Introduction
細胞移動は、組織開発、修理、再生、ならびにがんの転移や動脈硬化1と病理学的過程として多くの生理学的プロセスに非常に協調的かつ不可欠です。細胞遊走の理解は、損傷を受けた組織を修復し、細胞移植技術と2グラフト人工組織などの病理学的状態を治療するために使用される新規治療薬に特に関連します。厳密に、定量化適応可能で、かつコスト効率が重要であるアッセイを用いてこれらの細胞の遊走能を定量化する、組織修復3の媒介における間葉系間質細胞（MSC）の役割現在の関心を考えます。重要なことは、このようなアッセイは、損傷後の細胞遊走能が比較的微妙な変化を検出するのに十分な感度でなければなりません。スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ（ボイデンCH含む細胞遊走を定量するための現在の方法は、琥珀）、マイクロピラーアレイ、および細胞排他ゾーンアッセイは再現性、カスタマイズ、定量化、および費用対効果1,4,5の制限の範囲を有します。ここで説明する最適化されたスクラッチアッセイは堅牢な成果、定量化、および画像ベースの解析機能、費用対効果、および他のアプリケーションへの適応性を示しています。
スクラッチアッセイは、種々の実験条件5下で細胞の遊走および増殖を評価するために、複数の容量で使用されてきました。アッセイは、またはそれに近い合流を完了するためにそれらを成長、指定された細胞を播種し、滅菌針またはピペットチップ6と、得られた単層を傷つけ伴います。分析は、最も一般的に、ランダムに選択された位置7-9における複数の時点にわたるスクラッチの幅を比較することによって行われます。その顕著な使用にもかかわらず、スクラッチアッセイは、再現性と定量化の問題によって混乱されます。変動でスクラッチの発生だけでなく、細胞の微小環境を変化させるだけでなく、プレート表面とその下の細胞外マトリックス5を損傷することによって細胞遊走を阻害することができます。アッセイは、しばしば12時間に7にわたって実施されている、しかし、より遅い移行と長い分析時間を表示する細胞株について、増殖が交絡変数7,10になります。最後に、スクラッチ・プロセスによって生成された老化細胞は、単層1のギャップを埋めるために必要な細胞外シグナル伝達を妨害因子を放出することができます。スクラッチアッセイの最適化は、アッセイ時間の長さを最小にし、操作中の望ましくない細胞死を防止、表面特性を妨害しない一貫したギャップの生成を必要とします。ストッパーベースのアッセイは、細胞の除外ゾーンアッセイの最適化です。このアッセイは、細胞増殖を除外ウェルの中央に配置されたストッパを利用するが、細胞が中央排除区域の周囲にメッキされることを可能にします。移行を評価するために、ストッパーを除去し、得られた排他ゾーンは、移行が発生するための表面を提供します。しかし、このアッセイは、10のカスタマイズ又は適合させることが困難であり、いくつかの用途のために、この技術はまた、法外な費用がかかることができます。
スクラッチアッセイおよびその誘導体、トランスウェル遊走アッセイ（またはボイデンチャンバーアッセイ）とは対照的に走化性剤8,11を含むチャンバ内に、微孔性ろ過膜を介して、一方のチャンバから移動する細胞の数を定量化することによって、マイグレーションを評価します、 12。多孔質膜を介した移行後、細胞は走化性薬剤に暴露された膜面に付着し、正確に定量化することは難しいことができますので、この技術は、MSCのような接着細胞のための有用性を制限しています。アッセイは、いくつかの三次元の移動パターンを検査することができるが、制限された細胞型はれる正確細胞移動の制限その有用性を定量化することができ、10。スクラッチアッセイの別の方法としては、変形し、代理として配列中に移行する細胞の能力を用いて3次元空間を介して細胞運動性を測定したマイクロピラーアレイを使用しています。 Polydimethlysiloxane（PDMS）エラストマーは、精密金型の上に硬化させ、オゾンで処理し、フィブロネクチンは、均質で非分解性微小環境を生成します。 アレイ 4 を入力する細胞の能力を測定するために、必要に応じてマイクロピラーの間隔も変化させることができます。金型は、高アスペクト比のアレイ 13の負のバージョンを作成するために、シリコンウエハの深い反応性イオンエッチングを使用して作成されます。アッセイは、そのカスタマイズによって強化されている間、移動細胞の直接可視化を介して三次元の移行、および分析をモデル化する能力は、マイクロピラーのアレイを作成する際の難しさは、経済的にその普及を妨げます。
