساعة)، إجراء BrDU أو EDU التأسيس فحص 19 لتحديد ما إذا كانت الخلايا تشهد أي انتشار خلال الفترة التي مقايسة الهجرة يحدث. اختيار الهجرة الوقت مقايسة لتجنب تكاثر الخلايا كبيرا.
8. اختياري
- لتقييم ما إذا كانت الشيخوخة خلية كبيرة ويحدث نتيجة لإجراء الخدش، وإجراء بيتا غالاكتوزيداز فحص المرتبطة الشيخوخة على لوحة اختبار في أوقات محددة سلفا بعد الخدش 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأجريت فحوصات الصفر المقدمة هنا باستخدام خلايا اللحمة المتوسطة انسجة الرئة المقيمين الفئران (LR-اللجان الدائمة) ومعزولة كما المشار إليها في المذكرات البروتوكول. وفاز المصنف LR-اللجان الدائمة في مناطق ذات كثافة من 500،000 الخلايا في 60 ملم صحن زراعة الأنسجة، ونمت إلى 90٪ التقاء في 48 ساعة. لتوليد الضرر، وقد حضنت 4٪ CSE (المذكورة أعلاه) مع الخلايا لمدة 24 ساعة بعد فترة البذر الأولية ولكن قبل فحص الصفر. لكل فحص، تم إنشاء الصفر باستخدام الماصة غيض 200 ميكرولتر. أخذت الصور الأولية بعد أن تم إنشاء نقطة الصفر، وكان قد تم غسلها أي خلايا فضفاضة والحطام بعيدا مع وسائل الإعلام كاملة. كما هو مبين في الشكل 1A و B، التقاء المناسب هو المهم التأكد من أن البرنامج التصوير يمكن تحديد حدود الصفر بشكل صحيح. كما هو مبين في الشكل 1C، الخلايا ليست متكدسة بما فيه الكفاية (إما بسبب عدم كفاية كثافة البذر، وعدم كفاية المؤتمر الوطني العراقيمرات ubation، أو الضرر المفرط)، والذي يمكن أن يؤدي إلى الخدوش مع حدود غير المتجانسة التي لم يتم تمييزها بسهولة عن طريق برامج التصوير (1D الشكل). الشكل 2 يوضح الحصول على الصور وتحليلها. الشكل 2A يصور الصورة الأصلية قبل التحليل. الشكل 2B يبين نتيجة "إيجاد الحواف" أداة ضمن القائمة "العملية" (الخطوة 4.2)، والشكل 2C يظهر في الصورة التالية تعديل "اللون عتبة" شريط التمرير (الخطوة 4.3). الشكل 2D يصور الصورة النهائية تحليلها بعد تشغيل MRI_Wound_Healing_Tool المساعد (الخطوة 4.4). الشكل 2E يصور المنبثقة من نافذة النتائج، وتسليط الضوء (مربع أحمر) الأرقام التي يتم إنشاؤها. يتم عرض ما قبل ممثل وبعد الهجرة الصور في الشكل (3)، مع حدود منطقة الصفر المقابلة على النحو المحدد في برامج التصوير الشكل 4 زيوضح raphically القدرة المهاجرة غيرت ينظر في LR-اللجان الدائمة بعد الضرر مع 4٪ CSE. في الشكل 4A و B، ومتوسط احتساب المناطق الصفر (بالبكسل) لكل من 4 الخدوش مصنوعة عبر لوحة من LR-اللجان الدائمة في 95٪ التقاء إما قبل أو بعد الهجرة، مع التعرض إلى أي 0٪ CSE أو 4٪ تتم مقارنة CSE. الشكل 4C يقارن متوسط التغير المحسوبة في منطقة الصفر (منطقة بعد الهجرة تطرح من منطقة ما قبل الهجرة) في LR-اللجان الدائمة يتعرض إما 0٪ أو 4٪ CSE، مما يدل على أقل الهجرة (التغيير انخفاض متوسط في منطقة الصفر ) بعد التعرض إلى 4٪ CSE.
الشكل 1: التقاء الصحيح هو أمر حاسم لجيل قوي استنساخه الصفر الفحص. (A) الفئران LR-اللجان الدائمة في 95٪ التقاء، مناسب لقرار مجلس الأمنatching. (B) A الصفر ناجحة في 95٪ التقاء. (C) LR-اللجان الدائمة في 70٪ التقاء، منخفضة للغاية بالنسبة لنقطة الصفر ناجحة. (D) الحصول على الصور في 70٪ التقاء يمكن أن تنتج حدود كاذبة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور الممثل يدل على الحصول على الصور وتحليلها (A) الصورة الأصلية. (B) صورة التالية تطبيق "إيجاد الحواف" أداة ضمن القائمة "العملية" (الخطوة 4.2). (C) صورة بعد التعديل وفقا لل"اللون عتبة" شريط التمرير (الخطوة 4.3). (D) صورة بعد تشغيل البرنامج المساعد MRI_Wound_Healing_Tool (الخطوة 4.4). (E) Results المنبثقة تسليط الضوء على نافذة (مربع أحمر) الأرقام التي يتم إنشاؤها في كل مجال. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور الممثل من الصفر فحص مقارنة خدش LR-اللجان الدائمة قبل وبعد الهجرة (A) التمثيلية الصورة الأصلية قبل الهجرة. (B) مخطط محسوب منطقة الصفر قبل الهجرة. (C) التمثيلية الصورة الأصلية بعد الهجرة. (D) لمحة عامة عن منطقة الصفر محسوبة بعد الهجرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
<IMG ALT = "الشكل 4" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
الرقم 4: ممثل النتائج من الصفر فحص مقارنة القياس الكمي للمنطقة الصفر قبل وبعد الهجرة LR-MSC، والتعرض إلى أي 0٪ أو 4٪ CSE. (A) التمثيل البياني للمتوسط مساحة الصفر المحسوبة (بالبكسل) لكل من 4 الخدوش مصنوعة عبر لوحة من LR-اللجان الدائمة في 95٪ التقاء إما قبل أو بعد الهجرة، مع التعرض ل0٪ CSE، مع البيانات المقدمة كما يعني والانحراف المعياري. (B) التمثيل البياني للمتوسط مساحة الصفر المحسوبة (بالبكسل) لكل من 4 الخدوش مصنوعة عبر لوحة من LR-اللجان الدائمة في 95٪ التقاء إما قبل أو بعد الهجرة، مع التعرض إلى 4٪ CSE، مع البيانات المقدمة كما يعني والانحراف المعياري. (C) مقارنة متوسط التغير المحسوبة في منطقة الصفر (الهجرة بعد مسبقا) في LR-اللجان الدائمة يتعرض إما 0٪ أو 4٪ CSE، مما يدل على أقل الهجرة (متوسط التغير أقل في قرار مجلس الأمنمنطقة atch) بعد التعرض إلى 4٪ CSE، مع البيانات المقدمة كما المتوسط والانحراف المعياري، * P = 2.99 × 10 -8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر، طريقة موحدة قوية من الناحية الكمية لأداء وتحليل فحوصات الصفر. تستخدم المقايسات خدش بسيط روتيني في العديد من مناطق مختلفة من الدراسة لدراسة الهجرة الخلوية. ومع ذلك، عادة فحص الصفر يفتقر إلى موحدة مجموعة المتابعة وتقدير بروتوكول، مما أدى إلى مشاكل مع استنساخ 7،10. خفضت العديد من التعديلات والتحسينات لتحسين فحص الصفر هذه القضايا، بما في ذلك الأفراد التصوير الخلية الحية، المقايسات القائم على سدادة موحدة، وثلاثة فحوصات الركن الصغير الأبعاد 4،8،10. ومع ذلك، يمكن لهذه المقايسات يكون من الصعب تخصيص أو التكيف مع 10 وبالنسبة لبعض التطبيقات، وهذه التقنيات يمكن أيضا أن تكون تكلفة باهظة.