このプロトコルで説明最適化されたスクラッチアッセイは、効率的な、COSを提供自由に利用可能なソフトウェアを用いて分析することができる一貫した傷を製造するためのT-有効な方法。代わりに、細胞移動の前後にスクラッチを介して行われる単純な幅の測定、ソフトウェアは、移行前と後の合計スクラッチ領域を決定することを可能にします。この進歩は、傷が幅測定が行われるべき場所を決定しようとしているの発行を制限し、傷の幅はそれの長さに沿って均一であるかどうか。また、細胞数、細胞の種類と合流し、細胞にダメージの程度の注意深い最適化がさらに分析を最適化するために議論されています。
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Protocol
注：この研究では、遠位の肺組織からの肺の間葉系幹細胞（LR-MSCを）を単離のいずれかの細胞表面マーカーの発現（CD45の陰性 、CD31のNEG、SCA-1高 、のEpCAM NEG）14,15に基づいて、使用していましたアウト・成長16植片、または酵素消化17を使用 。接着LR-MSCは、高グルコース無グルタミン、15％FBS、1×抗生物質/抗真菌剤、および2mMグルタミン（以下、完全培地）を含むDMEM中で培養し、37℃、5％CO 2でインキュベートしました。 LR-MSCは移動アッセイのために、比較的均一な増殖特性を有する細胞の集団を確保するために3~4回継代しました。
コンフルエント単層の準備1
- 標準の100mm培養皿からMSCを取り外すには、37℃で予め温めておいた10mlのPBSで細胞を洗浄、PBSを吸引し、トリプシンの4ミリリットル（0.25％）を追加します。 37℃のインキュベーター中で3-5分間インキュベート。 Cを吸引5分がダウン細胞ペレットにするための円錐管にellsは、300gで完全なメディアや遠心分離機の同等のボリュームを追加します。
注：トリプシンでのより長いインキュベーションは、細胞表面受容体を変化させ、潜在的に移行に影響を与えることができます。 - 培地を吸引し、新鮮な完全培地中に再懸濁細胞。トリパンブルー排除を用いて死細胞を除くと60ミリメートルの細胞培養皿上の完全培地4mlの500,000間葉系幹細胞をプレート、細胞をカウントします。
注：細胞の供給源に依存して、テストが必要な細胞の最適な数を決定する必要があるかもしれません。 - プレートは、最適な細胞の付着および増殖のための90％コンフルエント、MSCのために通常48〜72時間になるまで細胞をインキュベートします。
注：多くの足場依存性細胞は、その遊走能を変更することができる接触阻害を経験するので、100％のコンフルエンスは、推奨されません。画像解析ソフトウェアは、ギャップを解釈するので、80％未満のコンフルエンスでプレートを使用できない写真になりますスクラッチの周囲の一部として、細胞間のS（ 図1Dを参照してください ）。 - 細胞が90％コンフルエンスに達した後は、アプリケーションに応じて細胞を損傷。可溶性タバコの煙抽出物（CSE）への曝露後の細胞損傷を評価するために、2分18以上の吸引ビン内の完全培地25ミリリットル1〜ケンタッキー大学の研究タバコ（3R4F）から煙を描画することにより、100％のCSEを生成します。
- 完全培地中で希釈した4ミリリットル1〜4％のCSEで24時間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、4ミリリットル新鮮な完全培地と交換する前に、暖かい滅菌PBS 4mlで細胞を2回洗浄します。
注：タバコ煙抽出物の高濃度の損なう細胞（> 5％）は、実質的に合流を低減することができます。
2.スクラッチの作成
- 無菌環境では、損傷したMSCの60ミリメートルプレートからふたを削除し、ストレートエッジを築く（例えば滅菌済みプラスチック定規）交流ロスプレートの上部リム。メディアを削除せずに、約5mm離れてプレート全体で1個から4個の並列傷や長い50ミリメートルを作るために、無菌のストレートエッジによって導かれた無菌の200μlのピペットチップを使用しています。
注意：ストレートエッジは、顕微鏡のステージ上にあるときプレートに必要な回転の調整の量を最小限に抑えることができます。それは傷が画面上に完全に垂直（または水平）表示されることが不可欠です。 60 mmのプレートに複数の傷を生成する細胞移動を（データは示していない）に影響を与えるように微小環境を変化させないが、他の細胞タイプを考慮してもよいです。ウェルの縁の近くに増殖する細胞の変動がより顕著になり、傷の均一な世代に影響を与える可能性があるため、より小さい井戸の使用が推奨されていません。 - 培地を吸引し、穏やかに傷の中心に付着する細胞を防ぐために、予め温めた完全培地2mlでプレートを洗浄し、細胞を除去するためにスクラッチによって緩めてきたの。新鮮な完全培地4mlで交換してください。
- 無菌の永久的なマーカーを使用して、傷を画像化すると干渉しない位置でプレートの下に1-4からの各スクラッチラベルを付けます。
注：スクラッチ幅にばらつきがある場合もありますので、それは、同じスクラッチからの画像が前と移行後に比較することが重要です。
3.スクラッチの初期画像を撮影
注：スクラッチアッセイは複数のプレート上で実行されている場合、それは傷が次のプレートの上に作られています前に、単一のプレート上のすべての傷の初期画像が取られることをお勧めします。
- 分析に必要な画像を生成するカメラで倒立位相差顕微鏡を使用します。
- 顕微鏡上で培養プレートを置き、スクラッチ＃1を見つけるために、低消費電力の目標（10倍）を使用します。培養プレートの蓋に結露が明確IMAGを妨害した場合細胞のeは、37℃に加熱されたステージセットを使用します。
- 完全に水平方向と視野の中心にスクラッチを維持、傷の長さの90％を包含することを必要な限り多くの画像を得ます。画像間の重複がないとスクラッチの異なる部分の画像を取得します。
注：培養皿の縁で光の屈折が分析するためにそれらを不可能に、画像をoverexposes。そのため、傷の長さの最初と最後の5％から画像を取ることはありません。 - 別のフォルダに各一から画像を保存します。
- 繰り返し傷2、3のための3.2から3.4、および手順4。
- すぐに最初の画像の後にインキュベーターにプレートを返します。細胞は4-7時間に移行しましょう。
注意：CSEで損傷したMSCを評価する際に7時間が最適です。細胞増殖は、細胞移動のための交絡変数として作用することができるので、より大きく7時間細胞をインキュベートする（オプション注以下の8.2を参照）が推奨されていません。
- ImageJのをダウンロードして、創傷治癒ツールプラグインをインストール（材料/機器の表を参照）。
- ImageJの中の画像ファイルを開き、「プロセス」をクリックして、スクラッチ領域（ 図2B）を計算するためにツールを創傷治癒のためのスクラッチを周囲の細胞を強調するために「エッジを探します」。次に、「画像」、「調整」「カラーしきい値」と「しきい値の色」と表示されたドロップダウンメニューで値を変更する]をクリックし、「白黒」を
- 傷やセル前面との間の最適なコントラストが達成されるまで、「カラーしきい値」メニュー内では、両方の明るさしきい値スライダを調整します。画像のコントラストを作成しようとしたとき、最大の範囲を可能に右（完全に黒画像）に完全に底のスライダを移動し、最大コントラストを生成するためにトップのスライダーを調整します。
- ゆっくりとトップBRIを調整画像がきれいにスクラッチ（ 図2C）の輪郭が表示されるまで、左から右にghtnessスライダー。スクラッチのエッジが識別されると、スクラッチ領域を強調するために（つまり、ImageJのツールバーに表示されます）、ImageJのツールバーの「その他のツール」をクリックし、ドロップダウンメニューから「MRI_Wound_Healing_Tool」を選択し、「M」ボタンを押してくださいそして、出力結果ポップアウトウィンドウ （図2D）で計算されたエリア。
- コピーし、Excelスプレッドシートに結果画面（ 図2E）からすべての数字を貼り付けます。個々の傷からデータを分離することを確認します。
5.スクラッチの最終画像を撮影
- 細胞は（4-7時間）に移行した後、繰り返しは3.2から3.4を繰り返します。画像各プレート上の細胞が移動に等しい時間があったように、彼らは傷されたのと同じ順序でプレート。
注：細胞は、センシに応じて、複数の時点で撮像することができます両方の温度およびpH変化にtivity。また、ライブセルイメージングは、彼らが移行するとリアルタイムで細胞を追跡するために使用することができます。
6.最終的なスクラッチ画像の解析
- 繰り返し、最終的なスクラッチ画像の4.2から4.5を繰り返します。
7.移行を定量化するためのスクラッチ領域を計算します
- それぞれの傷の初期面積値を平均することにより平均移行前の面積を計算します。