لإنتاج بروتوكول نقطة الصفر فحص موحدة، هناك العديد من الخطوات الهامة في بروتوكول المعروضة هنا التي تحتاج إلى معلومات محددة حول invol الخلايافيد، والاستغلال الأمثل للمقايسة على أساس الخصائص الخلوية ذات الصلة. على وجه الخصوص، من المهم تحسين عدد من الخلايا اللازمة والوقت في الثقافة اللازمة من أجل تحقيق أحادي الطبقة موحدة في 90-100٪ التقاء للمقايسة (الخطوة 1.3 و 1.4 خطوة). مع عدد قليل جدا من الخلايا (أقل من 90٪ متموجة)، فإن الخلايا لا تشكل أحادي الطبقة كافية. ليس هذا فقط سوف تؤثر على المكروية الخلوية، ولكنها سوف تؤثر أيضا على قدرة برامج التصوير لتحديد حواف الصفر بشكل صحيح. في المقابل، قد يؤدي العديد من الخلايا في أحادي الطبقة (100٪ متموجة، أو خلايا مكدسة) جيدا في الاتصال كبت، وبالتالي تغيير خصائص المهاجرة من الخلايا. بعض الاختلافات من بروتوكول الصفر فحص يوصي نمو الخلايا إلى 100٪ التقاء ولا تعتبر هذا القيد المحتمل للخلايا اتصال حساسة معينة مثل اللجان الدائمة 8. ينبغي تطبيق نفس المخاوف لدرجة الضرر الذي هو infliالمديرية التنفيذية على الخلايا (الخطوة 1.5). تم تصميم بروتوكول صفها هنا لتقييم التغيرات في الهجرة الخلية بعد الضرر عن التعرض لدخان السجائر القابلة للذوبان على اللجان الدائمة قدرة المهاجرة، ولكن هذا الاختبار يمكن أن يكون مفيدا أيضا في تقييم تأثير العديد من أنواع مختلفة من الضرر على الهجرة الخلية. من المهم أن الضرر المنكوب غير كافية لتوفير تمييز الإحصائية بين المجموعتين التجريبية والضابطة. ومع ذلك، قد يؤدي الكثير من الضرر أيضا في انخفاض التقاء الخلية، والتي مرة أخرى قد تؤثر على قدرة برامج التصوير لتحديد حواف الصفر بشكل صحيح.
كلا الشيخوخة الخلوية وانتشار الخلوي يمكن أن يكون من العوامل المربكة التي يمكن أن تغير زورا نتائج الفحص الصفر. على وجه الخصوص، ينبغي النظر في جيل من الصفر بعناية لتجنب الضرر المفرط للخلايا المحيطة التي قد تؤدي إلى الشيخوخة. الخدش مع ماصة غيض من البلاستيك بدلا من اللحمةجيم إبرة أو مشرط يتجنب الضرر الزائد مع الحفاظ على سلامة سطح لوحة الثقافة في منطقة الهجرة ومصفوفة خارج الخلية (الخطوة 2.1). وبالإضافة إلى ذلك، وطول الزمنية التي يسمح الهجرة الخلية أن يحدث ويجب النظر بعناية لتجنب تكاثر الخلايا كبيرا كمتغير الخلط (الخطوة 3.7). لتحليل الهجرة LR-MSC و 7 ساعة هو الأمثل عند تقييم الخلايا التالفة مع CSE. احتضان الخلايا لمدة أكبر من 12 ساعة بشكل عام لا ينصح، ولكن هذا قد لا ينطبق على جميع أنواع الخلايا، ولا سيما مع معدلات مضاعفة منخفضة جدا. لتقييم كل من الشيخوخة الخلوية وتكاثر الخلايا، وهو مزيج من المصاحب الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز وBrDU أو EDU التأسيس لا يمكن أن يؤديها على الخلايا في نهاية الفحص 19. الأهم من ذلك أن بروتوكول الموصوفة هنا هو الوصول إلى مختبرات مع قدرة تقنية محدودة، لا تتطلب سوى نوعية جيدة مقلوب المرحلة المجهر وعلى النقيض من الكاميرا. الالكواشف غير مكلفة، وبرامج التصوير مفتوح المصدر. ومع ذلك، من أجل ضمان تحقيق أفضل النتائج من هذا الاختبار، بما في ذلك استنساخ جيدة والقدرة على إجراء تحليل إحصائي دقيق، ينبغي النظر الأمثل دقيق لكل نوع من الخلايا جديد أو الضرر السيناريو التجريبية التي شرع فيها.