- 平均移行前のエリア（ステップ7.1）から、ステップ6で算出された各画像のための最終的な移行領域を減算することによって、移行の合計金額を計算します。移行の変化を表す各スクラッチの値のリストを生成します。
- プール同じ試験群（ すなわち、全てのプレートと0％CSEに曝露された細胞上のすべての傷）内に複数の傷からのデータ。実験群間の差を分析するために分散テストの分析を使用してください。
- 細胞は移行遅い場合及び（10-12時間よりも大きい）をスクラッチした後に、より長いインキュベーション時間を必要とし、細胞が遊走アッセイが発生している期間中に増殖を受けているかどうかを決定するのBrDUまたはEDU取り込みアッセイ19を実行します 。有意な細胞増殖を避けるために、遊走アッセイ時間を選択してください。
8.オプション
- 有意な細胞老化は、スクラッチの手順の結果として発生しているかどうかを評価するために、19に傷をつけた後、所定の時間に試験板の老化関連β-ガラクトシダーゼアッセイを行います。
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Representative Results
ここで提示スクラッチアッセイは、マウスの肺常駐間葉系間質細胞（LR-MSCS）を使用して実施し、プロトコル・ノートで参照として単離しました。 LR-MSCは、60 mmの組織培養皿中の500,000個の細胞の密度で播種し、48時間で90％コンフルエンスまで増殖させました。損傷を生成するために、4％のCSEは、（上述の）初期播種期間後24時間が、スクラッチアッセイの前に細胞とともにインキュベートしました。各アッセイのために、傷を200μlのピペットチップを使用して生成されました。傷が生成された後の初期の画像が撮影された、と緩んで細胞や破片は、完全培地で洗い流されていました。 図1AおよびBに示すように、適切な合流は、イメージングソフトウェアが正常に傷の境界を識別できるようにすることが重要です。 図1Cに示されるように、細胞は、（いずれかのために不十分な播種密度の、不十分なINC十分にコンフルエントでありません簡単にイメージングソフトウェア（ 図1D）で区別されていない異種の境界を有する傷をもたらすことができるubation回、または過度の損傷）、。 図2は 、画像取得と分析を示している。 図2Aは、分析の前に、元の画像を示している。 図2Bショー 「プロセス」メニューの「エッジの検索」ツールの結果は（ステップ4.2）および図2Cは、「カラーしきい値」スライドバー（ステップ4.3）の調整後の画像を示している。 図2Dは MRI_Wound_Healing_Toolを実行した後、最終的な分析の画像を示していますプラグイン（ステップ4.4）。 図2Eは、結果ポップアウトウィンドウ、ハイライト（赤箱）が生成されている数字を示しています。代表的な前後移動画像イメージングソフトウェアによって定義されたスクラッチ領域の境界に対応して、 図3に示されている。 図4グラムraphically 4％CSEと損傷後LR-MSCの中に見られる変化した移動能力を示しています。 0％CSEまたは4％のいずれかへの曝露と95％のコンフルエンスのいずれか前または移行後にLR-MSCのプレート全体に作られた4傷、のそれぞれについて、 図4Aおよび B、（ピクセル単位）平均計算し、スクラッチ領域でCSEが比較される。 図4Cは、（以下の移行を実証し、スクラッチ領域における低い平均変化が0％または4％CSEのいずれかにさらさLR-MSCの中のスクラッチ領域（移行前のエリアから減算移行後の面積）で算出した平均変化を比較）4％CSEに暴露した後。
図1：正しい合流は、堅牢な再現性のスクラッチアッセイの世代のために重要です。 （A）マウスのLR-MSCの95％コンフルエンスで、SCRのための適切なatching。 （B）95％コンフルエンスに成功スクラッチ。成功のためのスクラッチ（C）LR-MSCの70％コンフルエンスでは、低すぎます。 70％コンフルエンスで（D）画像取得が偽の境界を生成することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：画像収集と分析（A）オリジナル画像を実証する代表的な画像 。 （B）「プロセス」メニュー（ステップ4.2）の下で、「エッジの検索」ツールを適用した後の画像。 （C）「カラーしきい値」スライドバー（ステップ4.3）の写真次の調整。 （D）MRI_Wound_Healing_Toolプラグイン（ステップ4.4）を実行した後の画像。 （E）Resultsはポップアップウィンドウの強調表示（赤箱）エリアごとに生成される番号を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：傷LR-MSCを比較スクラッチアッセイからの代表的な画像前と移行後の（A）代表、元の画像前の移行。。 （B）を算出スクラッチ領域の概要事前マイグレーション。 （C）代表、元の画像移行後。 （D）を算出スクラッチ領域移行後の概要。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
<IMGのALT = "図4" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
図4：スクラッチLR-MSCの移行前後のスクラッチ領域の定量化を比較分析し、0％または4％のCSEのいずれかへの曝露から代表的な結果 。提示されたデータと0％CSEへの曝露と95％のコンフルエンスのいずれか前または移行後にLR-MSCのプレートを介して行われる4傷のそれぞれについて、（A）（ピクセル単位）平均計算されたスクラッチ領域のグラフィカルな表現で、平均値及び標準偏差。提示されたデータと4％のCSEへの曝露と95％のコンフルエンスのいずれか前または移行後にLR-MSCのプレートを介して行われる4傷のそれぞれについて、（B）（ピクセル単位）平均計算されたスクラッチ領域のグラフィカルな表現で、平均値及び標準偏差。どちらかが0％または4％CSEにさらさLR-MSCの中のスクラッチ領域（ポスト事前マイグレーション）で算出した平均変化（C）比較、少ない移行を実証する（SCRの低い平均変化平均と標準偏差として提示されたデータと4％CSEにさらした後のATCHエリア）、* P = 2.99×10 -8。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、スクラッチアッセイを実施し、分析するための定量的堅牢な、標準化された方法を提供します。単純なスクラッチアッセイは日常的に細胞の遊走を調べるために、研究のさまざまな分野で使用されています。しかし、伝統的にスクラッチアッセイは再現7,10の問題につながっている、標準化されたセットアップと定量化プロトコルを欠いていました。スクラッチアッセイを改善するための改変および最適化の多くは、個々の生細胞画像化、標準化されたストッパーに基づくアッセイ、および三次元マイクロピラーアッセイ4,8,10を含む、これらの問題が、減少しています。しかしながら、これらのアッセイは、カスタマイズまたは10を適合させることが困難であることができ、いくつかの用途のために、これらの技術はまた、法外な費用がかかることができます。
標準化されたスクラッチアッセイプロトコルを生成するために、細胞のinvolに関する特定の情報を必要とし、ここで提示したプロトコルのいくつかの重要なステップがありますVED、およびアッセイの最適化は、関連する細胞の特性に基づいて。特に、（工程1.3および1.4ステップ）アッセイの90-100％コンフルエンスに均一な単層を達成するために必要な細胞の数と必要な培養時間を最適化することが重要です。あまりにも少数の細胞（90％未満のコンフルエント）で、細胞が十分な単層を形成しません。この細胞の微小環境に影響を与えますが、それはまた、正確に傷のエッジを識別するためのイメージングソフトウェアの能力に影響を与えるだけでなく。これとは対照的に、単層中の細胞数が多すぎる（100％コンフルエント、または積み重ねられた細胞）を十分に接触阻害が生じ、したがって、細胞の移動特性を変更することがあります。スクラッチアッセイプロトコールの一部のバリエーションは100％コンフルエンスまで細胞増殖をお勧めしますし、そのようなMSCの8などの特定の接触感受性細胞については、この潜在的な制限を考慮していません。同じ問題はinfliある損傷の程度に適用されるべきです細胞（ステップ1.5）にCTED。ここで説明するプロトコルは、移動能力のMSCを上の可溶性タバコの煙への曝露による損傷後の細胞遊走の変化を評価するために設計されているが、このアッセイは、細胞遊走の損傷の多くの異なる種類の効果を評価するのにも同様に有用であり得ます。これは、被災のダメージは、実験群と対照群の間に統計的な区別を提供するのに十分であることが重要です。しかし、あまりにも多くのダメージも再び正しく傷のエッジを識別するためのイメージングソフトウェアの能力に影響を与える可能性が低下し、細胞集密度をもたらすことができます。