تحسينات قدمت في هذا عنوان بروتوكول بعض القيود الحالية في العمل السابق عمله لتوحيد المقايسات نقطة الصفر. في حين بروتوكولات الفحص الصفر تقليديا أخذ القياسات عرض الصفر من لقطة من 8،9 نقطة الصفر، وبروتوكول المعروضة هنا يستخدم قياسات منطقة من الصور التي التقطت على طول كامل من الصفر إلى زيادة الدقة الإحصائية وأن تأخذ في الاعتبار التناقضات في عرض الصفر الأولي. وبناء على اختبار المتكررة (لا تظهر البيانات)، لا يمكن أن يفترض عرض الصفر لتكون متسقة تماما في جميع أنحاء طوله. بعد الهجرة، وحواف عشرالبريد الصفر تصبح أكثر غير متجانس، مما يجعل من الصعب على نحو متزايد لحساب بدقة عرض الصفر، وكذلك يتطلب حسابات المجال. يستخدم هذا البروتوكول MRI_Wound_Healing_Tool، برنامج كمبيوتر متخصص، من أجل خفض الذاتية وزيادة الاتساق عند تحليل منطقة الصفر. في حين أنه من غير المعروف ما إذا كانت حسابات العرض بسيطة يمكن أن تسفر عن نتائج محددة بما يكفي للتمييز بين الاختلافات الطفيفة في الهجرة بسبب CSE مسبق أو غيرها ضارة، يوضح هذا البروتوكول هذه الحساسية. تحسينات الواردة في هذا البروتوكول تجديد فحص الصفر المشترك لمعالجة هذه القيود بطريقة مجدية اقتصاديا، لتقديم خيارات التخصيص، وتوفير تقنيات إضافية لإثبات حساسية والتحقق من صحة النتائج.
والأمثل الكمي فحص الصفر الموصوفة في هذا البروتوكول ما زال محدودا بالنظر في السكان الخلية، بدلا من الخلايا الفردية. هذا assum تقنيةوفاق أن سكان الخلية متجانسة نسبيا، وأن هذا سيؤدي إلى خصائص الهجرة متجانسة نسبيا. اعتمادا على التطبيق، قد يكون أكثر أهمية للنظر في هجرة الخلايا الفردية بدلا من ذلك 8. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول نقطة الصفر مقايسة الموصوفة هنا يعتمد على مجموعة من الخلايا التي لن تتكاثر بسرعة كافية لإرباك تحليل الهجرة خلال فترة 4-7 ساعة. أن خطوط الخلايا التي قد تنتشر على نطاق واسع خلال هذه الفترة الزمنية القصيرة لا تكون مناسبة لتحليل باستخدام هذه التقنية. على الرغم من هذه القيود، هذا البروتوكول الصفر فحص الكمي لديه القدرة لاستخدامها في العديد من التطبيقات المختلفة. على سبيل المثال، قد يكون الأمثل مقايسة على أساس الضرر الخلية ومن ثم استخدامها لتقييم قدرة علاجات معينة للحد من تلف الخلايا. بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم هذا الاختبار مع خطوط الخلايا السرطانية لتقييم العلاجات المحتملة للحد من قدرة المهاجرة، وبالتالي إمكانية النقيلي، سو هذه الخلايا. هذا الصفر فحص الأمثل هو أيضا لا تزال محدودة بسبب اضطرابات محتملة لالمكروية الخلية التي لا يمكن تجنبها في توليد نقطة الصفر. ومع ذلك، من خلال تحديد دقيق لمستوى التقاء الخلايا، وزيادة الخلايا وتوليد صحائف من الخلايا التي فصلت جزئيا على حافة الصفر يمكن تجنبها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