両細胞の老化や細胞増殖が誤ってスクラッチアッセイの結果を変えることができる交絡因子であることができます。具体的には、スクラッチの発生を慎重老化になる可能性があり、周囲の細胞に過度の損傷を避けるために考慮されるべきです。皮下組織ではなく、プラスチックピペットチップでスクラッチまた、移行ゾーンと細胞外マトリックス（ステップ2.1）で培養プレート表面の完全性を維持しながら、IC針やメスは、過剰な損傷を避けることができます。また、細胞遊走が起こることが許容される時間の長さを慎重に交絡変数（ステップ3.7）のような重要な細胞増殖を回避するために考慮しなければなりません。 CSEで損傷した細胞を評価する場合、LR-MSCの移行の分析のために、7時間が最適です。一般的に推奨されていないより大きい12時間細胞をインキュベートするが、これは、すべての細胞型に非常に低い倍加率で特にが適用されない場合があります。細胞の老化および細胞増殖の両方を評価するために、老化関連β-ガラクトシダーゼとのBrDU取り込みまたはEDUの組み合わせは、19アッセイの終了時に、細胞に対して行うことができます。重要なのは、ここで説明するプロトコルは、位相差顕微鏡とカメラを反転だけ良い品質を必要とする、限られた技術的能力を持つラボにアクセス可能です。ザ・試薬は安価であり、画像処理ソフトウェアはオープンソースです。しかし、良好な再現性と厳密な統計分析を実行する能力を含むこの分析から最適な結果を確保するために、慎重な最適化が試みられているそれぞれの新しい細胞型または実験被害シナリオを検討すべきです。
最適化は、このプロトコルアドレスにスクラッチアッセイを標準化するために行わ前作に存在する制限の一部を発表しました。スクラッチアッセイプロトコルは、伝統的にスクラッチ8,9のスナップショットからスクラッチ幅測定を行うのに対し、ここで紹介するプロトコルは、統計的な厳密さを高めるための幅に考慮の矛盾に取るためにスクラッチの全長に沿って撮影した画像から面積の測定を使用しています初期傷。反復試験（データは示さず）に基づいて、傷の幅は、その長さ全体で完全に一致していると仮定することはできません。目の移行後、エッジEスクラッチは、それがますます困難に正確にスクラッチ幅を計算し、さらに面積計算を必要とすること、より不均一になります。このプロトコルは、主観を減少させ、スクラッチ領域を分析する際に一貫性を高めるために、MRI_Wound_Healing_Tool、専門のコンピュータプログラムを使用します。それは簡単な幅の計算が原因で前CSEまたはその他の損傷への移行の微妙な違いを区別するのに十分な具体的な結果をもたらすことができるかどうかは不明であるが、このプロトコルは、この感度を示しています。このプロトコルで提示最適化は、カスタマイズのためのオプションを提供するために、感度を発揮し、結果を確認するために、その他の技術を提供するために、経済的に実現可能な方法で、これらの制限に対処するために、共通のスクラッチアッセイを刷新します。
このプロトコールに記載され最適化された定量的なスクラッチアッセイは依然として細胞集団ではなく、個々のセルを考慮することによって制限されます。この手法assum細胞集団は、比較的均質であり、これは、比較的均一な移動特性をもたらすことことES。アプリケーションに応じて、個々の細胞の代わりに8の移動を検討するより適切であり得ます。また、ここで説明するスクラッチアッセイプロトコールは、4-7時間かけて移動の分析を混乱させるために十分迅速に増殖しません細胞の集団に依存しています。この短い時間の間に広範囲に増殖することが細胞株は、この技術を用いて分析するには適していません。これらの制限にもかかわらず、この定量スクラッチアッセイプロトコルは、多くの異なる用途に使用するための可能性を有します。例えば、細胞障害ベースのアッセイは、最適化され、その後、細胞の損傷を制限するために、特定の治療の能力を評価するために使用されるかもしれません。あるいは、このアッセイは、O、遊走能、したがって転移の可能性を制限する可能性のある治療法を評価するために、癌細胞株と一緒に使用されるかもしれませんこれらの細胞のF。この最適化されたスクラッチアッセイはまた、まだ傷を生成する際に避けられない細胞微小環境への可能な外乱によって制限されます。しかし、注意深く細胞コンフルエンスのレベルを選択することにより、アポトーシスを増加し、部分的に傷の端で分離した細胞シートの生成を回避することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
